周天勝，董軒，潘士鋒，劉宗平*，邢華*

(1. 揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009；2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；3. 蘇州藥明康德新藥開發(fā)有限公司，江蘇 蘇州 215104；4. 上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司，上海 200131)

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種系統(tǒng)性的自身免疫性疾病[1]，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，同時也給社會帶來極大的負擔，然而目前在臨床上仍缺少對這種慢性炎癥性疾病的根治性療法。以往研究表明，抑制白細胞介素1β的表達，可明顯改善大鼠RA臨床癥狀[2]，因此，IL-1β有可能成為治療RA的潛在靶點。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)生物學特性獨特，可參與多環(huán)節(jié)的免疫調(diào)節(jié)，具有促進組織損傷修復的作用[3-4]，因而被廣泛應用于免疫性疾病的細胞治療。本試驗利用Ⅱ型膠原蛋白誘導方法制備RA大鼠模型，初步探討IL-1β在RA等自身免疫病發(fā)病機制中的作用。然后對模型大鼠分別進行PBS，IL-1β-siRNA以及IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs協(xié)同治療，檢測大鼠形態(tài)學、行為學、組織病理學和免疫學等變化情況，綜合分析治療效果，為基因聯(lián)合細胞治療RA開辟了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

清潔級雌性Wistar大鼠(8-10周齡，200-250 g)由揚州大學比較醫(yī)學中心提供，試驗動物使用許可證號為SYXK(蘇)2017-0044。實驗過程中大鼠飼喂標準化商品鼠糧，飼養(yǎng)在常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境，溫度：(24±2)℃，濕度：(60±10)%。

1.1.2 主要試劑

雞Ⅱ型膠原蛋白、弗氏完全佐劑、DEPC、戊巴比妥鈉，來自Sigma公司；TRIZOL來自Invitrogen；EntransterTM-in vivo和siRNA來自Engreen Biosystem公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix ExTaqTM Ⅱ、大鼠IL-1β ELISA Kit，均購買于TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鼠關(guān)節(jié)炎模型的建立

將40只大鼠隨機分成正常對照組(n=10)和Ⅱ型膠原蛋白誘導關(guān)節(jié)炎(CIA)模型組(n=30)。初次免疫時，CIA模型組用含有雞Ⅱ型膠原蛋白的乳化液1 mL背部皮內(nèi)分點注射，正常對照組注射等量生理鹽水。初次免疫7 d后加強免疫一次，CIA模型組腹腔注射含有雞Ⅱ型膠原蛋白的乳化液0.5 mL，正常對照組注射等量生理鹽水。免疫后，每周測定一次動物體重以及足趾腫脹值。

1.2.2 行為學檢測

采用強迫游泳試驗檢測治療前后大鼠的行為學變化。強迫游泳試驗前將大鼠放入實驗室適應30 min，強迫游泳實驗的時間為白天3 h，夜間2 h。實驗前1 d，訓練大鼠，將其放入透明有機玻璃缸中-缸周圍用黑色有機玻璃隔離。大鼠在缸中游泳15 min，使其適應游泳環(huán)境；試驗時對大鼠在缸中游泳情況進行連續(xù)攝像6 min。試驗結(jié)束后觀察并記錄大鼠的累計不動時間(大鼠在水中停止掙扎呈漂浮狀態(tài)，或者僅有細小的肢體運動以保持頭部在水面下)和掙扎時間。

1.2.3 血清IL-1β濃度的檢測

分別于造模后和治療后第2周和第4周從眼眶后靜脈叢取血，并制備血清，使用ELISA試劑盒檢測血清IL-1β水平。

1.2.4 Foxp3和TGF-β1 mRNA表達的檢測

分別采集正常組和CIA模型組動物的脾臟組織，使用Trizol總RNA提取試劑盒提取總RNA，使用TaRaKa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量PCR檢測TGF-β1和Foxp3的mRNA表達，TGF-β1上游引物為5′-TGCTGCCGCTTCTGCTCCCACTC-3′，下游引物為5′-ATAGATTGCGTTGTTGCGGTCCAC-3′；Foxp3上游引物5′-GCTTGTTTGCTGTGCGGAGAC-3′，下游引物5′-ATAGATTGCGTTGTTGCGGTCCAC-3′；以β-actin作為內(nèi)參。移植治療2周和4周后對脾臟組織中Foxp3和TGF-β1表達檢測，步驟同上。

1.2.5 關(guān)節(jié)的組織病理學檢查

建模4周后，采集大鼠膝關(guān)節(jié)，固定于10%中性福爾馬林溶液中，經(jīng)脫鈣、取材、脫水、包埋、切片、HE染色和鏡檢。

1.2.6 IL-1β-siRNA及IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs協(xié)同治療RA效果

采集大鼠股骨骨髓間充質(zhì)干細胞，貼壁增殖培養(yǎng)3代用于后續(xù)細胞移植治療試驗。成功CIA模型大鼠被隨機分為PBS治療組、IL-1β-siRNA治療組、IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組3組，分別進行尾靜脈注射等量PBS、IL-1β siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合液(用5%葡萄糖配制2.5 mg/kg的IL-1β-siRNA(由Invitrogen公司提供)，與等體積的轉(zhuǎn)染試劑混合，靜置15 min用于尾靜脈注射)以及IL-1β-siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑混合液(同IL-1β-siRNA治療組)和BMSCs，BMSCs的注射濃度為1×107個/kg大鼠體重。每組的給藥頻率為每周一次。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，每個試驗重復3次，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準誤(x±SE)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立

造模期間動物無死亡，正常對照組大鼠隨著飼養(yǎng)時間的延長，體重逐漸增加，精神狀態(tài)良好。CIA模型組大鼠在首次免疫后第1周開始，體重增長緩慢，在造模1-4周內(nèi)，模型組體重增長均顯著小于對照組大鼠(圖1A)。

此外，對照組大鼠足趾均未見腫脹，而CIA模型組大鼠在初次免疫后第1周部分大鼠足趾表面發(fā)紅，第2周開始出現(xiàn)后足爪明顯腫脹，關(guān)節(jié)僵硬，活動受限，足趾腫脹在第3周達到病程的最高峰，之后趨于穩(wěn)定，持續(xù)至第4周(圖1B)。關(guān)節(jié)腫脹度提示CIA模型大鼠關(guān)節(jié)病變從第1周開始，持續(xù)至第4周，且第2至第3周關(guān)節(jié)病變最明顯。

A.大鼠體重；B.足趾腫脹值；C.不動時間；D.掙扎時間；E.血清中IL-1β濃度；F.脾臟中TGF-β1和Foxp3mRNA相對表達量

對建模前后大鼠每周進行一次強迫游泳試驗，并進行行為學檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組大鼠相比，隨著造模時間的延長，CIA模型組大鼠強迫游泳不動時間(圖1C)隨病程發(fā)展越來越長，而大鼠強迫游泳的掙扎時間(圖1D)逐漸減少，說明建模后模型大鼠后肢運動障礙嚴重。建模后每兩周檢測血清中IL-1β濃度，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清中IL-1β水平隨著病程的發(fā)展逐漸上升，2周和4周時均極顯著高于正常對照組大鼠(圖1E)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，造模4周后，與正常對照組大鼠相比，CIA模型大鼠脾臟組織中TGF-β1以及Foxp3 mRNA表達量均極顯著低于對照組(圖1F)。

2.2 關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學變化

造模4周后對膝關(guān)節(jié)進行組織病理學檢查，鏡檢發(fā)現(xiàn)正常對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面光滑、滑膜組織細胞排列整齊規(guī)則(圖2A)，而CIA模型大鼠呈現(xiàn)典型的關(guān)節(jié)炎癥狀，關(guān)節(jié)軟骨有明顯的糜爛或潰瘍，滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)腔內(nèi)有重度的炎性細胞浸潤，包括中性粒細胞，淋巴細胞，巨噬細胞，伴有輕微出血和纖維素性滲出(圖2B)。

A.正常大鼠關(guān)節(jié)；B.CIA模型大呈現(xiàn)重度的關(guān)節(jié)炎(箭頭所示炎性細胞浸潤)

圖2 關(guān)節(jié)組織病理學變化

2.3 IL-1β-siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染聯(lián)合BMSCs協(xié)同治療RA的效果

與PBS假治療組大鼠相比，IL-1β-siRNA治療組和IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠體重增長均極顯著升高，IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠體重增長更加明顯(圖3A)；此外，IL-1β-siRNA治療組和IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠足趾腫脹值均顯著降低，且IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠足趾腫脹值降低的更加明顯(圖3B)。

在強迫游泳試驗中，IL-1β-siRNA治療組和IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠不動時間均極顯著低于PBS對照組，且在治療1周和2周后IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠不動時間極顯著低于IL-1β-siRNA單獨治療組(圖3C)；大鼠強迫游泳的掙扎時間在治療后均極顯著高于PBS對照組，治療后1、2、3周IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠掙扎時間極顯著高于IL-1β-siRNA單獨治療組(圖3D)；治療2周和4周后，治療組大鼠血清中IL-1β的表達量均極顯著低于PBS對照組，且IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠血清中IL-1β水平極顯著低于IL-1β-siRNA單獨治療組(圖3E)；此外，大鼠脾臟組織中TGF-β1和Foxp3的mRNA相對表達量在治療組均極顯著升高，且IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠脾臟組織中TGF-β1和Foxp3的mRNA表達極顯著高于IL-1β-siRNA治療組(圖3F)。

3 討論

類風濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見的慢性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，被認為是危害人類健康的五大疾病之一，病因尚未明確。動物模型在研究RA發(fā)病機制中起著非常重要的作用。目前用于制備RA模型的方法和試劑有很多[5-8]，其中Trentham等于1977年首次建立了Ⅱ型膠原誘導性關(guān)節(jié)炎動物模型。在前人研究的基礎上，在本研究對CIA造模方法進行了改良，選取了Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑的聯(lián)合乳化液以及重復注射一次混合抗原，在保證了模型成功率(80%)的同時也使得模型的病理變化及免疫學特性更加穩(wěn)定、與人類RA更為相似，為后續(xù)深入研究RA治療方法提供了更加理想的動物模型。

RA關(guān)節(jié)損傷相關(guān)的最重要的細胞因子就是IL-1，它可以刺激內(nèi)皮細胞，促進淋巴細胞、中性粒細胞以及巨噬細胞的大量聚集，提高中性粒細胞對前列腺素的分泌，從而增加滑膜細胞膠原酶、軟骨細胞以及成纖維細胞的表達量，蛋白激酶分泌增加導致關(guān)節(jié)局部炎癥反應的發(fā)生[9]。在眾多細胞因子中IL-1β在RA的發(fā)病中起著重要的作用，它在滑膜炎癥反應發(fā)生發(fā)展的循環(huán)網(wǎng)絡中起著調(diào)控作用，可以作為判斷RA病情的嚴重程度以及評價RA臨床療效的重要指標。本試驗結(jié)果表明，與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠呈現(xiàn)典型的關(guān)節(jié)炎癥狀，且血清中IL-1β含量極顯著升高，結(jié)合行為學、組織病理學和免疫學的變化情況，提示RA模型制備成功，并且IL-1β可能在RA的發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，很可能作為治療RA的重要靶點。說明可通過對IL-1β進行阻斷，降低動物機體IL-1β的水平，從而阻止滑膜炎的產(chǎn)生、發(fā)展，從而對RA的治療起到積極作用。

A.體重增長；B.足趾腫脹值；C.不動時間；D.掙扎時間；E.血清中IL-1β濃度；F.脾臟中TGF-β1以及Foxp3 mRNA相對表達量

圖3 治療后各組大鼠試驗項目

siRNA是目前一種有效的用于沉默基因表達的技術(shù)，并且siRNA的療法在減少實驗性關(guān)節(jié)炎炎癥方面已被證實很有前景[10-14]。BMSCs作為一種基質(zhì)干細胞，它能夠促進多種組織的修復和再生[15]，在一定的誘導條件下BMSCs不僅能多向分化為多種組織細胞，還能通過分泌多種基質(zhì)分子來促進損傷組織的修復[15-18]。本試驗選用干擾siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染方法來治療RA模型大鼠，并基于BMSCs的獨特優(yōu)越性，使用干擾siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染結(jié)合BMSCs移植來治療RA模型大鼠，以期得到更優(yōu)的治療效果。比較各組治療效果，發(fā)現(xiàn)IL-1β-siRNA治療組和IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組在形態(tài)學、行為學、組織病理學以及免疫學水平對RA模型大鼠都具有較好的治療效果，且IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組對RA模型大鼠的癥狀緩解具有更顯著的效果，說明IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs可以增強RA的治療效果。

轉(zhuǎn)錄因子Foxp3在CD4+CD25+Treg上特異性大量表達，對其功能的發(fā)揮和發(fā)育中都起著非常重要的作用[19-20]。CD4+CD25+T細胞如果缺失了Foxp3的表達，就行使不了細胞功能。自從發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞上特異性大量分泌Foxp3以來，已有多項研究證明在Treg上Foxp3的表達量變化直接顯現(xiàn)CD4+CD25+T細胞水平的功能活性和變化[21-22]。表達于細胞表面或者分泌至細胞外的TGF-β1是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞發(fā)揮免疫抑制作用的機制之一[23]。TGF-β1是一種主要介導細胞接觸免疫并且對細胞分化具有雙重調(diào)節(jié)作用的多肽因子，它可以增強細胞外基質(zhì)合成以及炎癥細胞趨化，抑制免疫反應等。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CIA模型大鼠脾臟組織中TGF-β1的mRNA表達量極顯著低于正常對照組大鼠，提示模型大鼠體內(nèi)TGF-β1分泌減少可能不足以抑制自身免疫炎癥的發(fā)展，這可能也是實驗性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要原因之一。在Ⅱ型膠原的刺激下，T淋巴細胞過度增生、活化，可能與調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量的減少或者功能缺失有關(guān)，模型大鼠脾臟中Foxp3mRNA表達顯著下降，F(xiàn)oxp3mRNA的下調(diào)也促使CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞對TGF-β1分泌降低。而在治療實驗中，IL-1β-siRNA治療組以及IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠脾臟組織中TGF-β1和Foxp3mRNA表達量均顯著上調(diào)，表明RA機體CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量和功能都有所改善，說明了RA關(guān)節(jié)炎癥狀的改善可能與Treg功能和數(shù)量的改變有關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果表明，Ⅱ型膠原可成功誘導大鼠關(guān)節(jié)炎模型，IL-1β可能在RA的發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs可以增強RA的治療效果，從而為基因聯(lián)合細胞治療RA提供了理論基礎。