孫明忠，居會(huì)祥，陳紅梅，周中衛(wèi)，季禹喬，江冬梅 (東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城醫(yī)院，.檢驗(yàn)科，.內(nèi)分泌科，江蘇鹽城 224001)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者病理變化為胰島素抵抗伴代謝紊亂，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而形成動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)[1]。在此過程中，單核細(xì)胞通過細(xì)胞表面清道夫受體CD36攝取氧化型低密度脂蛋白(oxidized LDL，oxLDL)[2]，促進(jìn)單核細(xì)胞分泌脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2, Lp-PLA2)[3]，水解低密度脂蛋白上的氧化卵磷脂，生成氧化游離脂肪酸和溶血卵磷脂，參與As形成[4]。單核細(xì)胞基于CD14和CD16表達(dá)分為經(jīng)典型CD14++CD16-、中間型CD14++CD16+和非經(jīng)典型CD14+CD16++，3個(gè)亞群在T2DM疾病過程中具有不同的功能[5]。本課題組前期研究表明，T2DM患者單核細(xì)胞向中間型和非經(jīng)典型極化，且高表達(dá)Lp-PLA2[6]。但CD36在3個(gè)亞群表達(dá)及其促進(jìn)Lp-PLA2分泌功能的差異缺乏研究。本研究分析T2DM患者外周血單核細(xì)胞3個(gè)亞群CD36表達(dá)，并檢測(cè)其活化后細(xì)胞分泌Lp-PLA2的功能，從而探討其在T2DM疾病過程中促進(jìn)As的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 選擇2018年1—11月在鹽城市第三人民醫(yī)院就診的T2DM患者50例，根據(jù)是否合并頸動(dòng)脈病變分為單純糖尿病組(n=26)和合并頸動(dòng)脈病變組(n=24)。其中，男性26例，女性24例，年齡(45.6±7.9)歲，T2DM符合《中國2型糖尿病防治指南(2010版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并各種急慢性感染、自身免疫病、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、外傷患者。同時(shí)選擇年齡、性別相匹配的健康人26例作為健康人對(duì)照組(HC組)，其中，男性14例，女性12例，年齡(44.5±8.2)歲。本研究經(jīng)研究對(duì)象書面同意和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：倫研2017-04)。頸總As采用超聲診斷儀檢測(cè)，探頭頻率7.5 MHz，測(cè)量頸動(dòng)脈分叉部動(dòng)脈中膜厚度，兩側(cè)各2個(gè)點(diǎn)，取均值。動(dòng)脈中膜厚度>0.9 mm或頸動(dòng)脈斑塊形成診斷為As病變。

1.2試劑和儀器 藻紅蛋白-鼠抗人CD36單克隆抗體(monoclonal antibodies，mAb)、葉綠素蛋白-cy5.5鼠抗人CD16 mAb和異硫氰酸熒光素-鼠抗人CD14 mAb(BD Biosciences公司)，DiI熒光探針標(biāo)記的氧化型LDL(DiI-ox-LDL)和oxLDL(美國Biomed Tech公司)，CD36 阻斷性抗體(Abcam公司)。7700生化分析儀及其配套血糖、血脂試劑(Beckman公司)，F(xiàn)icoll-Hypaque密度梯度試劑(上海西糖生物公司)，Aria Ⅱ流式細(xì)胞分析儀(美國BD公司)，化學(xué)發(fā)光法儀及配套Lp-PLA2試劑(諾爾曼公司)。

1.3標(biāo)本采集與處理 研究對(duì)象清晨空腹采集靜脈血10 mL，肝素鈉抗凝，其中2 mL經(jīng)離心收集血漿，檢測(cè)空腹血漿葡萄糖(FBG)、血脂(包括Lp-PLA2)等生化指標(biāo)，1 mL用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞亞群CD36平均熒光強(qiáng)度(MFI)，另外7 mL用于分選單核細(xì)胞亞群。

1.4單核細(xì)胞亞群CD36表達(dá)水平檢測(cè) 在100 μL肝素鈉抗凝靜脈血中加入10 μL 藻紅蛋白-鼠抗人CD36、10 μL 異硫氰酸熒光素-鼠抗人CD14和葉綠素蛋白-cy5.5鼠抗人CD16，避光溫育20 min，然后與500 μL紅細(xì)胞裂解液混勻溫育10 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌并重懸，終體積400 μL。流式細(xì)胞分析儀先選取單核細(xì)胞，根據(jù)其表面CD14和CD16，分為CD14++CD16-、CD14++CD16+和CD14+CD16++亞群，然后檢測(cè)各亞群細(xì)胞表面CD36 MFI，作為CD36表達(dá)水平。

1.5單核細(xì)胞亞群分選培養(yǎng)及誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞DiI-oxLDL攝取測(cè)定 采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離7 mL外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，然后在RPMI1640完全培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)4 h，去除不貼壁細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，收集單核細(xì)胞，用異硫氰酸熒光素-鼠抗人CD14和葉綠素蛋白-cy5.5鼠抗人CD16 mAb進(jìn)行細(xì)胞染色，隨后流式細(xì)胞儀基于細(xì)胞CD14和CD16表達(dá)分選收集3個(gè)單核細(xì)胞亞群，濃度為1×104/L，細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。分選的單核亞群細(xì)胞(1×104/mL)經(jīng)160 nmol/L佛波酯誘導(dǎo)48 h后，單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。去除培養(yǎng)上清液，加入不含有胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12 h，隨后加入30 μg/mL DiI-oxLDL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DiI MFI。DiI是一種親脂性熒光染料，進(jìn)入細(xì)胞膜后被激發(fā)后可發(fā)出橙紅色熒光。

1.6單核細(xì)胞亞群誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌Lp-PLA2測(cè)定 上述分選的單核細(xì)胞亞群誘導(dǎo)形成的巨噬細(xì)胞，不含有胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12 h，然后上清液中加入10 μg/mL CD36阻斷性抗體，37 ℃溫育1 h，棄上清液，分2組，一組為空白對(duì)照組，另一組加入100 μg/mL ox-LDL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后收集上清液，用熒光素增強(qiáng)免疫化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)Lp-PLA2濃度。

2 結(jié)果

2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞亞群CD36表達(dá)水平 與HC組相比，T2DM患者中間型單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)典型和非經(jīng)典型單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，結(jié)果見表1。

表1 T2DM患者單核細(xì)胞亞群表面CD36表達(dá)水平比較

注：*， T2DM組vs HC組，P<0.05。

2.2T2DM合并頸動(dòng)脈病變患者單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平比較 與單純糖尿病組相比，合并頸動(dòng)脈病變組中間型單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)典型和非經(jīng)典型單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，結(jié)果見表2。

表2 T2DM合并頸動(dòng)脈病變單核細(xì)胞亞群CD36表達(dá)水平比較

注：*，單純糖尿病組vs T2DM合并頸動(dòng)脈病變組，P<0.05。

2.3單核細(xì)胞亞群體外誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞攝取DiI-ox-LDL比較 與HC組相比，T2DM組中間型單核細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞攝取DiI-ox-LDL升高(n=25，等距隨機(jī)抽樣)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)典型和非經(jīng)典型單核細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞攝取DiI-ox-LDL差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見表3。

表3 單核細(xì)胞亞群體外攝取DiI-ox-LDL(MFI)比較

注：*，HC組vs T2DM組，P<0.05。

2.4T2DM患者單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平及分泌Lp-PLA2與血清Lp-PLA2相關(guān)性分析 T2DM患者組中間型單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平(r=0.416，P=0.003)及其誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞(n=25，等距隨機(jī)抽樣)分泌Lp-PLA2(r=0.497,P=0.001)與血清Lp-PLA2濃度呈正相關(guān)，見圖1。非經(jīng)典型和中間型單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平及其誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌Lp-PLA2與血清Lp-PLA2濃度無相關(guān)性(P>0.05)。

注：A,中間型單核細(xì)胞CD36與血清Lp-PLA2相關(guān)性;B,上清液Lp-PLA2與血清Lp-PLA2相關(guān)性。

2.5阻斷T2DM患者單核細(xì)胞CD36抑制細(xì)胞分泌Lp-PLA2 T2DM患者(n=25，等距隨機(jī)抽樣)單核細(xì)胞亞群經(jīng)CD36抗體阻斷，經(jīng)典型單核細(xì)胞、中間型單核細(xì)胞和非經(jīng)典單核細(xì)胞分泌Lp-PLA2濃度均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表4。

表4CD36抗體阻斷對(duì)T2DM患者單核細(xì)胞分泌Lp-PLA2(ng/mL)影響比較

分組n經(jīng)典型中間型非經(jīng)典型CD36抗體阻斷組25137.3±21.8191.8±24.7105.6±22.5對(duì)照組25203.4±29.7336.4±35.6?223.1±28.4t值8.9716.6816.21P值<0.001<0.001<0.001

注：*，HC組vs T2DM組，P<0.05。

3 討論

在T2DM患者As形成過程中，單核細(xì)胞在趨化因子的作用下向內(nèi)皮下募集，分化成巨噬細(xì)胞，并通過清道夫受體CD36攝取oxLDL，引發(fā)炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1致炎型極化，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，參與As的形成，CD36缺陷可減少As的形成[7-8]。

本研究證實(shí)，與健康對(duì)照者相比，T2DM患者中間型單核細(xì)胞CD36表達(dá)升高，伴發(fā)頸As病變的T2DM患者中間型單核細(xì)胞CD36升高尤為顯著。Lopez-Carmona等[9]檢測(cè)未分群?jiǎn)魏思?xì)胞，證實(shí)T2DM患者單核細(xì)胞CD36表達(dá)增加。血漿中循環(huán)CD36形式的水平與頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)、胰島素抵抗和As斑塊不穩(wěn)定有關(guān)[10]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，中間型單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞攝取oxLDL增加。Xu等[11]證實(shí)單核細(xì)胞攝取脂質(zhì)，產(chǎn)生泡沫單核細(xì)胞表型并遷移到新生的As斑塊中。較早研究將單核分為2群，與CD14++CD16-細(xì)胞相比，CD14++CD16+細(xì)胞通過CD36攝取較多的oxLDL，更容易形成泡沫細(xì)胞[12-13]。

CD36還參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化磷脂酶A2[14-15]，人單核THP-1細(xì)胞CD36通過攝取oxLDL上調(diào)Lp-PLA2的表達(dá)，Lp-PLA2正反饋促進(jìn)巨噬細(xì)胞中的脂蛋白攝取[3]。本研究表明，T2DM患者中間型單核細(xì)胞CD36表達(dá)水平和血清Lp-PLA2濃度呈正相關(guān)，阻斷CD36抗體可降低各亞群分泌的Lp-PLA2。

綜上所述，T2DM尤其伴As患者中間型單核細(xì)胞高表達(dá)CD36，攝取較多的ox-LDL，對(duì)Lp-PLA2合成有促進(jìn)作用，阻斷CD36可抑制單核細(xì)胞分泌Lp-PLA2。因此，通過抑制T2DM患者中間型單核細(xì)胞及其CD36表達(dá)可能抑制T2DM患者As的形成。但中間型單核細(xì)胞CD36表達(dá)低于經(jīng)典型，攝取ox-LDL的能力及分泌Lp-PLA2的能力要高于經(jīng)典型，具體機(jī)制不明，需進(jìn)一步研究。