徐一超，金一，孟楊

(延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133000)

膽固醇作為膜功能的調(diào)節(jié)劑起著多重作用[1]，影響膜的流動性[2]和滲透性[3]。它還降低了膜所轉(zhuǎn)換的溫度，使膜保持在流體狀態(tài)，從而減少了低溫時可能發(fā)生的損傷[4]。據(jù)報道，高膜膽固醇水平會降低低溫下的膜結(jié)晶，從而通過減少結(jié)構(gòu)之間的自由度和精子表面蛋白的生物活性來抑制間接獲能[5]。

β-環(huán)瑚精是由7個葡萄糖殘基以α-1，4糖苷鍵連接而成的呈桶型立體結(jié)構(gòu)的環(huán)狀低聚糖。β-環(huán)糊精分子中葡萄糖單位是以椅式構(gòu)象存在，所有C6上伯醇羥基都位于穴洞外面的下邊緣，其他各種醇羥基都位于穴洞外面的上邊緣。所以，β-環(huán)糊精分子結(jié)構(gòu)中穴洞外邊緣具有親水性，穴洞內(nèi)壁為氫原子和糖苷鍵氧原子，具有疏水性，所以能和膽固醇等多種物質(zhì)形成包合物。

包埋膽固醇的甲基-β-環(huán)糊精(cholesterol-loaded cyclodextrin，CLC)由于膽固醇的生物學功能，充當冷凍保護劑能提高凍融精子的各項特性，以往的研究表明 CLC補充劑對質(zhì)膜完整性，活力以及頂體完整性的起到一定的保護作用[6]。然而，有關 CLC對蛋白的酪氨酸磷酸化水平和細胞凋亡的影響的論文未見報道。因此，在本研究皆在探討CLC對凍融牛精子獲能狀態(tài)及抗氧化、抗凋亡能力的影響。

1 材料與方法

1.1 精液來源

試驗選擇西門塔爾公牛精液，精液樣本均來自于延吉市犇福種公牛場，精液凍精容量為0.25 mL。

1.2 試劑

CLC、果糖、葡萄糖、丙酮酸鈉、慶大霉素由Sigma公司生產(chǎn)；RIPA、PMSF、動物組織總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒由碧云天生物技術研究公司生產(chǎn),其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 精子稀釋液配制

用電子天平準確稱取檸檬酸鈉、Tris、葡萄糖、蛋黃、甘油，并加入雙抗，均勻在38 ℃水浴鍋預熱，備用。

1.4 精子解凍

將裝有精液的麥管放置到提前預熱的38 ℃水浴鍋中解凍40 s，取出以備后續(xù)試驗使用。

1.5 精子品質(zhì)檢測

1.5.1 精子CASA檢測

將解凍后的精子樣本放在倒置顯微鏡下，通過精子CASA儀檢測精子活力及其他活力指標。

1.5.2 精子質(zhì)膜完整性檢測

精子冷凍-解凍后，進行低滲腫脹法(HOST法)檢測，精子樣本置于37 ℃的低滲溶液中，在恒溫培育箱培育30 min，取10 μL精子懸浮液滴加到血細胞計數(shù)板上記錄尾部彎曲的精子數(shù)量百分比，隨機選擇200個以上精子，重復5次。

1.5.3 精子頂體膜完整性檢測

精子冷凍-解凍后，進行考馬斯亮藍染色法檢測，將樣本精液滴到載玻片上均勻涂開，用考馬斯亮藍染液均勻覆蓋在涂有精液樣本的載玻片上，在常溫環(huán)境下避光染色30 min后，用蒸餾水洗去多余染液，自然烘干后放在顯微鏡下記錄頂體完整的精子數(shù)量百分比，隨機選擇200個以上精子，重復5次。

1.6 蛋白免疫印記

將解凍后的精子用RIPA及PMSF裂解充分，并提取出總蛋白樣本。同時進行SDSPAGE電泳，把所得蛋白條帶轉(zhuǎn)膜到PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后用TBST緩沖液清洗3遍(每次10 min)，用脫脂奶粉緩沖液封閉2 h。隨機再用TBST清洗3遍(每次10 min)加入抗磷酸酪氨酸抗體，4 ℃孵育過夜，棄掉一抗廢液，TBST清洗3遍每次10 min；加入羊抗鼠IgG HRP，在室溫搖床孵育2 h，棄掉二抗廢液，TBST清洗3遍每次10 min。將ECL顯影試劑均勻覆蓋在膜上，放入數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)中，成像拍照。

1.7 PCR檢測

將冷凍-解凍后的精子樣本按照動物組織總RNA提取試劑盒說明提取RNA，(表1為目的基因與內(nèi)參GAPDH引物序列)。再將RNA樣本反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進行PCR擴增，擴增體系為2×TaqPCR MasterMix 6.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 4 μL，擴增程序為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s與72 ℃延伸30 s進行40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；最后溫度到達4 ℃。結(jié)束后取5 μL PCR擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 目的基因與內(nèi)參GAPDH引物序列

基因引物(5′→3′)大小/bp退火溫度/℃CAT-FAGTCCTGCTCCCTGTTGTTCAT-RTACCGTGCCAGTCCCTAGT10756GPx-FAGTCCTGCTCCCTGTTGTTGPx-RGGAGGACAGGTTGAAGGGC13160GAPDH-FCTGGTGCTGAGTATGTGGTGAPDH-RCAATCTTGAGGGTGTTGTT9156SOD-FTAGACACAGAAAACAAACTSOD=RCACATACACACTCACTCAC21560Caspase-3-FCAGTGGTGCTGAGGATGACCaspase-3-RCACAAAGAGCCTGGATGAA13756Caspase-8-FCTGCCCTCAAGTTCCTAAGCaspase-8-RGTTTTCCTCCAACATTCTC11356BAX-FTAGACACAGAAAACAAACTBAX-RCACATACACACTCACTCAC21555

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本次試驗的結(jié)果采用Image J軟件進行檢測與分析。 PCR的試驗結(jié)果采用LANE軟件進行分析與檢測。所有的數(shù)據(jù)均使用SPSS19軟件進行分析，利用方差分析進行多重比較檢驗數(shù)據(jù)的差異性，P<0.05表示差異顯著。試驗數(shù)據(jù)均采用X±SD進行表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的CLC對凍融精子質(zhì)量的影響

表2所示，在冷凍保護劑中添加不同濃度CLC(0、0.5、1、1.5及2 mg/mL )，處理組與對照組之間以及處理組之間的精子的活率、質(zhì)膜完整性及頂體膜完整性均無顯著差異(P<0.05)。

表2 CLC對凍融牛精子質(zhì)量參數(shù)的影響

質(zhì)量參數(shù)對照組CLC(mg/mL)處理組0.511.52精子活力/%88.37±2.1289.02±2.8388.67±1.6187.88±2.4488.06±2.39質(zhì)膜完整性/%64.87±0.4565.31±1.5765.02±0.2164.35±2.1764.82±1.37頂體完整性/%65.23±2.0265.71±1.4065.42±0.7064.82±1.3764.39±3.10

2.2 添加不同濃度CLC處理組對凍融牛精蛋白的酪氨酸磷酸化水平的影響

將6個不同處理組(冷凍-解凍非獲能、冷凍-解凍獲能、0.5、1.0、1.5及2.0 mg/mL CLC)的蛋白進行 Western blot分析，分別運用酪氨酸磷酸化一抗與酶標二抗進行孵育之后，得出(如圖1A)顯示，分子量大約在32 KDa處出現(xiàn)了蛋白條帶，將蛋白條帶進行分析，制出酪氨酸磷酸化水平的條帶灰度值(如圖1B)，0.5 mg/mL CLC處理組精子蛋白的酪氨酸磷酸化水平與凍融后獲能對照組的水平最為相近。

注：不同小寫字母表示差異顯著。下同

圖1 CLC素對凍融牛精子體外獲能的影響

2.3 不同濃度的CLC處理組對凍融牛精子抗氧化基因表達量的影響

將添加了不同濃度CLC進行冷凍保存的精子進行解凍之后，進行RNA的提取，然后進行PCR擴增和DNA電泳試驗。檢測精子內(nèi)的抗氧化基因CAT、GPX、SOD、GAPDH的表達量。圖2A為所得到的條帶，圖2B為抗氧化基因表達量的柱狀圖。從圖2結(jié)果中可以看出在添加不同濃度(0、0.5、1.0、1.5及2.0 mg/mL CLC)后保存的精子，經(jīng)過解凍之后，精子內(nèi)的抗氧化基因CAT、GPX、SOD、GAPDH的含量在處理組0.5 mg/mL CLC、1.0 mg/mL CLC和2.0 mg/mL 均顯著高于對照組(P<0.05)。添加1.5 mg/mL CLC組的精子中與對照組差異不顯著。

M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1～5. 0, 0.5, 1, 1.5, 2 mg/mL CLC

圖2 CLC對凍融后牛精子CAT、GPX和SODmRNA表達量的影響

2.4 不同濃度的CLC處理對凍融牛精子內(nèi)細胞凋亡的影響

將添加了不同濃度CLC進行冷凍保存的精子進行解凍之后，進行RNA的提取，然后進行PCR擴增和DNA電泳試驗。檢測精子內(nèi)的凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、BAX的表達量。圖3A為所得到的條帶，圖3B為凋亡基因相對表達量的柱狀圖。從圖三3結(jié)果中可以看出精子內(nèi)細胞凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、BAX的表達量顯著低于對照組(P<0.05)。也顯著低于1.5和2.0 mg/mL CLC處理組(P<0.05)。

M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1～5.0, 0.5, 1, 1.5, 2 mg/mL

圖3 CLC對凍融后牛精子Caspase-3，Caspase-8和BAXmRNA表達量的影響

3 討論

許多研究證明了CLC在冷凍保存過程中對精子的保護作用。CLC使膽固醇摻入精子膜，從而防止其在冷凍保存過程中丟失[7]。在本研究中，CLC的加入改善了精子活力，和精子百分比，在平衡和解凍后具有完整的頂體。目前關于CLC的有益作用支持了其他類似報道的結(jié)果[7，8-13]。此外，在冷凍保存的公牛，公羊和種馬精子中，已經(jīng)表明，當在冷凍前加入CLC時，膜的膽固醇含量增加2至3倍[7,9,12]。雖然，膽固醇改善精子冷凍存活的確切機制仍然未知，但增加膽固醇與磷脂的比例可能提高了對冷休克的抵抗力，減少了細胞成分的泄漏或抑制了鈣進入精子，從而減少了獲能[12]。

本次試驗中將0 、0.5、1、1.5及2 mg/mL的CLC添加到牛精液中，進行冷凍解凍之后，檢測與對照組間的精子質(zhì)量差異，繼續(xù)進行凍融后牛精子的活率、質(zhì)膜完整性、頂體膜完整性的檢測，從數(shù)據(jù)中可以看出，在冷凍解凍的過程中，在添加不同處理組(0、0.5、1、1.5 及2 mg/mL CLC)中的結(jié)果與對照組沒有明顯差異，由此可以證明 CLC對冷凍保存的牛精液沒有破壞性的作用，并且可以在一定的基礎上改善由于冷凍帶來的損傷，和在一定的程度上改善了精子受到的一系列損傷。

蛋白酪氨酸磷酸化是調(diào)節(jié)與獲能相關的事件的重要調(diào)節(jié)途徑。有研究表明，一種55 kDa的酪氨酸磷酸化蛋白與牛精子的運動性有關[14]。平衡后缺少p32蛋白的酪氨酸磷酸化和冷凍-解凍樣品中所述蛋白質(zhì)的高磷酸化率表明該特定蛋白質(zhì)在平衡過程中沒有作用，但當這種磷酸化條帶存在時總是發(fā)生獲能[15]，因此通過不同CLC處理組中p32的條帶強度的變化，進一步增強了上述調(diào)節(jié)酪氨酸磷酸化的可能性。從數(shù)據(jù)中可以看出，1.0 mg/mL CLC處理組精子蛋白的酪氨酸磷酸化水平最高，但與對照組無顯著差異，顯示出更接近新鮮精液的獲能狀態(tài)。說明在1.0 mg/mL CLC處理組精子發(fā)生獲能和“獲能樣”變化之后，蛋白的酪氨酸磷酸化水平有一定程度上的上升。

Zha等[16]試驗發(fā)現(xiàn)，在牛的卵母細胞中，為了能夠提高卵母細胞細胞質(zhì)的質(zhì)量，便通過向體外的成熟培養(yǎng)液中添加褪黑素，則GSH和ATP的濃度由顯著性的提高，與此同時，他們所檢測的抗氧化相關基因(SOD、CAT和GPx)mRNA的表達量也顯著的提高。本試驗選擇了CAT、GPX和SOD基因進行檢測。由試驗結(jié)果顯示，在處理組0.5 mg/mL、1 mg/mL CLC凍融牛精子內(nèi)的抗氧化基因的表達量均顯著高于對照組。1.5 mg/mL CLC處理組的凍融牛精子內(nèi)的抗氧化基因的表達量與對照組的表達量相接近，無顯著差異。

最近Men等[17]報道了使用熒光素FragEL DNA片段化的檢測和半胱天冬酶-3檢測冷凍-解凍的牛卵母細胞和胚胎中的細胞凋亡。Caspase-3被認為是存在于細胞質(zhì)中的主要蛋白酶。適當?shù)腃aspase級聯(lián)在精子的分化和睪丸的成熟中發(fā)揮著關鍵的作用。BAX屬于Bcl-2家族中的一份子，它參與細胞的凋亡。分析了不同CLC處理組與對照組之間的精子內(nèi)的凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、BAX的表達量，結(jié)果顯示0.5 mg/mL和1.0 mg/mL精子內(nèi)的凋亡基因顯著低于對照組和其他處理組。其中0.5 mg/mL處理組最低。說明細胞的凋亡程度降低，對精子的保護目的起到了作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明濃度為0.5～1.0 mg/mL CLC的凍融牛精子獲能處理后蛋白的酪氨酸磷酸化水平較正常，表明0.5～1.0 mg/mL CLC可以改善凍融后牛精子質(zhì)量。濃度為0.5～1.0 mg/mL CLC顯著提高了凍融后牛精子的抗氧化能力和顯著抑制了精子內(nèi)的細胞凋亡，對牛精子起到了保護作用。