劉景喜,張進，蘆娜，李愛琴，彭傳文，郝東升，周娟，陳龍賓，劉壯

(1. 天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2. 天津市乳品食品監(jiān)測中心，天津 300210；3. 天津嘉立荷牧業(yè)集團有限公司，天津 300404)

原料奶質(zhì)量直接影響乳品質(zhì)，只有優(yōu)質(zhì)的原料奶才能生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的乳制品。體細胞數(shù)和細菌總數(shù)是衡量奶牛健康狀況和原料奶質(zhì)量的關鍵指標。奶牛養(yǎng)殖、擠奶及牛奶儲運等環(huán)節(jié)一旦處理不當，會使牛奶體細胞數(shù)和細菌總數(shù)增多，導致牛奶成分、風味、色澤和形態(tài)發(fā)生變化，乳制品品質(zhì)下降，嚴重時還會失去食用價值。

乳房炎是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的常見疾病之一，全世界約有1/3的奶?；加懈鞣N類型的乳房炎[1]。乳房炎是奶牛乳房受到物理、化學、生物等因素刺激所引起的一種反應，不僅影響牛奶質(zhì)量，還會潛在影響人類健康，甚至給養(yǎng)殖業(yè)和奶業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[2]。乳房炎分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎。臨床型乳房炎表現(xiàn)為乳房紅、腫、熱、痛，主要由獸醫(yī)進行診斷。隱性乳房炎由乳房持續(xù)感染引起，通常沒有臨床癥狀，持續(xù)時間長，對乳腺組織影響大，偶爾可發(fā)展成臨床型乳房炎[3]。

為調(diào)查天津市原料奶細菌總數(shù)、體細胞數(shù)以及乳房炎病原菌和耐藥基因，提高原料奶質(zhì)量，本試驗就來自全市的部分原料奶樣品和臨床型乳房炎奶樣進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

1.1.1 原料奶樣品

(1)全年采集4次樣品，每季度采集40批次原料奶，共采集160個樣品，所有樣品來自天津市5家乳品加工企業(yè)的奶罐車，用于檢測體細胞數(shù)和菌落總數(shù)。

(2)全年采集4次樣品，每季度對30個奶牛場采集30批次儲奶罐原料奶樣品，共采集120個樣品，覆蓋天津市主要奶牛養(yǎng)殖區(qū)域，用于檢測體細胞數(shù)。

1.1.2 乳房炎牛奶樣品

采集來自寧河區(qū)、寶坻區(qū)、濱海新區(qū)、武清區(qū)的4個奶牛場臨床型乳房炎發(fā)病乳區(qū)的牛奶樣品38個，用于檢測乳房炎病原菌和耐藥基因。

1.2 采樣方法

1.2.1 大缸奶樣采集方法

采樣前開動機械式攪拌裝置至少5 min，對于沒有機械攪拌設備的儲奶罐(運輸車)，采樣前先用人工攪拌器彈入罐底，采取由下至上的方式攪拌30次以上。樣品充分混勻后，用液態(tài)乳漏斗從表面、中部、底部3點采樣，每個點采集1 L，將3點采集的樣品混合至4 L塑料容器內(nèi)，充分混合均勻后，用采樣瓶分裝3份，每份不少于150 mL。采樣在無菌條件下進行[4]。

1.2.2 乳房炎奶樣采集方法

先用溫水清洗乳房，擦干后用浸有消毒液(0.2%新潔爾滅溶液)的濕毛巾擦拭乳房，待皮膚干燥后再以75%酒精棉消毒乳頭口及其周圍。清洗消毒后，每個乳頭擠出的前三把奶棄掉，以排除一些污染的雜菌，然后無菌操作，將各個乳區(qū)分開，每個乳區(qū)再擠10 mL乳汁裝入滅菌試管，封蓋，標上牛號、乳區(qū)及日期。樣品采集后，置于4℃冰箱冷藏保存，盡快送實驗室檢測[3]。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 體細胞數(shù)檢測方法

參照生鮮牛乳中體細胞測定方法NY/T800-2004。

1.3.2 細菌總數(shù)檢測方法

參照食品微生物菌落總數(shù)的測定GB4789.2-2016。

1.3.3 乳房炎病原菌及耐藥基因檢測

病原菌：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、無乳鏈球菌、牛棒狀桿菌、停乳鏈球菌、牛支原體、鼠傷寒沙門菌、肺炎克雷伯菌、化膿鏈球菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、白色念球菌。

耐藥基因：耐甲氧西林葡萄球菌耐藥基因mecA、β-內(nèi)酰胺耐藥基因CTX-M9。

檢測方法：利用恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀配套微流控碟式芯片、奶牛乳房炎核酸快速提取試劑盒以及奶牛乳房炎恒溫擴增檢測試劑盒，針對14種病原菌和2種耐藥基因進行DNA檢測。

檢測步驟如下：①樣本制備：使用奶牛乳房炎核酸快速提取試劑對樣本核酸進行提取，時間約1.5 h；②反應體系制備：提取完的樣本核酸與奶牛乳房炎恒溫擴增試劑按比例混合后加樣到微流控碟式芯片并做好加樣孔密封，時間約5 min；③儀器檢測，結果判讀：加樣的芯片離心后載入恒溫擴增儀，實時跟蹤檢測數(shù)據(jù)，軟件自動判讀檢測結果。

2 結果與分析

2.1 乳品加工企業(yè)原料奶體細胞數(shù)及細菌總數(shù)

由表1可知，2018年天津市乳品加工企業(yè)原料奶體細胞數(shù)平均值為44.65萬/mL，標準差42.41萬/mL，變異系數(shù)94.97%，最大值為225.50萬/mL，最小值為1.20萬/mL，SCC≤50萬/mL的樣品占74.37%，50200萬/mL的樣品占3.13%。

由表2可知，2018年天津市乳品加工企業(yè)原料奶細菌總數(shù)平均值11.54萬CFU/mL，標準差26.28萬CFU/mL，變異系數(shù)227.66%，最大值190.00萬CFU/mL，最小值0.095萬CFU/mL，細菌總數(shù)≤10萬CFU/mL的樣品占74.37%，10萬CFU/mL<細菌總數(shù)≤50萬CFU/mL的樣品占21.25%，50萬CFU/mL<細菌總數(shù)≤100萬CFU/mL的樣品占1.88%，100萬CFU/mL<細菌總數(shù)≤200萬CFU/mL的樣品占2.50%。

表1 2018年天津市乳品加工企業(yè)原料奶體細胞數(shù)

項目平均值(萬/mL)44.65標準差(萬/mL)42.41變異系數(shù)(%)94.97最大值(萬/mL)225.50最小值(萬/mL)1.20SCC≤50萬/mL所占比例(%)74.3750萬/mL200萬/mL所占比例(%)3.13

表2 2018年天津市乳品加工企業(yè)原料奶細菌總數(shù)

項目平均值(萬CFU/mL)11.54標準差(萬CFU/mL)26.28變異系數(shù)(%)227.66最大值(萬CFU/mL)190.00最小值(萬CFU/mL)0.095細菌總數(shù)≤10萬CFU/mL所占比例(%)74.3710萬CFU/mL<細菌總數(shù)≤50萬CFU/mL所占比例(%)21.2550萬CFU/mL<細菌總數(shù)≤100萬CFU/mL所占比例(%)1.88100萬CFU/mL<細菌總數(shù)≤200萬CFU/mL所占比例(%)2.50

2.2 奶牛養(yǎng)殖場原料奶體細胞數(shù)

由表3可知，2018年天津市奶牛養(yǎng)殖場原料奶體細胞數(shù)平均值為38.81萬/mL，標準差36.49萬/mL，變異系數(shù)94.03%，最大值為210.00萬/mL，最小值為0.80萬/mL，SCC≤50萬/mL的樣品占79.17%，50200萬/mL的樣品占0.83%。

表3 2018年天津市奶牛養(yǎng)殖場原料奶體細胞數(shù)

項目平均值(萬/mL)38.81標準差(萬/mL)36.49變異系數(shù)(%)94.03最大值(萬/mL)210.00最小值(萬/mL)0.80SCC≤50萬/mL所占比例(%)79.1750萬/mL200萬/mL所占比例(%)0.83

2.3 臨床型乳房炎牛奶樣品病原菌、耐藥基因檢測

2018年天津市臨床型乳房炎牛奶樣品病原菌、耐藥基因整體檢測時。共采集38個乳房炎乳區(qū)的牛奶樣品，其中36個樣品檢出病原菌，檢出率為94.74%，共檢出8種病原菌；14個樣品檢出耐藥基因，檢出率為36.84%，共檢出2種耐藥基因。見表4。

表4 2018年天津市臨床型乳房炎牛奶樣品病原菌、耐藥基因整體檢出情況

項目樣品總數(shù)(個)38病原菌檢出樣品數(shù)(個)36病原菌檢出率(%)94.74病原菌檢出種類(種)8耐藥基因檢出樣品數(shù)(個)14耐藥基因檢出率(%)36.84耐藥基因檢出種類(種)2

由表5可知檢出率最高的病原菌是乳房鏈球菌，檢出率為73.68%，其他病原菌檢出率依次為：牛支原體34.21%，牛棒狀桿菌13.16%，無乳鏈球菌10.53%，大腸桿菌5.26%，白色念球菌5.26%，停乳鏈球菌2.63%，銅綠假單胞菌2.63%。2種耐藥基因的檢出率分別為β-內(nèi)酰胺耐藥基因CTX-M9 34.21%，耐甲氧西林葡萄球菌耐藥基因mecA2.63%。

表5 2018年天津市臨床型乳房炎牛奶樣品各病原菌及耐藥基因檢出情況

項目檢出率(%)病原菌金黃色葡萄球菌0表皮葡萄球菌0大腸桿菌5.26乳房鏈球菌73.68無乳鏈球菌10.53牛棒狀桿菌13.16停乳鏈球菌2.63牛支原體34.21鼠傷寒沙門氏菌0肺炎克雷伯氏菌0釀膿鏈球菌0銅綠假單胞菌2.63奇異變形桿菌0白色念球菌5.26

3 討論

3.1 2018年天津市原料奶體細胞數(shù)和細菌總數(shù)

體細胞數(shù)(SCC)是指每毫升牛奶中體細胞總數(shù)，主要包括白細胞和乳腺上皮細胞，能夠反映牛奶產(chǎn)量、牛奶質(zhì)量及奶牛的健康狀況[5]。健康奶牛的SCC為5萬/mL，正常范圍為0.5-20萬/mL，美國農(nóng)業(yè)部規(guī)定，生鮮乳SCC必須小于75萬/mL，歐盟、新西蘭和澳大利亞規(guī)定的標準為小于40萬/mL[6]。此次調(diào)研發(fā)現(xiàn)，2018年天津市乳品加工企業(yè)原料奶SCC平均值為44.65萬/mL，介于美國和歐盟標準之間；養(yǎng)殖場原料奶SCC平均值為38.81萬/mL，符合歐盟標準。此外，乳品加工企業(yè)原料奶SCC≤50萬/mL的樣品占74.37%，SCC>200萬/mL的樣品占3.13%；奶牛養(yǎng)殖場原料奶SCC≤50萬/mL的樣品占79.17%，SCC>200萬/mL的樣品占0.83%。無論是乳企還是養(yǎng)殖場，均存在SCC變異系數(shù)較大的問題，說明不同奶牛場的管理水平和奶牛健康狀況差異較大，部分奶牛場還需要提高養(yǎng)殖技術和生產(chǎn)管理水平，加強對奶牛乳房炎的控制，降低原料奶的體細胞數(shù)，以提高天津市整體的原料奶質(zhì)量。

原料奶的菌落總數(shù)是代表原料奶質(zhì)量的直接指標，美國規(guī)定的原料奶細菌總數(shù)為A級≤10萬CFU/mL，加拿大≤20萬CFU/mL，歐盟≤10萬CFU/mL，澳大利亞≤20萬CFU/mL[7]。而我國規(guī)定的原料奶細菌總數(shù)為小于200萬CFU/mL。在本次調(diào)研中，所有樣品的菌落總數(shù)均符合現(xiàn)行國家標準。本市平均水平為11.54萬CFU/mL，細菌總數(shù)≤10萬CFU/mL的占74.38%，說明這些原料奶的細菌總數(shù)已經(jīng)達到歐盟及美國A級水平。而細菌總數(shù)>50萬CFU/mL的樣品占4.38%，這些原料奶質(zhì)量有待進一步提升。此外，此次調(diào)研的原料奶細菌總數(shù)存在波動范圍、變異系數(shù)較大的問題，這可能是不同養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)管理水平差異較大造成的。

3.2 2018年天津市奶牛乳房炎病原菌及耐藥基因

奶牛乳房炎發(fā)病原因較為復雜，受多種因素相互影響，包括病原微生物、地理位置、季節(jié)、奶牛年齡和胎次、牛場環(huán)境、飼養(yǎng)管理、奶牛自身免疫力、遺傳因素、藥物因素等[8]。

微生物入侵乳腺組織是引起乳房炎的重要原因[9]。引起乳房炎的致病菌共有80多種，大致可分為接觸性和環(huán)境性病原微生物。接觸性病原微生物，包括金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和支原體，這類微生物定植于乳腺并通過擠奶工擠奶或擠奶機傳播。環(huán)境性病原微生物，包括大腸桿菌、牛棒狀桿菌、乳房鏈球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌、假單胞菌、酵母菌、真菌等[2,10]。袁永隆等[11]對我國23個省、市、自治區(qū)30個城市的40所奶牛場進行流行病學調(diào)查的同時，采集3006份奶樣進行細菌學檢查，結果發(fā)現(xiàn)，與乳房炎有密切關系的病原菌共12種2060株，病原檢出率為62.52%，主要為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和乳房鏈球菌等。

在本研究中，接觸性病原微生物檢出3種，為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和牛支原體。無乳鏈球菌作為專性乳腺寄生菌，被認為是高度接觸傳染性乳房炎病原體，擠奶時很容易在奶牛之間傳播，其引起的乳房炎，大多為亞臨床感染，偶爾有急性暴發(fā)，并不引起明顯的膿腫或纖維化，但可以導致感染腺體的慢性感染，從而長期地減少產(chǎn)奶量[12]，該菌可通過規(guī)范擠奶衛(wèi)生和乳頭消毒避免[13]。停乳鏈球菌主要在干奶期感染乳房，可引發(fā)明顯的臨床癥狀，如乳區(qū)腫脹、異常乳等[12]，此外，還導 致奶牛食欲不振、發(fā)熱[13]。牛支原體是支原體型奶牛乳房炎重要的病原體，具有較強的傳染性，可通過擠奶、呼吸和配種等多個途徑傳播，通常只感染一側乳區(qū)，且不易被發(fā)現(xiàn)[13]。檢出這3種病原菌表明奶牛場可能在擠奶操作、干奶程序以及配種操作方面存在問題，需進一步加強這些方面的精細化管理，以降低因無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和牛支原體引起的乳房炎。由于牛支原體引起的乳房炎病程長，且傳染性較強，建議盡早淘汰。

環(huán)境性病原微生物共檢出4種，包括大腸桿菌、牛棒狀桿菌、乳房鏈球菌、銅綠假單胞菌。大腸桿菌進入乳區(qū)后可導致奶牛發(fā)生臨床型乳房炎，表現(xiàn)為乳區(qū)溫熱、腫脹、疼痛、捏粉樣或水腫或堅實等癥狀[10]。牛棒狀桿菌是多形桿菌，廣泛存在于自然界，其定殖在乳頭皮膚和乳頭管內(nèi)，可引起乳汁中體細胞數(shù)升高，僅引起輕度乳房炎[10]。乳房鏈球菌是干奶期感染的最常見病原，是臨床型奶牛乳房炎的重要誘因之一[13]。銅綠假單胞菌廣泛存在于土壤和污染的水、空氣中，本病的發(fā)生主要與環(huán)境衛(wèi)生差及管理不當有關[14]。這幾種病原菌尤其是乳房鏈球菌的檢出，提示這些奶牛場存在飼養(yǎng)管理不當和環(huán)境衛(wèi)生不佳等情況，要加強飼養(yǎng)管理、環(huán)境消毒及干奶管理。

β-內(nèi)酰胺類抗生素指化學結構中具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素，包括青霉素、頭孢菌素、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑等[15]?？股丿煼ㄊ悄壳皣鴥?nèi)外治療細菌性奶牛乳房炎的常用方法，而青霉素則常用于治療鏈球菌引發(fā)的乳房炎[16]。在本研究中，β-內(nèi)酰胺耐藥基因CTX-M9的檢出率較高，為34.21%，而檢出率最高的病原菌為乳房鏈球菌，這可能是由于本市鏈球菌引起的乳房炎發(fā)病率較高，并且普遍采用β-內(nèi)酰胺類抗生素治療乳房炎，導致奶牛產(chǎn)生耐藥性，從而提高了該基因的檢出率。

4 結論

2018年天津市原料奶SCC及細菌總數(shù)大部分接近歐盟標準，但仍有一些奶牛養(yǎng)殖場在精細管理方面有待進一步提高。引起天津地區(qū)臨床型乳房炎的3種主要病原菌為乳房鏈球菌、牛支原體、牛棒狀桿菌。β-內(nèi)酰胺耐藥基因CTX-M9的檢出率較高，與普遍采用β-內(nèi)酰胺類抗生素治療乳房炎，導致奶牛產(chǎn)生耐藥性有關。