李君，吳姣，權(quán)凱，候霞飛，楊芳慧，張景鋒，趙金艷，魏紅芳

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物科技學(xué)院，河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點實驗室，河南 鄭州 450046)

羊奶的乳脂肪球較小，更易被消化吸收，同時羊乳中還含有比較豐富的短、中鏈脂肪酸、不飽和脂肪酸和共軛亞油酸對人類動脈硬化、冠心病、肝硬化等疾病有良好的預(yù)防保健作用[1]，這些短、中鏈脂肪酸是羊奶特殊的營養(yǎng)價值來源，并且羊奶風(fēng)味品質(zhì)與乳脂含量和組成之間密切相關(guān)。因此，研究乳脂代謝調(diào)控對于提高羊奶品質(zhì)具有重要意義。

誘導(dǎo)細胞凋亡DNA片段化因子45樣效應(yīng)因子A(cell death-inducing DNA fragmentation factor 45-like effectors, CIDEa)是一類和脂類代謝緊密相關(guān)的蛋白，屬于CIDE家族成員之一，在參與調(diào)控脂類代謝過程中具有十分重要的作用[2]。CIDEa在脂肪細胞和肝細胞中參與調(diào)控多個脂代謝通路，包括脂解、脂滴的生長融合和極低密度脂蛋白的成熟[3-4]。Zhou等[5]研究發(fā)現(xiàn)在肝臟細胞系及小鼠肝臟中過表達CIDEa能夠明顯的促進脂類的積累。在牛妊娠以及哺乳期，其乳腺組織中CIDEa基因的mRNA 水平高度表達[6]。Wang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，CIDEa在雌性小鼠懷孕以及哺乳期的乳腺組織中高度表達，CIDEa缺失小鼠乳汁中脂類的含量明顯下降，導(dǎo)致新生小鼠不能正常發(fā)育。這些研究結(jié)果說明CIDEa在乳腺組織中參與調(diào)控脂質(zhì)代謝，但是關(guān)于奶山羊CIDFEa在乳脂代謝方面的功能還不清楚。本研究旨在克隆奶山羊CIDEa基因編碼區(qū)序列，并進行生物信息學(xué)分析，檢測CIDEa基因在泌乳期和干奶期乳腺組織中的表達量，為初步探討CIDEa基因在奶山羊乳腺組織中的功能及對羊乳品質(zhì)的調(diào)控作用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

試驗動物來自河南西峽縣奶山羊場，選用體況良好，胎次相同，泌乳天數(shù)相近的河南奶山羊3只，分別采集泌乳前期(15 d)、盛期(90 d)、中期(120 d)和干奶期(330 d)的乳腺組織各1 g。用DEPC滅菌水反復(fù)清洗后，迅速放入已含有Trizol試劑的無RNase的離心管中，投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Trizol 購自美國Invitrogen公司，DEPC購自美國Sigma公司；DNA分子標(biāo)準、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、pMD-19T載體、大腸桿菌(E.coli)TOP 10 感受態(tài)細胞均購自北京天根生化科技有限公司；T4 DNA 連接酶、DNA 限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT Reagent Kit、LA Taq DNA 聚合酶和實時定量試劑盒均購自寶生物工程大連有限公司(TaKaRa)。

1.3 引物設(shè)計

通過對GenBank中綿羊(XM_004020511)和牛(NM_001083449)等物種的CIDEa基因進行同源性比對，利用Primer Premier 5.0軟件在保守區(qū)域設(shè)計特異性克隆引物，上游引物序列：5′-GGACCGAGCGATGGAGAC-3′；下游引物序列：5′-AGCAGGTGATGCTGGTGGGAAC-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 RNA提取與cDNA的合成

采用Trizol一步法提取羊乳腺組織總RNA，具體操作步驟按照說明書操作進行。按照TaKaRa公司PrimeScript?RT reagent Kit說明書進行操作，將檢測合格的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5 PCR擴增

對CIDEa基因進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行34個循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min，12 ℃進行保存。反應(yīng)結(jié)束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將檢測正確的目的片段進行瓊脂糖凝膠回收，PCR回收產(chǎn)物與pMD19-T載體進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，進行藍白斑篩選，挑取多個白色菌落擴繁提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒進行測序。

1.6 生物信息學(xué)分析

奶山羊CIDEa與不同物種間序列比對方法及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測參照文獻[7-8]。利用NCBI中的Blastn和Blastp(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 對測序得到的CIDEa基因與其他物種的核苷酸及其編碼的氨基酸序列進行同源性分析；通過BioXM2.6軟件對CIDEa的核苷酸序列進行多物種間序列比對；利用ProtParm在線程序(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)對奶山羊CIDEa蛋白利用SignalP在線程序進行理化參數(shù)分析；用TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線預(yù)測CIDEa的跨膜結(jié)構(gòu)；利用ProScale在線程序(http://web.expasy.org/protscale/)對CIDEa基因的蛋白質(zhì)疏水性進行分析；利用PSPRTⅡ Prediction在線網(wǎng)站(http://psort.hgc.jp/form2.html)預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細胞定位；利用Phyre2(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)對CIDEa基因的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析。

1.7 熒光定量PCR

試驗以GAPDH為內(nèi)參基因，每個模板設(shè)置三個加樣重復(fù)，PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex Taq Mix 10.0 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物 (10 μmol/L) 各0.8 μL，加RNase free H2O補足20 μL體系。于ABI 7500熒光定量PCR儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；添加熔解曲線。采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行分析，其中兩個內(nèi)參基因Ct值取幾何平均數(shù)，然后按照ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參；ΔΔCt=ΔCt試驗組-ΔCt對照組計算分析。所用到的基因?qū)崟r定量引物如表1。

表1 實時定量PCR引物序列

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準差”進行分析，利用SPSS22.0方差檢驗進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 奶山羊CIDEa基因PCR擴增與序列分析

如圖1所示，從奶山羊乳腺組織組織中擴增得到大小為764 bp的片段。序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼區(qū)序列為660 bp，編碼219個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker;1.奶山羊CIDEa基因PCR擴增產(chǎn)物

圖2 奶山羊CIDEa基因編碼區(qū)核苷酸序列和預(yù)測氨基酸序列

2.2 奶山羊CIDEa基因的同源性分析

奶山羊CIDEa基因的序列分別與GenBank中綿羊(XM_004020511)、牛(NM_001083449)、豬(NM_001112696)和人(NM_001279)等物種的CIDEa基因序列進行比對，結(jié)果表明，奶山羊CIDEa基因編碼區(qū)核苷酸序列與綿羊、牛、豬和人等物種的的同源性分別為99%、96%、85%、85%；與綿羊(XP_004020560.1)、牛(NP_001076918.1)、豬(NP_001106166.1)和人(NP_001270.1)等物種的CIDEa編碼氨基酸序列的同源性為99%、96%、84%和80%。

2.3 奶山羊CIDEa蛋白理化性質(zhì)及一級結(jié)構(gòu)分析

對奶山羊CIDEa基因CDS編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果顯示，其蛋白質(zhì)分子量為24.408 kD，理論等電PI為9.27，屬于堿性蛋白；總原子數(shù)為3441，分子式為C1077H1732N306O312S14；消光系數(shù)為18700；帶負電荷的天冬氨酸和谷氨酰胺這兩個氨基酸殘基共有20個，帶正電荷的精氨酸和賴氨酸這兩個氨基酸殘基共有26個；編碼氨基酸的不穩(wěn)定性指數(shù)為58.89，說明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白；體外蛋白半衰期為30 h；脂溶指數(shù)為84.11，說明該蛋白的流動性較好；蛋白疏水性分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，最大值為1.789，最小值為-2.9，分別位于第69位脯氨酸和第44 位精氨酸處，平均親水性為-0.169，整個蛋白表現(xiàn)出高度的親水性。

圖3 CIDEa蛋白疏水性分析

對CIDEa編碼的氨基酸組成進行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白由20種氨基酸組成(表2)，其中亮氨酸、蘇氨酸和纈氨酸、精氨酸和絲氨酸含量較高，分別占11.9%、8.2%、7.3%；色氨酸的含量最低，只占1.0%；不含吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸。

表2 奶山羊CIDEa蛋白的氨基酸組成

氨基酸名稱縮寫數(shù)量(個)比率(%)丙氨酸A156.8精氨酸R167.3天冬氨酰N31.4天冬氨酸D94.1半胱氨酸C41.8谷氨酰胺Q104.6谷氨酸E115.0甘氨酸G156.8組氨酸H73.2異亮氨酸I41.8亮氨酸L2611.9賴氨酸K104.6甲硫氨酸M104.6苯丙氨酸F83.7脯氨酸P125.5絲氨酸S167.3蘇氨酸T188.2色氨酸W20.9酪氨酸Y52.3纈氨酸V188.2吡咯賴氨酸O00.0硒半胱氨酸U00.0

2.4 奶山羊CIDEa蛋白信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用TMHMM和SignalP 4.1在線軟件對奶山羊CIDEa蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)分析和信號肽分析(圖4,5)，該蛋白不存在跨膜域及信號肽，故此蛋白不屬于跨膜蛋白及分泌蛋白。

圖4 CIDEa蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖5 CIDEa蛋白信號肽預(yù)測

2.5 奶山羊CIDEa蛋白亞細胞定位預(yù)測

采用PSPRTⅡ Prediction在線軟件預(yù)測奶山羊CIDEa蛋白亞細胞定位，結(jié)果表明，其蛋白定位于細胞質(zhì)、線粒體、細胞核、液泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的比例分別為47.8%、26.1%、17.4%、4.3%和4.3%，說明CIDEa蛋白主要分布于細胞質(zhì)。

2.6 奶山羊CIDEa蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用Phyre2在線預(yù)測得到奶山羊CIDEa蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)(圖6)，CIDEa蛋白結(jié)構(gòu)主要由2個α-螺旋和4個β-折疊組成，此外還有部分的無規(guī)則卷曲。

圖6 奶山羊CIDEa蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.7 奶山羊CIDEa泌乳期和干奶期乳腺組織表達分析

以GAPDH為內(nèi)參基因，通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測奶山羊CIDEa基因在不同泌乳時期乳腺組織的mRNA表達量。結(jié)果表明，CIDEa基因在泌乳前期、盛期和中期的mRNA表達量均顯著高于干奶期(P<0.05)(圖7)，然而，CIDEa基因在泌乳前期、盛期和中期的表達量沒有顯著差異(P>0.05)。

圖7CIDEa基因在奶山羊不同泌乳時期乳腺組織中的相對表達量

3 討論

CIDEa基因?qū)儆诩毎劳稣T導(dǎo)因子a家族，最初報道它的功能與caspase依賴的細胞凋亡以及DNA斷裂有關(guān)。近年來關(guān)于CIDEa蛋白的研究主要集中在脂代謝方面。CIDE家族共有三個蛋白分別是CIDEa、CIDEb和CIDEc。CIDEa和CIDEc主要在脂肪組織的脂類穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，而CIDEb主要在肝臟中發(fā)揮作用。CIDEa蛋白可促進野生型小鼠體內(nèi)的脂肪沉積[9]，敲除CIDEa基因的小鼠，脂肪分解速度加快，大脂滴減少而小脂滴增加，體內(nèi)脂肪積累減少，體重減輕[10]。Wang等[4]研究表明CIDEa調(diào)控小鼠乳脂滴的大小和分泌。在牛的泌乳期乳腺組織中CIDEa表達顯著高于干奶期和非妊娠期，并且胰島素和飽和脂肪酸可調(diào)控CIDEa的表達[6]。說明CIDEa基因參與乳腺的脂質(zhì)代謝過程。本試驗為研究CIDEa基因在奶山羊乳腺中的功能，根據(jù)已發(fā)表的綿羊CIDEa基因序列設(shè)計引物，采用PCR方法擴增得到奶山羊CIDEa基因的完整編碼區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)奶山羊CIDEa基因開放閱讀框長660 bp，可編碼219個氨基酸，奶山羊CIDEa基因的成功克隆，為進一步研究CIDEa基因在奶山羊乳脂代謝方面的功能提供依據(jù)。

利用生物信息學(xué)軟件分析基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，能為進一步研究基因功能做導(dǎo)向。在本研究中，通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)奶山羊CIDEa蛋白是一個不穩(wěn)定的堿性蛋白，通過疏水性分析和理化參數(shù)分析得到CIDEa蛋白是親水性蛋白。不同物種間CIDEa基因及其編碼序列比對發(fā)現(xiàn)，奶山羊與牛和綿羊之間同源性較高，與人和豬同源性較低。提示在反芻動物中CIDEa基因進化比較保守，但其蛋白功能是否存在差異還需要進一步的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，奶山羊CIDEa蛋白不屬于跨膜蛋白和分泌蛋白。亞細胞定位表明，奶山羊CIDEa蛋白主要分布在細胞質(zhì)、線粒體上和細胞核上，少部分分布在液泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。前人研究表明，CIDEa蛋白定位于脂滴表面及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[11,12]和細胞核內(nèi)[4]，可促進小鼠體內(nèi)的脂肪擴張與沉積[9]，有研究表明 CIDEa 蛋白C端104個氨基酸對其脂滴定位非常重要[13]。Zhou等[14]研究發(fā)現(xiàn)CIDEa與線粒體特異的標(biāo)志蛋白Ucp1共定位，說明CIDEa定位于線粒體上，并且通過與UCP1直接或間接相互作用形成一個復(fù)合體，參與能量代謝。本研究中對奶山羊CIDEa蛋白的亞細胞定位結(jié)果預(yù)測與前人研究結(jié)果一致，對奶山羊CIDEa蛋白進行生物學(xué)預(yù)測和分析，為深入研究奶山羊CIDEa基因的功能提供理論依據(jù)。

CIDEa在多種組織中廣泛表達，在小腸、肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、腎臟等組織中均有表達，其中在脂肪組織中表達最高[15-16]。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)CIDEa在豬脂肪組織中高量表達、在淋巴組織中大量表達；另外，CIDEa在脾、肺、腎、肝、腦和胃中較多量表達，在小腸、肌肉和心臟中微量表達。黃柳梅[15]報道CIDEa基因在肉雞的各組織中廣泛表達，且表達豐度相差較大，在脂肪組織中的表達量最高。CIDEa在小鼠妊娠以及哺乳期的乳腺組織中高度表達[4]，在牛的泌乳期乳腺組織中CIDEa表達明顯高于干奶期和非妊娠期[6]。本研究通過實時熒光定量PCR檢測CIDEa在奶山羊不同泌乳時期乳腺組織中的mRNA表達量，結(jié)果表明奶山羊CIDEa基因在泌乳期乳腺組織中的表達量均顯著高于干奶期。本試驗結(jié)果與前人研究結(jié)果相符。這些結(jié)果表明CIDEa基因可能參與調(diào)控乳腺組織中的乳脂代謝。研究報道CIDEa受到轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，CIDEa的啟動子含有PPARα和PPARγ的應(yīng)答元件，能夠被PPARs的激動劑激活[17]。PGC1α能夠激活CIDEa的轉(zhuǎn)錄，而RIP140能夠抑制這一過程[18]。而PPARγ和SREBP1c是經(jīng)證實的參與奶山羊乳脂代謝調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，關(guān)于CIDEa基因在奶山羊乳腺組織中的功能及對乳脂代謝的調(diào)控機制還需要進一步的深入研究。

4 結(jié)論

本試驗成功克隆奶山羊CIDEa基因CDS區(qū)660 bp的序列，編碼219個氨基酸；生物信息學(xué)分析表明，該編碼序列與綿羊、牛、豬和人的核苷酸同源性分別為99%、96%、85%和85%；CIDEa蛋白屬于堿性、不穩(wěn)定、親水蛋白質(zhì)，主要分布在細胞質(zhì)、線粒體和細胞核，不存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽；CIDEa基因在奶山羊泌乳期(前期、盛期和中期)的乳腺組織中表達量顯著高于干奶期，表明CIDEa基因可能參與奶山羊乳脂代謝過程，為進一步改善羊奶品質(zhì)提供理論依據(jù)。