紀(jì)曉霞，李帥，許濛，楊博，張源淑

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物生理生化重點開放實驗室，江蘇 南京 210095)

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是2000年首次報道的一種單羧肽酶，它由一個信號肽、一個跨膜區(qū)及鋅結(jié)合區(qū)位點三部分組成[1]。ACE2將血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)降解為具有舒張血管及抗增殖作用血管緊張素(1-7)[Ang(1-7)]，也可將血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)降解為Ang(1-9)。Ang(1-7)通過其受體Mas(MasR)發(fā)揮抗氧化、抗纖維化、抗炎等作用[2-4]。目前ACE2的研究主要集中在糖尿病、高血壓、腎病等方面的研究[5-6]。已成為人醫(yī)臨床研究的一個熱點和前沿領(lǐng)域，但是對于動物，特別是家禽方面的研究尚沒有文獻(xiàn)報道。

本研究擬以白羽肉雞為研究對象，應(yīng)用RT-PCR和基因克隆技術(shù)擴(kuò)增并鑒定白羽肉雞ACE2基因序列片段，利用生物信息學(xué)方法，進(jìn)行不同物種ACE2基因系統(tǒng)發(fā)育分析，對白羽肉雞ACE2基因序列蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)及親水性、蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測、亞細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)磷酸化、糖基化、三級結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，旨在為白羽肉雞ACE2基因結(jié)構(gòu)與功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

21日齡白羽肉雞，購自陸氏養(yǎng)殖場，頸部放血處死后取心臟、肝臟、肺臟、腎臟、回腸、盲腸、空腸等組織，經(jīng)生理鹽水漂洗后放入液氮，移至-70 ℃保存。

1.2 主要儀器和試劑

BamHⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶購自武漢ABclonal公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自美國Omega公司；Trans Start Fast Pfu DNAPolymerse購自南京全式金公司；Trizol試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊公司；PremixTaq酶、pMD-19T載體購自日本TaKaRa公司，DNA凝膠回收試劑盒購自南京AxyGen公司。

Nandrop2000核酸蛋白分析儀(Eppendorf，德國)，Tone PCR擴(kuò)增儀(Biometa，美國)，Tanon-5200Multi全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1 白羽肉雞各種組織中ACE2基因和蛋白的表達(dá)檢測

1)組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物合成

隨機(jī)取約100 mg上述白羽肉雞各組織，徹底勻漿后參照Trizol Reagent操作步驟分別提取白羽肉雞組織總RNA，利用Nandrop2000核酸蛋白分析儀測定RNA的濃度和純度，選取OD260/OD280比值為1.8-2.0的樣品采用二步法反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄具體步驟按照反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書進(jìn)行。-20 ℃保存cDNA。

2)引物設(shè)計

內(nèi)標(biāo)基因18SrRNA選用Ambion Universal18S internal standard, 產(chǎn)物長度315 bp。根據(jù)GenBank中預(yù)測的雞ACE2基因序列(XM-416822.5)設(shè)計。ACE2及內(nèi)標(biāo)基因18S rRNA引物根據(jù)GenBank序列，用Primer Premier 5軟件設(shè)計上、下游引物序列，引物參數(shù)指標(biāo)見表1，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 目的基因及內(nèi)標(biāo)引物序列

3)白羽肉雞ACE2部分基因及內(nèi)標(biāo)基因18S rRNA克隆

將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(25 μL)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性20 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min 15 s，72 ℃徹底延伸5 min，32個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 白羽肉雞ACE2全基因克隆

1)組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物合成

同1.3.1

2)引物設(shè)計

引物設(shè)計根據(jù)GenBank中的預(yù)測的雞ACE2基因序列(XM-416822.5)設(shè)計，上下游引物分別插入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(標(biāo)注下劃線)，引物參數(shù)指標(biāo)見表2，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

3)全基因PCR擴(kuò)增

將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min 15 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 白羽肉雞ACE2全基因的引物序列

基因引物方向引物序列(5′-3′)產(chǎn)物大小/bpACE2上游引物CGGGATCCATGTTGCTTCACTTCTGGCTTCTCTGTG下游引物GCGAAGCTTCTAAAAGGATGTTTGTGTCTCTTCAGATTGCTCA2 444

4)PCR產(chǎn)物的克隆及序列測定

利用DNA膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，具體步驟參照DNA膠回收試劑盒試劑盒說明書進(jìn)行?；厥债a(chǎn)物和pMD19T載體進(jìn)行連接(16 ℃，14 h)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。將菌體重懸涂布在LB/Amp/X-Gal/IPTG培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)16 h。挑取培養(yǎng)皿上的單克隆接種于含有氨芐的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。

利用質(zhì)粒小型提取試劑盒提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒用HindⅢ單酶切及BamHⅠ、HindⅢ雙酶切進(jìn)行驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳。將鑒定的陽性質(zhì)粒送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序。

5)生物信息學(xué)分析

使用NCBI網(wǎng)站中的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)查找開放閱讀框功能，利用Bio Edit Sequence Alignment Editor對核苷酸序列和與之對應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行Fas格式轉(zhuǎn)換，利用NCBI網(wǎng)站Blast軟件進(jìn)行核苷酸的同源性比對分析，運(yùn)用DNAStar軟件中MegAlign模塊，將克隆的雞ACE2氨基酸序列與GenBank上收錄的其他動物的氨基酸的序列進(jìn)行同源性分析。利用MegAlign軟件繪制遺傳進(jìn)化樹進(jìn)行親緣性分析。利用在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)以及DNA Star里的Protean分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，利用DNAStar程序包里Protean軟件分析親水性。利用TMHMM在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析，利用SignalP在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP-4.0/)進(jìn)行蛋白質(zhì)信號肽分析，利用NetPhos2.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對ACE2基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化、糖基化位點預(yù)測，利用Phyre2.0軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果與分析

2.1 白羽肉雞不同組織中ACE2分布

ACE2在白羽肉雞各組織中的基因表達(dá)。取白羽肉雞組織反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1顯示。在白羽肉雞腎臟、十二指腸、回腸、盲腸、空腸組織均有單一條帶，條帶大小為395 bp左右，與預(yù)期大小一致。

M.DNAMaker；1. 18S rRNA基因；2.陰性對照；3.十二指腸；4.肝臟；5.盲腸；6.心臟；7.腎臟；8.回腸；9.空腸；10.肌胃；11.肺臟；12.胰臟

圖1 白羽肉雞各組織中ACE2基因表達(dá)

2.2 白羽肉雞ACE2全基因擴(kuò)增

取白羽肉雞空腸組織反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果有單一條帶出現(xiàn)，與預(yù)期(2 444 bp)大小一致。

M. DNA Maker；1～4.白羽肉雞空腸；5.陰性對照；6. 18S rRNA基因

圖2 ACE2全基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 白羽肉雞ACE2基因克隆結(jié)果

對目的片段進(jìn)行回收后連接到pMD-19T，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，再涂布到含Amp/IPTG/X-gal的LB平板上，形成了單克隆菌落。挑選2個陽性菌落進(jìn)行PCR驗證，結(jié)果在2 000-3 000 bp之間有單一條帶(圖3)。PCR鑒定插入載體的片段大小與PCR擴(kuò)增片段一致。提示陽性菌落中目的片段插入成功。

M. DNA Maker;1～2. pMD-19T-ACE2-陽性菌落;3. 陰性對照

圖3 菌液PCR擴(kuò)增ACE2基因

酶切驗證結(jié)果如圖4所示。HindⅢ單酶切后發(fā)現(xiàn)有1條5 136 bp左右的條帶，大小與pMD-19T載體(2 692 bp)和目的基因(2 444 bp)總和一致；BamHⅠ、HindⅢ雙酶切可見2 444 bp和2 692 bp左右兩條帶。此結(jié)果證實已成功構(gòu)建pMD-19T-ACE2重組載體。

M. DNA Maker;1、4. pMD-19T-ACE2重組質(zhì)粒;2、5. pMD-19T-ACE2重組質(zhì)粒單酶切;3、6. pMD-19T-ACE2重組質(zhì)粒雙酶切

圖4 pMD-19T-ACE2重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.4 白羽肉雞ACE2基因的測序

利用Sanger測序法對陽性質(zhì)粒進(jìn)行正反兩個方向的序列測定，測序由上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。測序結(jié)果表明本試驗所克隆白羽肉雞ACE2基因全長核苷酸序列為2 444 bp，與預(yù)期結(jié)果大小一致，表明克隆成功。測序結(jié)果已登錄GenBank，登錄號為MK560199。

2.5 白羽肉雞ACE2基因的生物信息學(xué)分析

2.5.1 開放閱讀框分析

通過ORF Finder分析表明，該ACE2基因ORF長度為2 427 bp，編碼808個氨基酸。與GenBank上提供的人、褐家鼠(805個氨基酸)的ACE2氨基酸相差3個，與牛、羊(804個氨基酸)相差4個氨基酸。

進(jìn)一步對ACE2基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白羽肉雞ACE2基因編碼的蛋白質(zhì)含有20種氨基酸 (圖5)，其中Leu (8.3%) 含量最高，其次Glu (7.9%)、Ala (7.8%)含量較高，Cys (1.2%)較少。

圖5 白羽肉雞ACE2基因編碼蛋白質(zhì)氨基酸組成

2.5.2 序列同源性分析

ACE2基因序列比對結(jié)果如表3。

表3 白羽肉雞ACE2基因同源性分析結(jié)果

物種GenBank登錄號同源性/%雞(Partial Gallusgallus)GQ262780.199紅原雞(Prediction Gallusgallus)XM-416822.599中華田園犬(Canislupusfamiliaris)NM-001165260.169中國獼猴(Macacamulatta)FJ170098.169薩能奶山羊(Caprahircus)NM-001290107.168家貓(Feliscatus)NM-001039456.168京都種大鼠(Rattusnorvegicus)NM-001012006.168斑馬魚(Daniorerio)NM-001007297.156人(Homosapiens)NM-021804.250

本試驗選用白羽肉雞基因序列與GenBank上已有的雞的ACE2部分序列和預(yù)測序列同源性都為99%。與薩能奶山羊、家貓、中華田園犬、中國獼猴、人、斑馬魚和京都種大鼠的同源性分別在51%～69%，與人的同源性最低為50%。

2.5.3 氨基酸序列同源性分析及分子進(jìn)化分析

運(yùn)用DNAStar軟件中MegAlign模塊，將克隆的白羽肉雞ACE2氨基酸序列與GenBank上收錄的其他動物的氨基酸的序列進(jìn)行同源性分析。氨基酸序列比對結(jié)果如圖6，其與GenBank上收錄及預(yù)測的2個雞的序列同源性分別是99.9%和98.8%。與牛、山羊、家貓、家犬、兔、獼猴、人、斑馬魚和褐家鼠的同源性分別在59%～67%，與牛、山羊的同源性最低，為7.5%和8.3%。

利用MegAlign軟件繪制遺傳進(jìn)化樹進(jìn)行親緣性分析。結(jié)果如圖7顯示，該片段與家豬氨基酸序列處于同一進(jìn)化群中，與牛和山羊處于完全不同的兩個分支中，與氨基酸進(jìn)化結(jié)果一致。

圖6 白羽肉雞ACE2氨基酸同源性分析

圖7 白羽肉雞ACE2基因序列分子進(jìn)化分析

2.6 白羽肉雞ACE2基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

2.6.1 編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

白羽肉雞ACE2基因編碼蛋白質(zhì)由808個氨基酸殘基組成，其分子式為C4169H6339N1101O1242S37，分子量為92 942.05，理論pI 為5.17，說明該蛋白質(zhì)為酸性蛋白質(zhì)。預(yù)測該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為40.48，大于40，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu=109)大于帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys=81)，其摩爾消光系數(shù)為185 235 L/(mol·cm)，1A(280)=1.993mg/mL，pH為7時，帶電量為5.166，親水性的平均值為-0.417，比值為負(fù)值，推測該ACE2為親水性蛋白質(zhì)。

2.6.2 白羽肉雞ACE2蛋白親水性/疏水性分析

利用在線軟件進(jìn)行白羽肉雞ACE2蛋白親水性/疏水性分析，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)存在較多的親水性區(qū)域，較少的疏水性區(qū)域，但其中親水性較高的區(qū)域主要集中在Met1-Gln18和Thr740-Thr763，疏水性較高的區(qū)域主要集中在Ile155-Tyr251和Gly764-Phe808。

2.6.3 ACE2編碼蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽分析

利用TMHMM在線軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析，該白羽肉雞ACE2蛋白屬于Ⅰ型跨膜蛋白，同已鑒定的人、羊等ACE2蛋白一致。其中第1-739氨基酸為胞外部分，第740-762氨基酸之間有一個跨膜螺旋，第763-805氨基酸為胞內(nèi)部分。

利用SignalP在線軟件進(jìn)行信號肽分析，預(yù)測第17-18氨基酸之間存在潛在的裂解位點，且該蛋白為分泌蛋白，信號肽區(qū)域在第1-17氨基酸之間。

2.7 蛋白質(zhì)磷酸化分析

利用NetPhos2.0Server對ACE2基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化位點預(yù)測，白羽肉雞ACE2蛋白質(zhì)有87處磷酸化位點，其中較多的是Thr(32處，36.78%)和Ser(37處，42.63%)，Tyr18處，20.69%)。

2.8 蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

利用Phyre2.0軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖8顯示，白羽肉雞ACE2蛋白質(zhì)序列與c2c6nA(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶)模板序列覆蓋率高達(dá)74%，該蛋白質(zhì)存在較多的扭曲，結(jié)構(gòu)較為豐富，該結(jié)果同時也表明了白羽肉雞ACE2由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測一致。

A. ACE2編碼蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測構(gòu)象圖；B. A圖旋轉(zhuǎn)180°所得構(gòu)象圖

圖8 白羽肉雞ACE2編碼蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

2000年，Donghuee等[1]首先從心力衰竭患者的cDNA文庫中通過轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的方法擴(kuò)增出ACE2基因全長，由2 418個核苷酸組成，編碼805個氨基酸，自此開始了ACE2的多方面研究。已經(jīng) 證實ACE2作為腎素 血管緊張素(renin-angiotensinsystem, RAS)系統(tǒng)的負(fù)調(diào)節(jié)分子，通過靶向降解AngⅡ，發(fā)揮抗損傷、抗纖維化等機(jī)體保護(hù)功能[7]；而且作為急性嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)主要功能性受體，具有保護(hù)肺損傷的功能[8-9]，ACE2還在協(xié)同氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)，與氨基酸吸收不良、腸道微生態(tài)平衡和胃腸道炎癥發(fā)揮重要作用[10]。ACE2的作用及其應(yīng)用引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，已成為人醫(yī)臨床研究的一個熱點和前沿領(lǐng)域。

目前 ，ACE2的研究主要集中在人、小鼠、大鼠、貓、綿羊、豬以及斑馬魚等多種哺乳動物及水生動物，但是在家禽白羽肉雞方面的研究未見報道。 本研究以白羽肉雞為研究對象，應(yīng)用RT-PCR檢測ACE2在白羽肉雞上分布，證實其在 腎臟、十二指腸、回腸、盲腸、空腸組織有存在。

有關(guān)ACE2基因及其功能方面的研究在動物上的起步較晚，GenBank上缺乏動物ACE2基因的基本信息資料。2009年，香港大學(xué)研究者在GenBank上第一次登錄了野豬ACE2的 mRNA序列，基因全長為2 361 bp，編碼786個氨基酸，基因序列編號為GQ262781[11]。2010年，Tseng等[12]克隆出長白豬的ACE2基因。2015年，楊維維等[13]從山羊腎臟中克隆出ACE2基因全長，大小2 415 bp，編碼805個氨基酸，序列登錄號為KF921008.1。通過序列分析發(fā)現(xiàn)山羊ACE2蛋白屬于Ⅰ型跨膜蛋白，且具有分泌性，其信號肽序列位于第1-18氨基酸之間。2018年肖航[14]對斷奶仔豬ACE2基因序列進(jìn)行了克隆，發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬ACE2全基因序列為2 418 bp，編碼805個氨基酸。通過跨膜螺旋分析及蛋白信號肽區(qū)域預(yù)測顯示斷奶仔豬ACE2蛋白也屬于Ⅰ型跨膜分泌性蛋白，其信號肽序列位于第1-17氨基酸之間。本研究對白羽肉雞的ACE2基因進(jìn)行了克隆，全基因序列分析顯示，CDS區(qū)由2 444個堿基對組成，共編碼808個氨基酸，得到的ACE2序列已提交到GenBank(登錄號為MK560199)。進(jìn)一步生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的產(chǎn)物中親水性氨基酸占比較大，總體表現(xiàn)為疏水性。通過信號肽預(yù)測表明，白羽肉雞ACE2蛋白信號肽在1-17氨基酸之間，屬于分泌性蛋白，有1個跨膜結(jié)構(gòu)域，這與楊維維等[13]對山羊及肖航等[14]對斷奶仔豬ACE2研究分析得出的結(jié)果一致。

通過對蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)分析預(yù)測，該基因編碼產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊比率比較大，分別為48.62%和33.95%；無規(guī)則卷曲占比較小，為17.43%。在分子進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該片段與家豬氨基酸序列處于同一進(jìn)化群中，與牛和山羊處于完全不同的兩個分支中，與氨基酸進(jìn)化結(jié)果一致。細(xì)胞內(nèi)分布發(fā)現(xiàn)該白羽肉雞ACE2主要在細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)作用，同時具有較長的半衰期和不穩(wěn)定系數(shù)，編碼的產(chǎn)物總體表現(xiàn)為不穩(wěn)定的蛋白。通過蛋白修飾的磷酸化、糖基化分析預(yù)測，整條多肽鏈共有87個磷酸化位點，無O-糖基化位點，主要是N-糖基化位點。

綜上，本研究首次對中國白羽肉雞ACE2分布進(jìn)行了探討，通過克隆等分子生物學(xué)技術(shù)獲得白羽肉雞ACE2基因全長序列，并對其基因結(jié)構(gòu)、核苷酸及氨基酸組成、蛋白特性等進(jìn)行了預(yù)測分析，為ACE2在白羽肉雞及禽類方面的研究提供了基礎(chǔ)資料。