李志要，孫陽陽，鮑恩東，呂英軍

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 天津瑞普生物股份有限公司，天津 300308)

豬腺病毒屬于腺病毒科哺乳腺病毒屬，共有6個(gè)血清型，其中1～3型主要引起腸道癥狀[1-4]。豬腺病毒3型(PADV-3)主要引起哺乳仔豬的腸炎以及腹瀉癥狀，并可以和其他病毒混合感染[5-6]。PADV-3是無囊膜，二十面體結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA病毒，其蛋白質(zhì)外殼主要由240個(gè)六鄰體(Hexon)和12個(gè)五鄰體組成[7-9]。Hexon蛋白包含了大量的抗原表位，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的中和抗體[10-11]。以往研究顯示表達(dá)Hexon的全長(zhǎng)基因比較困難，且可能存在稀有密碼子較多，從而造成蛋白翻譯不完全的情況，而且表達(dá)的Hexon蛋白多以包涵體形式存在[12-14]。有研究表明Hexon Loop1中的超變區(qū)HVR1～HVR6包含其大量的群和型的抗原決定簇[15]，因此可選擇超變區(qū)HVR1～HVR6作為檢測(cè)PADV-3的主要衣殼蛋白。

小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-relatived modifiter,SUMO)是運(yùn)用比較廣泛的標(biāo)簽蛋白，在真核生物中高度保守，其通過共價(jià)結(jié)合目的蛋白的N端的賴氨酸殘基來調(diào)節(jié)蛋白的活性，提高蛋白的表達(dá)水平以及難容蛋白的可溶性[17-20]；而且SUMO作為標(biāo)簽蛋白還具有增強(qiáng)可溶性，屏蔽毒性，促進(jìn)表達(dá)，促進(jìn)折疊，防止降解等優(yōu)良特性[21]。目前SUMO作為標(biāo)簽蛋白已經(jīng)廣泛應(yīng)用于原核表達(dá)研究中。陳春麗，郭宇飛等[22]利用SUMO成功表達(dá)出可溶性的PCV2的Cap蛋白；利用SUMO載體成功獲得可溶性的口蹄疫VP蛋白[23-24]。本試驗(yàn)通過在PADV-3的Hexon的HVR1-6區(qū)添加豬源SUMO3標(biāo)簽以提高Hexon-HVR1-6蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)，為后續(xù)檢測(cè)試劑盒和疫苗的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病毒毒株、菌株、載體

PADV-3毒株、pET28a-pigSUMO3載體由天津瑞普生物股份有限公司提供；pET28a載體購自南京諾唯贊公司；pEAST-blunt載體購自北京寶生物公司；大腸埃希菌(E.coli)DH5α和BL21(DE3)菌株購自唯地生物。

1.1.2 主要試劑

Phusion DNA聚合酶購自NEB公司；限制性核酸內(nèi)切酶購自大連寶生物公司；T4連接酶購自NEB公司；2×TaqMaster Mix購自南京諾唯贊公司；DL1K DNA Marker購自北京全式金公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒、IPTG、羊抗鼠IgG-HRP購自北京索萊寶公司；PADV-3豬陽性血清為南陽師范學(xué)院唐青海老師贈(zèng)送；陰性血清為實(shí)驗(yàn)室保存的取自無腺病毒感染的豬(Western blotting和ELISA均驗(yàn)證過)；羊抗豬IgG-HRP購自Bioss公司；鼠源His標(biāo)簽特異性抗體購自北京中衫天橋公司；Ni2+層析柱購自GE公司；HRP顯色試劑盒、瓊脂糖回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

在GenBank上搜索到序列號(hào)為AC-000189的豬腺病毒3型基因序列，對(duì)比找到Hexon基因的超變區(qū)(Hexon-HVR1-6)，用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)上下游引物并添加酶切位點(diǎn)以及對(duì)應(yīng)的保護(hù)堿基(表1)。引物由金唯智合成。

表1 引物序列

引物序列(5′-3′)酶切位點(diǎn)酶切載體構(gòu)建載體Hexon-HVR1-6-F-1CGCGGATCCATGTCGTTCAAACCCTACTCGBamHⅠHexon-HVR1-6-R-1CCCAAGCTTTTAATTGGCTCTGTTGGGAGCHindⅢpET28a-pigSUMO3pET28a-SUMO3-HexonHexon-HVR1-6-F-2CCCAAGCTTATGTCGTTCAAACCCTACTCGGGHindⅢHexon-HVR1-6-R-2CCGCTCGAGTTAATTGGCTCTGTTGGGAGCGGXholⅠpET28apET28a-Hexon

1.2.2 Hexon-HVR1-6序列的擴(kuò)增

用NEB公司的高保真酶Phusion對(duì)Hexon高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為100 μL，其中模板4 μL(50 ng),上下游引物(20 μmoL/L)各2.5 μL，5×GC Buffer 20 μL，補(bǔ)加ddH2O至總體積為100 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增目的條帶，并用瓊脂糖回收試劑盒對(duì)凝膠進(jìn)行回收純化。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

分別對(duì)Hexon-HVR1-6的PCR產(chǎn)物以及pET28a-pigSUMO3用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，之后再用T4連接酶進(jìn)行過夜連接，構(gòu)建出pET28a-pigSUMO3-Hexon-HVR1-6質(zhì)粒。同樣用HindⅢ和XhoⅠ酶切載體pET28a和對(duì)應(yīng)的Hexon-HVR1-6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建出pET28a-Hexon-HVR1-6載體。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)中，通過Kan+平板篩選陽性質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒用T7/T7 terminal引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，并送到金唯智進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 融合蛋白Hexon-HVR1-6的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的質(zhì)粒pET28a-pigSUMO3-Hexon-HVR1-6、pET28a-Hexon-HVR1-6轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，挑取陽性轉(zhuǎn)化子與加入Kan+的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；將菌液按照1∶100比例接種到上述培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，加入1 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)繼續(xù)誘導(dǎo)6 h，測(cè)量菌液的OD值。5 000 r·min-1離心5 min，用PBS緩沖液洗滌2次。用PBS重懸至OD600值為30，進(jìn)行超聲波破碎，12 000 r·min-1離心40 min收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 pigSUMO3-Hexon-HVR1-6融合蛋白的純化

利用NI金屬離子親和層析法對(duì)含有His6標(biāo)簽的融合蛋白進(jìn)行純化。20 mmol/L的咪唑溶液洗雜，500 mmol/L的咪唑溶液進(jìn)行洗脫，收集的蛋白通過超濾濃縮、脫咪唑處理；用Bradford法測(cè)定蛋白的濃度。

1.2.6 Western blot驗(yàn)證

表達(dá)量最高的pigSUMO3-Hexon-HVR1-6蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，采用半干轉(zhuǎn)印到NC膜上，分別用鼠源His6標(biāo)簽抗體和PADV-3豬陽性血清作為一抗孵育1 h，TBS-T清洗5次，分別加入羊抗鼠IgG-HRP和羊抗豬IgG-HRP，孵育1 h，TBS-T清洗5次，按照天根的顯色試劑盒進(jìn)行顯色處理。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證

用pET28a的通用引物T7/T7 terminal對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在1 100 bp附近有條帶。由于通用引物擴(kuò)增出的載體片段300 bp左右，而重組質(zhì)粒800 bp左右，所以擴(kuò)增出來的片段與預(yù)期大小基本相符(圖1)；將重組質(zhì)粒送去金唯智測(cè)序，經(jīng)過比對(duì)發(fā)現(xiàn)序列正確，且無堿基突變，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 pET28a-pigSUMO3-Hexon和pET28a-Hexon雙酶切驗(yàn)證

用BamHⅠ和HindⅢ對(duì)載體pET28a-pigSUMO3-Hexon進(jìn)行雙酶切，用HindⅢ和XholⅠ對(duì)載體pET28a-Hexon-HVR1-6雙酶切。結(jié)果都出現(xiàn)大小約為546bp條帶(圖2)，與目的條帶大小相符合。

M. DL1000 DNA Marker；1. BL21(DE3);2. pET28a;3. pET28a-Hexon-HVR1-6;4. pET28a-pigSUMO3-Hexon-HVR1-6

圖1 重組質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證

(A)pET28a-pigSUMO3-Hexon雙酶切M. Marker;1. pET28a-pigSUMO3-Hexon-HVR1-6;(B)pET28a-Hexon雙酶切M. Marker;1. pET28a-Hexon-HVR1-6

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切

2.3 融合蛋白的SDS-PAGE

鑒定正確的菌株經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，與表達(dá)菌和空載體對(duì)比并且進(jìn)行SDS-PAGE(圖3)分析，在37 kDa附近有特異性的蛋白條帶，表明融合蛋白成功表達(dá)；超聲破碎離心后SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)Hexon-HVR1-6蛋白部分可溶，部分不可溶；pigSUMO3-Hexon-HVR1-6蛋白以可溶形式表達(dá)，且?guī)igSUMO3標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)量比較高。pigSUMO3-Hexon-HVR1-6蛋白經(jīng)鎳離子親和層析純化后條帶單一，純化效果良好，測(cè)得濃度為6 mg·mL-1。

2.4 pigSUMO3-Hexon-HVR1-6蛋白的Western blot鑒定

表達(dá)純化的融合融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)印到NC膜上，用鼠源的His6抗體(圖4A)以及PADV-3的陽性血清(圖4B)分別作為一抗進(jìn)行反應(yīng)，在37 kDa處均有特異性條帶出現(xiàn)，而PADV-3陰性血清作為對(duì)照無條帶出現(xiàn)。表明該融合蛋白成功表達(dá)，并且抗原特異性良好。

M. Marker；1～2. pET28a-Hexon-HVR1-6的上清與沉淀；3～4. pET28a-pigSUMO3-Hexon-HVR1-6上清與沉淀；5. 純化后的Hexon-HVR1-6-SUMO3

圖3 融合蛋白的SDS-PAGE分析

(A)融合蛋白的His6抗體鑒定M. Marker; 1. pET28a; 2. pigSUMO3- Hexon-HVR1-6；(B)融合蛋白的PADV-3血清鑒定M. Marker;P. 陽性血清;N. 陰性血清

圖4 融合蛋白的Western-blotting鑒定

3 討論

PADV-3是豬場(chǎng)普遍存在的一種病毒，通常會(huì)引起輕微的腸道炎癥。有學(xué)者認(rèn)為，近年來豬場(chǎng)流行性腹瀉的發(fā)生可能PADV-3也在其中扮演著重要的角色[5,25]。Hexon是PADV-3的主要衣殼蛋白，而Hexon的HVR區(qū)是其抗原決定簇主要區(qū)域，并且具有血清型特異性。PADV-3因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，經(jīng)常被作為疫苗載體應(yīng)用于臨床[26-28]。而將PADV-3作為疫苗載體時(shí)，需要保證豬群體內(nèi)沒有中和抗體，或者滴度很低。目前對(duì)豬腺病毒3型的檢測(cè)方面研究并不是很多，而做Hexon蛋白的表達(dá)更是很少。Hexon蛋白表達(dá)通常以包涵體形式存在，而且在原核表達(dá)系統(tǒng)中會(huì)出現(xiàn)翻譯不完全的現(xiàn)象，因此本研究通過截取其包含大部分抗原決定簇的區(qū)域HVR1～HVR6進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)雖然有部分可溶但是表達(dá)量還是很低。本試驗(yàn)通過在Hexon蛋白的N端添加豬源SUMO3標(biāo)簽蛋白來原核表達(dá)，最后成功表達(dá)目的蛋白，并且免疫反應(yīng)性良好。

本試驗(yàn)首先擴(kuò)增出PADV-3的Hexon的HVR1～HVR6區(qū)域，然后在N端添加豬源的SUMO3標(biāo)簽蛋白。細(xì)菌誘導(dǎo)結(jié)束后將菌液濃度統(tǒng)一濃縮到OD600=30然后破碎。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)Hexon表達(dá)出既有包涵體又有分泌蛋白，Hexon蛋白加了標(biāo)簽蛋白后條帶粗亮，而且可以順利得到純度較高的目的蛋白。純化過程中發(fā)現(xiàn)有幾條非特異性蛋白與目的蛋白分子量相似，很難去除。可能這些雜蛋白含有與His6標(biāo)簽類似的結(jié)構(gòu)可以與咪唑分子牢固結(jié)合有關(guān)。嘗試過用凝膠過濾層析的方法進(jìn)行分離，但是效果并不是很好。如果想要純度更高的蛋白可以嘗試特異性更強(qiáng)的抗原抗體親和層析的方法[29]。

目前對(duì)于豬腺病毒的檢測(cè)主要是免疫熒光法和免疫過氧化物酶法檢測(cè)抗原[3，30]；或者通過普通PCR或熒光定量PCR來檢測(cè)核酸，然而這些方法略微繁瑣或會(huì)存在誤差影響因素較多[25]。本試驗(yàn)獲得的蛋白抗原性和特異性都不錯(cuò)，可以用于間接ELISA檢測(cè)試劑盒的開發(fā)工作，以方便臨床快速檢測(cè)和監(jiān)控豬腺病毒感染狀況。另外，Hexon蛋白也可為豬腺病毒亞單位疫苗的開發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。