王顯峰，白金英

(內(nèi)蒙古扎蘭屯職業(yè)學院，內(nèi)蒙古 扎蘭屯 162650)

腸外致病性大腸桿菌(ExPEC)可以引起多種動物呼吸道、泌尿道等腸道外感染，其感染率和死亡率均較高，成為危害養(yǎng)殖業(yè)主要的病原菌之一[1]。ExPEC根據(jù)其致病性特性可以分為尿道致病性大腸桿菌(UPEC)、新生兒腦膜炎致病性大腸桿菌(NMEC)、子宮內(nèi)膜致病性大腸桿菌(EnPEC)、肺炎致病性大腸桿菌(PPEC)、敗血癥性大腸桿菌(SEPEC)、乳腺炎致病性大腸桿菌(MPEC)等[2]。相關(guān)研究表明了ExPEC是人類源致病性大腸桿菌的貯存庫，具有人畜共患的特性，對人類的健康具有潛在性的威脅[3]。

大腸桿菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，擁有多種O抗原血清型，具有地區(qū)流行性特點，且不同血清型菌株之間沒有交叉免疫保護性，目前沒有有效疫苗，是導致該菌在動物養(yǎng)殖過程廣泛流行主要原因之一[4]。ExPEC基因組攜帶多種毒力基因，其致病性可以通過攜帶的相關(guān)毒力因子使ExPEC定植于動物黏膜表面，破壞動物的免疫系統(tǒng)，致使其動物機體免疫力下降，引起宿主發(fā)病[5]。許多研究表明ExPEC攜帶毒力基因與其致病性具有一定的相關(guān)性[6]。臨床中抗生素是控制大腸桿菌病的主要手段，由于抗菌藥物大量不合理使用導致致病性大腸桿菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，并產(chǎn)生廣譜的耐藥性[7]。因此，在動物大腸桿菌病治療過程中應(yīng)該引起重視。本試驗從扎蘭屯地區(qū)采集的羊鼻腔拭子150份中分離得到45株大腸桿菌，并對其血清型、毒力基因及耐藥性進行檢測與分析，為大腸桿菌病的防控及臨床用藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料

2018-2019年從扎蘭屯地區(qū)采集患有呼吸困難、流鼻涕的病羊的羊鼻腔拭子150份。

1.2 試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒購自(北京索萊寶科技有限公司)；2×TaqMarker Mix購自(寶生物(大連)公司)；DNA 2000Marker購自(北京中科瑞泰生物科技公司)大腸桿菌桿菌顯色培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)肉湯均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；陰性菌鑒定試條、14種抗菌藥物購自北京三佳拓聯(lián)科技發(fā)展有限公司；7%綿羊血培養(yǎng)基由本實驗室提供。

1.3 實驗動物

體質(zhì)量為(20±2.2)g健康昆明系小鼠350只，由本單位實驗動物中心提供。

1.4 細菌分離鑒定

將鼻腔拭子接種于大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)12～18 h，挑取大腸桿菌顯色培養(yǎng)基接種于7%綿羊血培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)12～18 h。用營養(yǎng)肉湯中進行純化培養(yǎng)，并進行形態(tài)學觀察和生化試驗鑒定。

1.5 細菌PCR鑒定

設(shè)計細菌通用16S rRNA引物，P1:5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′，P25′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′基因片段為1 429 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。利用細菌基因組DNA提取分離菌株的基因組DNA，進行PCR擴增，將分離菌株的PCR產(chǎn)物送上海生工進行基因測序。

1.6 細菌致病性試驗測定

參照文獻[8]，將純化的分離菌株培養(yǎng)至對數(shù)期計數(shù)，每株菌株腹腔注射5只小鼠，劑量為0.2 mL(1.0×106CFU/mL)，對照組給予PBS，觀察7 d，記錄死亡情況，進行病原菌分離鑒定。

1.7 細菌血清型檢測

參照文獻[9]，將分離菌株121 ℃滅菌2 h，破壞K抗原，用玻板凝集試驗檢測其分離菌株血清型。

1.8 細菌毒力基因檢測

參照文獻[10]，設(shè)計14種毒力基因引物，其中包括黏附素因K99、溶血素基因(hlyE、Ehly、Ehly、hlyA)、腸毒素基因(LT、STa、STb)、HPI毒力島(irp2、fyuA)、LEE毒力島(Ler、eaeA)、志賀菌毒素(stx1、stx2)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以提取分離菌株的基因組DNA，進行PCR擴增，檢測其攜帶毒力基因，PCR體系和條件反應(yīng)參照文獻[10]，將分離菌株的PCR產(chǎn)物送上海生工進行基因測序。

表1 毒力基因引物

毒力基因引物序列(5'-3')產(chǎn)物大小/bp退火溫度/℃K99TCCTGGGACATAATGGCTAGGTGTCAGAACGGAATTGTC98158hlyAGTGGCAGTATGAGTAATGACCGTATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATATT50157hlyEGGGTAGAAAATGCCGATGGTGCGTCATTTTGGGGGTAAGTGC49757EhxTCATCCCGGAAGCCTCCCTCACTACTATTAGCGTTTGCTGCACTGGCTTCTGATAC49666EhlyAATCCGGCAAAGAGACGAACCGCCTGTTCGGGCAACCCCTGCTTTGACTTT55366LTACAAAAAGTTCTATCGCTTCCCCTGATCCAGATGATGCTC71457STaGGCTGGACATCATGGGAACTGGCGTCGGGAACGGGTAGAATCG30266STbGAACGGCGGACTGTTAATTTGAACATTCAGAGTACCGGG139158LerCGCACACAACAAGCCCATACGATGAGTTCCGGCAGGCAA19558eaeATAACGGCTATTTCCGCATGATCC CAGACGATACGATCCAG55258irp2AAGGATTCGCTGTTACCGGATCGGCCAGGATGATTCGTCG30152fyuAACACGGCTTTATCCTCTGGCGGCATATTGACGATTAACGAA95358stx1TACTAATGCCATATAGCCCCATAAGAGCTGTTTGTAGCGAAGCC116057stx2ACTATTCTCTGCAGAAGTCCCTCCGATTCTGAACGT82459

1.9 細菌藥敏試驗

分離菌株的藥敏試驗參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)2017推薦的標準K-B紙片法進行試驗操作和結(jié)果判斷，統(tǒng)計其耐藥數(shù)據(jù)，分析其耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離鑒定

疑似大腸桿菌在大腸桿菌桿菌顯色鑒別培養(yǎng)基上長出邊緣整齊的、光滑的綠色菌落，在7%綿羊血培養(yǎng)基長出大小一致、邊緣整齊的、光滑的菌落，呈現(xiàn)β溶血(圖1)；染色鏡檢為分離菌株呈現(xiàn)陰性的兩端鈍圓桿狀菌 (見圖2)。分離菌株分解半乳糖、葡萄糖、蔗糖，甘露糖、麥芽糖、且產(chǎn)酸不產(chǎn)氣； V-P試驗為陰性。 用ATB全自動生化鑒定為大腸桿菌，其合格率為99.5%～100%。經(jīng)統(tǒng)計共獲得69株大腸桿菌。

圖1 分離菌株β溶血

圖2 分離菌株革蘭氏染色(1 000×)

2.2 細菌的PCR鑒定

69株分離菌株使用通用16S rRNA引物均擴增出1 429 bp的目的基因條帶(見圖3)，測序結(jié)果顯示69株分離菌株與大腸桿菌參考菌株16S rRNA基因序列的同源性在98.9%～99.9% 之間，被鑒定為大腸桿菌。

M. DL2000 Marker;1～13. 分離菌株;7. 空白對照

圖3 部分分離菌株P(guān)CR擴增結(jié)果

2.3 細菌致病性試驗

攻毒組小鼠在攻毒后3～4 d，出現(xiàn)精神沉郁、采食量減少，個別小鼠不表現(xiàn)任何癥狀出現(xiàn)急性死亡，從死亡的小鼠的體內(nèi)分離到大腸桿菌，對照組小鼠健康存活。經(jīng)統(tǒng)計，45株大腸桿菌能引起小鼠死亡。

2.4 血清型檢測

由表1可知， 45株大腸桿菌分屬10個血清型，其中O111、O127、 O38 為該地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型，分別占致病菌株的26.7%、22.2%和17.8%。

表1 大腸桿菌血清型檢測

血清型檢出菌數(shù)/株所占比例/%O1424.4O5212.2O5624.4O38817.8O2436.7O9812.2O8924.4O15148.9O1111022.2O1271226.7

2.5 分離菌株毒力基因檢測

對分離的45株大腸桿菌，用PCR法檢測14種毒力基因，結(jié)果見表2。 45株大腸桿菌中毒力基因irp2、fyuA、hlyA、hlyE檢出率較高，在88.9%～100%之間；Ler、eaeA、Ehly檢出率在33.3%～44.4%之間；Ehx、stx1、stx2檢出率較低，在4.4%～14.3%之間；LT、Sta、STb、K99未檢出。

表2 大腸桿菌毒力基因檢測

毒力基因檢出菌株數(shù)檢出率/%毒力基因檢出菌株數(shù)檢出率/%irp245100.0Ehly1942.2fyuA45100.0LT00Ler2044.4STa00eaeA1533.3STb00hlyA4293.3K9900hlyE4088.9stx124.4Ehx614.3stx236.7

2.6 細菌藥敏試驗結(jié)果

由表3 可知，分45株大腸桿菌對氨芐西林、磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、新霉素、紅霉素5種藥物耐藥率在88.9%～1000%之間；對慶大霉素、強力霉素、多黏菌素、氟苯尼考4種藥物耐藥率在53.3%～77.8%之間；對頭孢噻呋、環(huán)丙沙星、林可霉素、大觀霉素、恩諾沙星5種藥物耐藥率相對較低，耐藥率在13.3%～26.7%之間。

表3 大腸桿菌耐藥性分析

藥物耐藥菌株數(shù) 耐藥率/%藥物耐藥菌株數(shù) 耐藥率/%頭孢噻呋613.3強力霉素2657.8阿莫西林45100.0磺胺間甲氧嘧啶4088.9氨芐西林4497.8大觀霉素920.0恩諾沙星1226.7林可霉素613.3環(huán)丙沙星817.8多黏菌素3271.1新霉素3992.9紅霉素4293.3慶大霉素3577.8氟苯尼考2453.3

3 討論

大腸桿菌是重要的人畜共患病原之一，可引起多種動物發(fā)病[10-12]。本試驗從150份患羊鼻拭子中分離得到了69株大腸桿菌，通過人工感染小鼠試驗，證實45株具有致病性，說明大腸桿菌可能對羊存在潛在威脅，應(yīng)引起重視。因此，對分離的45株大腸桿菌進行血清型、毒力基因檢測及耐藥性分析。結(jié)果表明， 45株大腸桿菌分屬10個血清型，其中O111、O127、 O38 為該地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型，說明該地區(qū)分離的大腸桿菌血清型復(fù)雜，具有多樣性。

大腸桿菌致病過程與其攜帶的毒力基因有關(guān)， HPI毒力島、LEE毒力島可編碼多種毒力基因，是致病性大腸桿菌的標志性基因，與其致病性密切相關(guān)[8-9]。有研究表明溶血素是引起致病性大腸桿菌的重要毒力因子，主要包括α- 溶 血 素 (HlyA)、腸溶血素(EhxA)、溶細胞素 A (ClyA)，這些溶血素基因具有廣譜的細胞溶解性，可以造成嚴重的細胞毒性，在大腸桿菌致病中發(fā)揮重要作用[10]。本試驗中， 45株大腸桿菌分離株毒力基因irp2、fyuA、hlyA、hlyE、Ler、eaeA、Ehly的檢出率在33.3%以上，其他毒力基因檢出率在4.4%～14.3%之，特別是irp2、fyuA、hlyA、hlyE檢出率在88.9%～100%之間，說明這4種毒力基因在大腸桿菌分離株中廣泛流行，可能與菌株毒力有關(guān)，有待進一步研究。

大腸桿菌的耐藥性可通過接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導等多種方式在不同血清型菌株之間傳播，使抗菌藥物敏感菌株成為耐藥菌株，且可以出現(xiàn)多重耐藥性產(chǎn)生[13]。本試驗研究表明，分離菌株對氨芐西林、阿莫西林、新霉素等9種藥物耐藥率在53.3%以上，對其他藥物的耐藥率在13.3%～26.7%之間，說明該地區(qū)大腸桿菌分離株耐藥性嚴重，應(yīng)引起重視。