高珍珍，張超，景麗榮，胡元亮

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2. 南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095 )

近年來，大量研究已經(jīng)證實中藥多糖具有促進免疫調(diào)節(jié)[1]、抗氧化[2]、抗腫瘤[3]和抗病毒[4]等多種生物活性。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，多糖的生物活性與其空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，經(jīng)物理、化學等手段對其結(jié)構(gòu)進行適當?shù)男揎椇?，可獲得更高藥理活性的多糖衍生物[5]。硒是生命活動所必需的微量元素之一，構(gòu)成若干氧化酶的活性中心，可增強機體的抗氧化能力和對疾病的抵抗能力[6]。其存在形式有無機硒和有機硒兩種，相對于無機硒，有機硒具有易被機體吸收，毒性低，副作用小的特點，更安全、高效[7]。硒多糖作為有機硒的一種，天然獲得產(chǎn)量很低，不能滿足需求，通過化學合成的硒多糖，既可保持多糖的基本構(gòu)型和生理功能，又能有效的提高硒的生物利用度，發(fā)揮微量元素元素硒和多糖的雙重功能[8]。

本研究室在前期研究中，通過活性追蹤、正交設(shè)計和活性比較手段篩選出抗氧化活性較強的7種硒化多糖，硒化五味子多糖sSCP1、硒化當歸多糖sCAPS2、硒化百合多糖sLP2、硒化黨參多糖sCCPS5、硒化白術(shù)多糖sAMP6、硒化枸杞多糖sLBP6、硒化淫羊藿多糖sEMP7及最佳修飾條件[9-11]。本試驗通過體外試驗比較7種硒化多糖的體外抗氧化活性，篩選出效果較好的3種硒化多糖，并設(shè)置高、中、低3個濃度進一步比較它們的體內(nèi)抗氧化活性。本試驗旨在篩選出抗氧化活性較好的硒化多糖及最佳劑量，為研制硒多糖抗氧化增強劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 硒化多糖準備

分別按前期研究制備7種硒化多糖，sSCP1(硒化五味子多糖，制備條件為：每500 mg多糖加亞硒酸鈉200 mg、50 ℃反應(yīng)6 h；得率41.23%，糖含量56.83%，硒含量5.41 mg·g-1)、sCAPS2(硒化當歸多糖，制備條件：每500 mg多糖加亞硒酸鈉200 mg、70 ℃反應(yīng)8 h，得率36.80%，糖含量50.9%，硒含量12.98 mg·g-1)、sLP2(硒化百合多糖，制備條件：每500 mg多糖加亞硒酸鈉400mg、70 ℃反應(yīng)6 h；得率50.28%，糖含量54.21%，硒含量24.73 mg·g-1)、sCCPS5(硒化黨參多糖，制備條件：每500 mg多糖加亞硒酸鈉300 mg、70 ℃反應(yīng)8 h；得率29.12%，糖含量56.2%，硒含量11.86 mg·g-1)、sAMP6(硒化白術(shù)多糖，制備條件：每500mg多糖加亞硒酸鈉400 mg、70 ℃反應(yīng)10 h；得率25.18%，糖含量44.21%，硒含量10.45 mg·g-1)、sLBP6(硒化枸杞多多糖，制備條件：每500 mg多糖加亞硒酸鈉400 mg、70 ℃反應(yīng)6 h；得率35.84%，糖含量47.5%，硒含量13.66 mg·g-1)、sEPS7(硒化淫羊藿多糖，制備條件：每500 mg多糖加亞硒酸鈉400mg、 50 ℃反應(yīng)10 h；得率30.90%，糖含量34.44%，硒含量3.53 mg·g-1)。將7種硒化多糖按糖含量分別用蒸餾水倍比稀釋成5個濃度(1、0.5、0.25、0.125、和0.0625 mg·mL-1)，將sCAPS2、sAMP6和sLBP6稀釋成0.05 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1和0.15 mg·mL-1，Na2SeO3稀釋成10 μg·mL-1，煮沸30 min滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

三羥甲基氨基甲烷(Tris)，Sanland-chemInternationalInc 公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-(2，4，6-trinitro- phenyl) hydrazyl， DPPH)，Sigma 公司。水楊酸、乙醇、七水合硫酸亞鐵、過氧化氫、鐵氰化鉀等均為國產(chǎn)分析純。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒和總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.3 體外試驗

1.3.1 羥自由基清除試驗

取164支試管，分為硒化多糖組、硒化試劑Na2SeO3組和空白對照組，分別加入倍比稀釋好的各濃度硒化多糖和硒化修飾試劑Na2SeO3組(1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg·mL-1)2 mL，每組4個重復，在每個試管中先加入9 mmol·L-1FeSO42 mL，再加入9 mmol·L-1的水楊酸-乙醇溶液 2 mL，各濃度硒化多糖及硒化修飾試劑Na2SeO32mL，8.8 mol·L-1過氧化氫2 mL啟動整個反應(yīng)，用蒸餾水代替硒化化多糖和硒化修飾試劑Na2SeO3作為空白對照組。37 ℃反應(yīng)30 min后，以蒸餾水代替多糖溶液做空白調(diào)零，用754型紫外分光光度計測定510 nm處測定硒化多糖組和硒化修飾試劑Na2SeO3組(Ax)及空白對照組(A0)的吸光度。用下式計算羥自由基清除率，羥自由清除率=(1-Ax/A0)×100%。

1.3.2 DPPH自由基清除試驗

取168支試管，分為硒化多糖組、硒化試劑Na2SeO3組、DPPH對照組和空白對照組，加入倍比稀釋好的各濃度硒化多糖和硒化修飾試劑Na2SeO3組(A1)(1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg·mL-1)0.5 mL，置10 mL試管中，加入2.5 mL 的DPPH 溶液，每組4個重復，硒化多糖和硒化修飾試劑Na2SeO3對照組(A2)以2.5 mL無水乙醇代替多糖；DPPH 對照組(A0)以2.5 mL無水乙醇代替DPPH。室溫避光放置30 min 后，用無水乙醇調(diào)零，測的517nm處的吸光值A(chǔ)1、A2和A0，清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

1.3.3 ABTS自由基清除試驗

取164支試管，分為硒化多糖組、硒化試劑Na2SeO3組和空白對照組，分別加入倍比稀釋好的各濃度硒化多糖和Na2SeO3組(1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg·mL-1)10 μL，再加入ABTS自由基溶液2 mL(以1∶200 比例)每組4個重復。室溫下反應(yīng)6 min，反應(yīng)結(jié)束后用分光光度計測定734 nm波長處的吸光度值(Ax)和空白對照組(A0)的吸光度值。按以下公式計算ABTS自由基清除率：清除率=(1-Ax/A0)×100%。

1.4 體內(nèi)試驗

取6周齡ICR小鼠288只，隨機均分為12組，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除空白對照組外用OVA進行免疫，2周后二免。在首次免疫的同時，9個硒化多糖組分別灌胃0.05 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1和0.15 mg·mL-1的sCAPS2、sLBP6和sAMP60.4 mL，硒化試劑組灌胃Na2SeO3的5 μg·mL-10.4 mL，免疫對照組(M)和空白對照組(K)灌胃等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)3 d。分別于首免后第7、21和35天(D7、D21和D35)每組隨機抽取8只，摘眼球采血，分離血清，測定T-AOC、GSH-Px 和SOD的活性和MDA的含量，剖檢，取肝臟固定，石蠟切片，HE染色，觀察組織學變化。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以Means±SE表示，用SPSS20.0軟件進行方差分析和多重比較。當P<0.05時，為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 體外試驗

2.1.1 各組羥自由基清除率的變化

結(jié)果見圖1。在1 mg·mL-1時，除sSCP1外各硒化多糖組的羥自由基清除率均顯著高于Na2SeO3組(P<0.05)，sCAPS2組最高，與sLBP6組差異不顯著；在0.5 mg·mL-1時，各硒化多糖組的清除率均顯著高于Na2SeO3組(P<0.05)，sLBP6組最高，sCAPS2組次之，sAMP6組再次之，三組之間差異不顯著；在0.25 mg·mL-1時，sCAPS2、sCCPS5、sAMP6和sLBP6組的清除率顯著高于其他各組(P<0.05)；在0.125 mg·mL-1時，sCAPS2、sCCPS5、sAMP6和sLBP6組的清除率顯著高于其他各組(P<0.05)；在0.0625 mg·mL-1時，sCAPS2、sCCPS5和sAMP6組的清除率均顯著高于Na2SeO3組(P<0.05)，sCAPS2組最高，sLBP6組的差異不顯著。

注：同一劑量組間比較，字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同

圖1 各組的羥自由基清除率

2.1.2 各組DPPH自由基清除率的變化

結(jié)果見圖2。在1 mg·mL-1時，各硒化多糖組的DPPH自由基清除率均顯著高于Na2SeO3組(P<0.05)，sCAPS2組最高，顯著高于其它各組(P<0.05)；在0.5 mg·mL-1時，各硒化多糖組除sLP2外的清除率均顯著高于Na2SeO3組(P<0.05)，sLBP6組最高，顯著高于其它各組(P<0.05)；在0.25 mg·mL-1時，sCAPS2、sCCPS5和sLBP6組的清除率顯著高于其他各組(P<0.05)；在0.125 mg·mL-1時，sCAPS2和sLBP6組的清除率顯著高于其他各組(P<0.05)；在0.062 5 mg·mL-1時，sCAPS2和sLBP6組的清除率均顯著高于其它各組(P<0.05)，sLBP6組最高，與sCAPS2組差異不顯著。

圖2 各組的DPPH自由基清除率

2.1.3 各組ABTS自由基清除率的變化

結(jié)果見圖3。在1 mg·mL-1時，各硒化多糖組的ABTS自由基清除率均顯著高于Na2SeO3組(P<0.05)，sLBP6組最高，但與sCAPS2組差異不顯著，兩組均顯著高于其它各組(P<0.05)；在0.5 mg·mL-1時，各硒化多糖組的清除率均顯著高于Na2SeO3組(P<0.05)，sCAPS2組最高，與sLBP6組差異不顯著，兩組均顯著高于其它各組(P<0.05)；在0.25 mg·mL-1時，各硒化多糖組的清除率均顯著高于Na2SeO3組(P<0.05)，sCAPS2組最高，與sLBP6組差異不顯著，兩組均顯著高于其它各組(P<0.05)；在0.125 mg·mL-1時，各硒化多糖組對ABTS自由基的清除率均顯著高于Na2SeO3組(P<0.05)，sCAPS2組顯著高于其他各組(P<0.05)；在0.0625 mg·mL-1時，各硒化多糖組的清除率均顯著大于Na2SeO3組(P<0.05)，sCAPS2組顯著高于其他各組(P<0.05)。

圖3 各組的ABTS自由基清除率

2.2 體內(nèi)試驗

2.2.1 各組血清T-AOC活性的變化

各組血清T-AOC含量的變化見表1。在D7，各硒化多糖組的血清T-AOC含量均顯著高于免疫對照組和空白對照組(P<0.05)，sLBP6H組最高、顯著高于其它各組(P<0.05)；在D21，各硒化多糖組的血清T-AOC含量顯著高于免疫對照組和空白對照組(P<0.05)，sLBP6H組顯著高于其它各組(P<0.05))；在D35，各硒化多糖組除sCAPS2L、sAMP6L的血清T-AOC含量顯著高于免疫對照組和空白對照組(P<0.05)，sLBP6H組最高，顯著高于除sCAPS2M和sLBP6M組外的其它各組(P<0.05)。

表1 各組血清T-AOC活性的變化 U/mL

注：同列數(shù)據(jù)標不同字母者差異顯著(P<0.05)。下同

2.2.2 各組血清GSH-Px活性的變化

各組血清GSH-Px活性的變化見表2。在D7，各硒化多糖組的血清GSH-Px活性均顯著高于免疫對照組和空白對照組(P<0.05)，sLBP6H組顯著高于其它各組(P<0.05)；在D21，各硒化多糖組的血清GSH-Px活性顯著高于免疫對照組和空白對照組(P<0.05)，sLBP6H組最高且顯著高于其它各組(P<0.05)；在D35，各硒化多糖組的血清GSH-Px活性顯著高于免疫對照組和空白對照組(P<0.05)，sAMP6H組最高且顯著高于除sLBP6H組外的其它各組(P<0.05)。

2.2.3 各組血清SOD活性的變化

各組血清SOD活性的變化見表3。在D7，各硒化多糖組的血清SOD活性均顯著高于免疫對照組和空白對照組(P<0.05)，sCAPS2M組最高，其次為sCAPS2H和sLBP6H組，這三組顯著高于其它各組(P<0.05)；在D21，各硒化多糖組的血清SOD活性顯著高于免疫對照組和空白對照組(P<0.05)，sLBP6H組最高且顯著高于其它各組(P<0.05)；在D35，各硒化多糖組的血清SOD活性顯著高于免疫對照組和空白對照組(P<0.05)，sLBP6H組最高且顯著高于其它各組(P<0.05)。

表2 各組血清GSH-Px活性的變化 U/mL

表3 各組血清SOD活性的變化 U/mL

2.2.4 各組血清MDA含量的變化

各組血清MDA含量的變化見表4。在D7，各硒化多糖組除sAMP6L組外的血清MDA含量均顯著低于免疫對照組和空白對照組(P<0.05)，sLBP6H組最低，其次為sCAPS2M組，這兩組顯著低于其它各組(P<0.05)；在D21，各硒化多糖組的血清MDA含量顯著低于免疫對照組和空白對照組(P<0.05)，sLBP6H組最低、顯著低于其它各組(P<0.05)；在D35，各硒化多糖組的血清MDA含量均顯著低于免疫對照組和空白對照組(P<0.05)，sLBP6H組最低，其次為sAMP6H組差異不顯著，這兩組顯著低于其它各組(P<0.05)。

2.2.5 各組肝臟組織變化

各組小鼠肝組織形態(tài)學變化見圖4，各組肝細胞大小均勻，形態(tài)較規(guī)則，細胞核清晰，肝索排列整齊緊密。各組肝血竇內(nèi)的內(nèi)皮細胞，枯否氏細胞明顯多于空白對照組。sCAPS2H組(圖4A)、sCAPS2M組(圖4B)、sAMP6H組(圖4D)、sAMP6M組(圖4E)、sLBP6H組(圖4G)和sLBP6M組(圖4H)肝血竇內(nèi)的內(nèi)皮細胞和枯否氏細胞明顯多于sCAPS2L組(圖4C)、sAMP6L組(圖4F)、sLBP6L組(圖4I)。sCAPS2H組、sCAPS2M組和sCAPS2L組中，sCAPS2M組肝血竇內(nèi)的內(nèi)皮細胞和枯否氏細胞增多明顯。sAMP6H組、sAMP6M組和sAMP6L組中，sAMP6H組肝血竇內(nèi)的內(nèi)皮細胞，枯否氏細胞增多明顯。sLBP6H組、sLBP6M組和sLBP6L組中，sLBP6H組肝血竇內(nèi)的內(nèi)皮細胞和枯否氏細胞增多明顯。

表4 各組血清中MDA含量的變化 nmol/mL

A. sCAPS2H組；B. sCAPS2M組；C. sCAPS2L組；D. sAMP6H組；E. sAMP6M組；F. sAMP6L組；G. sLBP6H組；H. sLBP6M組；I. sLBP6L組；J. Na2SeO3組；M. 免疫對照組；K. 空白對照組

圖4 各組小鼠肝組織學變化 HE 染色結(jié)果 (10×40)

3 討論

1973年，美國學者Rotruck發(fā)現(xiàn)硒是GSH-Px必需的組成部分[12]。同年，世界衛(wèi)生組織宣布，硒是人和動物體內(nèi)必需的微量元素。硒有許多重要的生理功能，其中抗氧化性是硒的生化作用基礎(chǔ)。機體防御體系的抗氧化能力的強弱與健康程度存在密切的關(guān)系[13-14]，硒多糖作為一種抗氧化劑往往具有多功能性，但是目前大多數(shù)抗氧化方法都是從一個角度來評價抗氧化物在食品以及生物體體系中的多功能作用。所以，一種抗氧化方法不能全面的評價抗氧化物的抗氧化能力。只有通過幾種不同抗氧化作用機理的方法，在不同的條件下測定樣品的抗氧化能力，才能比較全面和準確的了解抗氧化劑的抗氧化能力。

機體在生長代謝過程中會不斷產(chǎn)生各種自由基，其中羥自由基(·OH)作為體內(nèi)最活潑的活性氧可與生物體內(nèi)多種生物大分子相互作用，破壞其原有生理功能，對機體造成傷害[15]。由于其存在時間短、攻擊性強、破壞性大而成為自由基化學研究的熱點，當加入羥自由基清除劑時可降低羥自由基對機體的損害[16]。由圖1可見，各硒化多糖在濃度0.062 5～1 mg·mL-1的羥自由基清除率均大于或顯著大于Na2SeO3組，sCAPS2在3個濃度組，sLBP6在2個濃度組的羥自由基清率均大于或顯著大于其它各組。DPPH是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，通過檢測生物制劑對DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的強弱，應(yīng)用DPPH法來評價體外抗氧化劑和植物抗氧化能力是一種快速、簡便、靈敏、可行的方法[17]。由圖2可見，比較硒化多糖各濃度的DPPH自由基清除率，sCAPS2在5個濃度組、sLBP6在3個濃度組、sCCPS5在1個濃度組的DPPH自由基清率均顯著大于其它各組。ABTS 法，是使用最普遍的測量和表征抗氧化劑抗氧化能力的比色法[18]。比較硒化多糖各濃度的ABTS自由基清除率由圖3可見，各硒化多糖濃度在0.062 5～0.25 mg·mL-1的ABTS自由基清除率均大于或顯著大于Na2SeO3組。sCAPS2在5個濃度組，sLBP6在3個濃度組的羥自由基清率均大于或顯著大于其它各組。綜合比較各硒化多糖三個自由基清除率，可以得出硒化多糖sCAPS2、sLBP6和sAMP6的體外抗氧化活性較強。

為了驗證體外試驗結(jié)果，并篩選出抗氧化活性最強的硒化多糖及最佳劑量，選擇體外抗氧化效果較好的sCAPS2、sLBP6和sAMP6，并設(shè)置3個劑量，進行體內(nèi)抗氧化活性比較。T-AOC的測定原理是，機體內(nèi)存在許多抗氧化物質(zhì)將Fe3+還原成Fe2+，而后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)定的化合物，通過比色可測定其抗氧化能力的高低[19]。在體內(nèi)抗氧化體系中，GSH-Px酶的活性中心是硒半胱氨酸，能特異性的催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應(yīng)可以起保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的作用，調(diào)節(jié)機體內(nèi)的抗氧化防御體系。SOD可歧化O2-形成H2O2，而H2O2在GSH-Px的作用下分解為H2O，從而達到消除自由基的作用，SOD 活性的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力[20]。本試驗結(jié)果顯示，在首免后的3個時間點，各硒化多糖組的血清T-AOC、GSH-Px和SOD含量均高于或顯著高于免疫對照組和空白對照組。在D7、D21和D35三個時間點，sLBP6H血清T-AOC活性組均為最高，高于或顯著高于其它各組；在D7和D35兩個時間點，sLBP6H組血清GSH-Px活性均為最高，高于或顯著高于其它各組, 在D7, sAMP6H組血清GSH-Px活性均為最高，高于或顯著高于其它各組；D7、D21和D35三個時間點，sLBP6H組的血清SOD活性含量最高，高于或顯著高于其它各組；MDA即丙二醛，是在脂質(zhì)過氧化過程中，由自由基引起而生成的一種醛類物質(zhì)，可作為交聯(lián)劑促進核酸、蛋白質(zhì)及磷脂的交聯(lián)，從而改變生物大分子的活性。通過檢測定丙二醛的含量可以判斷機體脂質(zhì)過氧化的程度，間接反應(yīng)出機體細胞的損傷程度[21]。本試驗結(jié)果顯示，在首免后的三個時間點，各硒化多糖組的血清MDA含量均低于或顯著低于免疫對照組和空白對照組，sLBP6H組最低，低于或顯著低于其它各組。綜合比較，sLBP6高劑量的體內(nèi)抗氧化活性最強。

肝臟是機體重要的消化腺，由實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞組成，實質(zhì)細胞即肝細胞，非實質(zhì)細胞包括枯否細胞、肝星狀細胞、肝竇內(nèi)皮細胞等[22]。肝細胞參與機體糖類的合成和轉(zhuǎn)換，蛋白質(zhì)的合成、儲存，尤其是在膽固醇、膽汁酸和磷脂酸的合成，調(diào)節(jié)機體的氧化平衡狀態(tài)中發(fā)揮重要作用[23]?？莘袷霞毎芡淌珊颓宄晌改c道進入門靜脈的細菌、病毒、異物及衰老的紅細胞和血小板等，在維持肝臟內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[24]。通過觀察各組小鼠肝組織的 HE 染色結(jié)果顯示，各組肝細胞大小均勻，形態(tài)較規(guī)則，細胞核清晰，肝索排列整齊緊密。硒化多糖高、中組肝細胞和肝血竇內(nèi)的枯否氏細胞明顯多于空白對照組、免疫對照組和Na2SeO3組。其中，sLBP6H組和sAMP6H組肝細胞和枯否氏細胞增多最明顯。推測硒化多糖能引起肝臟組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能與其提高機體抗氧化能力有關(guān)，我們將繼續(xù)進一步探討其作用機理。