張曉凱，徐保娟，崔曉霞，李洋洋，周曉慧，張鑫宇，張泉，夏曉莉，孫懷昌，3*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 青島易邦生物工程有限公司，山東 青島 266032；3. 江蘇農(nóng)牧職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是威脅世界養(yǎng)豬業(yè)最危險的傳染病[1]。該病長期在沙哈拉以南非洲國家呈地方性流行，2007年傳入格魯吉亞，目前已在亞美尼亞、阿塞拜疆、俄羅斯、羅馬尼亞、烏克蘭、比利時等10多個歐洲國家流行[2]。2018年8月我國沈陽首次報道ASF疫情[3-4]，截止12月19日已有23省(市)發(fā)生91起家豬疫情和2起野豬疫情，嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。由于缺少安全有效的疫苗，目前該病主要依賴感染豬撲殺和生物安全措施進(jìn)行控制，因此快速、準(zhǔn)確實驗室診斷十分重要[5]。

ASF實驗室診斷方法包括病毒學(xué)檢測方法和血清學(xué)檢測方法，血清學(xué)檢測方法主要有免疫熒光試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和免疫轉(zhuǎn)印(Western blot)，其中ELISA主要用于血清學(xué)篩查，免疫熒光試驗和免疫轉(zhuǎn)印主要用于檢測結(jié)果驗證。非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗體檢測ELISA主要有世界動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的ELISA(OIE-ELISA)和商品化試劑盒，但檢測敏感性都較低[5]。

B602L是ASFV的非結(jié)構(gòu)蛋白，作為分子伴侶參與p72衣殼蛋白的折疊[6-7]，也是強(qiáng)免疫原性抗原之一[8]。盡管國內(nèi)已有ASFV重組抗原表達(dá)的報道[9-11]，但能否作為血清學(xué)診斷抗原有待用自然感染康復(fù)豬血清驗證。另外，現(xiàn)有的ASFV重組抗原多帶有組氨酸標(biāo)簽，而我國豬群使用帶組氨酸標(biāo)簽的亞單位疫苗已較普遍，因此有可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)。類彈性蛋白多肽(elastin-like polypeptide, ELP)是根據(jù)體內(nèi)彈性蛋白重復(fù)序列合成的多聚體，具有溫度敏感的可逆相變特性，在低于相變溫度溶液中呈可溶狀態(tài)，高于相變溫度溶液中變?yōu)槟蹱顟B(tài)，因此ELP融合蛋白可用簡單的相變循環(huán)(溫控離心)純化[12]。本研究將ASFV B602L與ELP進(jìn)行融合表達(dá)，利用相變循環(huán)進(jìn)行融合蛋白純化，用煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus, TEV)蛋白酶活性包涵體切除ELP標(biāo)簽，用獲得的無標(biāo)簽重組B602L抗原建立ASFV抗體檢測ELISA方法，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

ELP融合表達(dá)載體pET-ELP由本實驗室構(gòu)建和保存；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)從美國Novagen公司引進(jìn)，本實驗室保存；含Ba71V株ASFV B602L基因的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-B602L由葡萄牙Parkhouse教授提供；TEV蛋白酶活性包涵體由本實驗室制備；ASFV重組抗原免疫豬血清由本實驗室制備，重組抗原在英國動物衛(wèi)生所ASF參考實驗室用ASFV抗體陽性血清鑒定正確。

1.2 表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)ASFV B602L基因序列設(shè)計1對PCR引物，正向引物P1序列為5- TAGAGCTCCGAAAACCTGTACTTCCAGGGTGCAGAATTTAATATTGATGAGC-3(斜體和下劃線分別表示引入的SacⅠ酶切位點(diǎn)和TEV蛋白酶識別位點(diǎn))，反向引物R1序列為5- ACGCGGCCGCTTACAATTCTGCTTTTGTATATAA-3(NotⅠ酶切位點(diǎn))。以pGEX-4T-1-B602L為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序為98 ℃變性10 s、55 ℃退火5 s、72 ℃延伸10 s，共30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物克隆入pET-ELP載體，獲得的重組載體pELP-B602L經(jīng)限制酶切鑒定正確后送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.3 融合蛋白表達(dá)

將重組載體pELP-B602L轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌，挑取單菌落接種卡那霉素(50 μg/mL)LB培養(yǎng)液，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜；按1∶100比例接種500mL卡那霉素 2×TY培養(yǎng)基(10 g/L酵母提取物, 16 g/L胰蛋白胨, 5 g/L 氯化鈉)，37 ℃搖床培養(yǎng)5 h；轉(zhuǎn)入20 ℃搖床平衡30 min，加入0.2 mmol/L IPTG,20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h，4 ℃、5000 g離心10 min；沉淀菌體用1/10培養(yǎng)基體積PBS離心洗滌1次, 用50 mL PBS懸浮, 超聲波充分裂解(40 w, 10 s，間歇15 s，共10 min)；4 ℃、14 000 g離心10 min收集上清液，離心沉淀用等量PBS懸浮，各取10μL進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

1.4 融合蛋白純化

純化ELP-B602L融合蛋白的相變循環(huán)參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，將重組菌裂解液與等體積含0.5%TritonX-100的4 mol/L氯化鈉混勻，26 ℃孵育10 min，室溫、14 000 g離心5 min；離心沉淀用TEV蛋白酶切割液(50 mmol/L Tris-HCl, 0.5 mmol/L EDTA,1 mmol/L DTT,pH8.0)懸浮，4 ℃孵育8 h，4 ℃、12 000 g離心10 min，收集上清液。

1.5 標(biāo)簽切除與目的蛋白回收

用TEV蛋白酶活性包涵體切除ELP標(biāo)簽參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行，蛋白酶用量為100 μg/mL,30 ℃孵育8 h，6 000 g離心10 min去除蛋白酶性包涵體；離心上清液加入1/100蛋白酶抑制劑混合物(碧云天生物技術(shù)公司)，室溫孵育30 min；上清液加入等體積4 mol/L氯化鈉，26 ℃孵育10 min，室溫、14 000 g離心5 min；上清液用PBS(pH7.2)透析2次，14 000 g離心10 min，上清液即為純化的無標(biāo)簽重組B602L抗原。

1.6 重組抗原免疫轉(zhuǎn)印鑒定

用12%SDS-PAGE分離B602L重組蛋白，用半干轉(zhuǎn)印儀(Bio-Rad公司)轉(zhuǎn)移PVDF膜，用含5%脫脂乳粉的PBS(pH7.2)37 ℃封閉1 h；加入含0.2%Tween20封閉液1∶500稀釋的B602L抗體陽性豬血清，37 ℃孵育1h；用PBST(含0.1%Tween-20 PBS)洗膜4次，5 min/次；加入含0.2%Tween20封閉液1∶10 000稀釋的DyLight800標(biāo)記驢抗豬IgG(美國KPL公司)，37 ℃孵育1 h；用PBST洗膜4次，5 min/次，雜交信號用Odyssey Infrared Imaging System (美國LI-COR公司)在800 nm波長掃描。

1.7 重組抗原ELISA鑒定

用0.1 mol/mL碳酸鹽溶液(pH9.6)將純化重組B602L抗原稀釋至5 μg/mL，分裝ELISA反應(yīng)板，100 μL/孔，設(shè)不加抗原空白對照孔，4 ℃包被過夜；用PBST(含0.05% Tween20的PBS)洗板4次，加入封閉液(含5%脫脂乳粉的PBST)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；用封閉液稀釋重組B602L抗原免疫豬血清，加入ELISA板各孔，100 μL/孔，設(shè)陰性豬血清對照，37 ℃孵育1 h；用PBST洗板4次，加入封閉液1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗豬IgG(無錫藥科美生物公司)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；用PBST洗板4次，加入新鮮配制的TMB顯色液，100 μL/孔，37 ℃避光孵育20 min；加入2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，50 μL/孔；以空白對照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)讀取各孔的OD450值。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體鑒定

用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和NotⅠ對重組載體pELP-B602L進(jìn)行雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示可切出預(yù)期的約1.8 kb插入片段(圖1)，序列測定結(jié)果顯示插入的基因片段無突變，表明重組表達(dá)載體構(gòu)建正確。

M. DNA Marker; 1. pELP-B602L酶切

圖1 融合表達(dá)載體pELP-B602L的酶切鑒定

2.2 融合蛋白表達(dá)

將重組載體pELP-B602L轉(zhuǎn)化BL21(DE3)大腸桿菌，用0.2 mmol/L IPTG、20℃誘導(dǎo)表達(dá)16h，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示重組菌表達(dá)預(yù)期的118 kDa重組蛋白，重組蛋白為可溶性表達(dá)，存在于菌體裂解液離心上清中(圖2)。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. 未誘導(dǎo)重組菌；2. IPTG誘導(dǎo)重組菌；3. 裂解菌離心上清；4. 裂解菌離心沉淀

圖2 ELP-B602L融合蛋白表達(dá)的電泳分析

2.3 融合蛋白純化

將重組菌裂解液與等體積含0.5%TritonX-100的4 mol/L氯化鈉混勻，在26 ℃進(jìn)行1次相變循環(huán)，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示純化的ELP-B602L融合蛋白純度大于85%(圖3)。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. 裂解重組菌離心上清；2. 相變循環(huán)純化的融合蛋白

圖3 純化ELP-B602L融合蛋白的電泳分析

2.4 ELP標(biāo)簽切除與重組B602L回收

將TEV蛋白酶活性包涵體與ELP-B602L融合蛋白在30 ℃孵育8 h，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示切割效率接近100%；將切割產(chǎn)物12 000 g離心10 min去除TEV蛋白酶活性包涵體，離心上清中加入2 mol/L(終濃度)氯化鈉，在26 ℃進(jìn)行再次相變循環(huán)，結(jié)果顯示回收的重組B602L蛋白為預(yù)期的69 kDa，純度大于90%(圖4)。

2.5 重組蛋白免疫轉(zhuǎn)印鑒定

用ASFV B602L抗體陽性血清與純化的ELP-B602L融合蛋白和回收的重組B602L蛋白進(jìn)行免疫轉(zhuǎn)印試驗，結(jié)果顯示兩個蛋白均能被抗體識別(圖5)，表明兩種重組B602L蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. 未切割融合蛋白；2. 蛋白酶切割產(chǎn)物；3. 相變循環(huán)離心沉淀；4.相變循環(huán)回收的重組B602L蛋白

圖4 重組B602L蛋白標(biāo)簽切除與回收的電泳分析

M. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. ELP-B602L融合蛋白；2. 重組B602L蛋白

圖5 重組B602L蛋白的免疫轉(zhuǎn)印鑒定

2.6 重組抗原ELISA鑒定

分別用0.5、1.0和2.0 μg/mL重組B602L蛋白包被ELISA反應(yīng)板，與1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400稀釋B602L抗體陽性(PS)和陰性豬血清(NS)進(jìn)行棋盤滴定，結(jié)果顯示三個不同濃度重組B602L蛋白與B602L抗體陰性血清反應(yīng)陰性(OD450<0.16)，與陽性血清反應(yīng)陽性(OD450>1.5)，OD450值與血清稀釋倍數(shù)呈良好的線性關(guān)系(圖6)。

圖6 重組B602L抗原與豬血清的棋盤滴定

3 討論

非洲豬瘟病毒感染豬后7～10 d即產(chǎn)生特異抗體，并維持很長時間。目前國內(nèi)外均未使用非洲豬瘟疫苗，因此抗體檢測對于ASF診斷和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義，也是地方性流行國家(地區(qū))以及亞急性、慢性ASF診斷的主要手段[8]。B602L是ASFV的強(qiáng)免疫原性抗原之一[14]。本實驗室已用大腸桿菌表達(dá)的B602L等重組抗原建立了混合抗原ELISA抗體檢測方法，在ASF參考實驗室檢測結(jié)果顯示具有很高的敏感性和特異性[15]。然而，最近在國內(nèi)檢測發(fā)現(xiàn)，該ELISA方法與ASF發(fā)生前部分豬血清呈陽性反應(yīng)。由于這些重組抗原帶有組氨酸融合標(biāo)簽，而目前我國豬群使用帶組氨酸標(biāo)簽的重組亞單位疫苗已較普遍[16-17]，因此推測由組氨酸標(biāo)簽的交叉反應(yīng)所致。為了解決這一問題，本研究將ASFV B602L蛋白與ELP標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，用相變循環(huán)獲得純化融合蛋白后，用自制的TEV蛋白酶活性包涵體切除ELP標(biāo)簽。SDS-PAGE分析顯示，盡管一次相變循環(huán)獲得的融合蛋白純度不高(～85%)，但在切除ELP標(biāo)簽和再次相變循環(huán)后，回收的重組B602L蛋白的純度大于90%，進(jìn)一步證明ELP是有效的新型重組蛋白純化標(biāo)簽。本研究策略的突出優(yōu)點(diǎn)包括：利用相變循環(huán)(溫控離心)即可獲得高純度重組抗原，純化過程不僅簡單、快速，而且不需昂貴的化學(xué)試劑和儀器設(shè)備；制備的重組抗原不含任何標(biāo)簽和額外氨基氨酸，從而避免純化標(biāo)簽導(dǎo)致的交叉反應(yīng)問題，用其建立的抗體檢測方法特異性更強(qiáng)。

免疫轉(zhuǎn)印鑒定結(jié)果顯示，ELP-B602L融合蛋白和回收的重組B602L蛋白均能被特異抗體陽性豬血清識別，表明兩種重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。ELISA檢測結(jié)果顯示重組B602L抗原與抗體陰性血清反應(yīng)陰性，與特異抗體陽性血清反應(yīng)陽性，而且抗原濃度與血清稀釋倍數(shù)具有良好的線性關(guān)系。用0.5 μg/mL包被抗原進(jìn)行ELISA檢測，1∶6 400稀釋抗體陽性血清的OD450值>1.5，表明用重組B602L抗原進(jìn)行抗體檢測具有很高的敏感性。這些研究表明，本研究獲得的無標(biāo)簽重組B602L蛋白可用于ASFV抗體的免疫轉(zhuǎn)印和ELISA檢測。