張會(huì)，郭磊，王軍民，譚大聰，華燕

（西南林業(yè)大學(xué)云南森林資源培育與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南昆明650224）

花果香氣成分與花果的質(zhì)量、加工及營養(yǎng)價(jià)值密切相關(guān)。香氣成分是其能否博得消費(fèi)者的喜歡、是否是市場主力的主要考察因素。植物香氣成分，是一類分子量較小的次生代謝物，在植物學(xué)界也稱之為精油。目前已知含精油較多的植物有龍腦香科、蕓香科、禾本科、樟科、姜科、桃金娘科、木蘭科、柏科等。植物的營養(yǎng)器官和生殖器官均有香氣成分分布，不同部位含量有所不同[1]。有些植物的根、莖、葉、皮、花或果等可作為天然香料，但花果的香氣最為突出，也是最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的部位，香氣成分是其主要特征。研究香氣成分，有利于優(yōu)化品種特性，提高經(jīng)濟(jì)效益。

近年來，國內(nèi)外有許多關(guān)于香氣成分的研究方法、各種花果的香氣成分及其不同品種之間的成分差異的研究[2-4]。香氣成分的前處理方法有同時(shí)蒸餾萃取法 （simultaneous distillation and solvent extraction，SDE）、超臨界流體萃取法（supercritical fluid extraction，SFE）、頂空法（headspace，HS）、固相微萃取法（solidphase microextraction，SPME），通常使用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對其進(jìn)行檢測。本文對香氣成分的主要研究方法進(jìn)行對比分析，闡述其用于香氣成分的研究特點(diǎn)。同時(shí)，總結(jié)常見花果及其加工制品的香氣成分差異，介紹花香的生物功能，為香氣成分的基因分析及其相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 花果香氣成分的研究方法

花果香氣成分的研究流程主要包括以下5 個(gè)方面，樣品采集與制備、樣品前處理、采集數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)處理與分析以及生物學(xué)解釋。根據(jù)研究目的和對象不同采取合適的存放條件，分析含水量較高的揮發(fā)性組分時(shí)，取樣后，先用液氮研磨粉末，低溫保存，如黃瓜、番茄、草莓等。揮發(fā)性植物代謝譜的采集常采用固相微萃取的前處理方法，非揮發(fā)性植物代謝物譜需進(jìn)行衍生化處理。運(yùn)用氣質(zhì)聯(lián)用檢測其中代謝物的種類、含量，得到代謝圖譜，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，找出差異代謝物，進(jìn)行生物學(xué)解釋。花果香氣成分的研究流程可歸納如圖1 所示。

圖1 花果香氣成分的研究流程Fig.1 The analysis flow of aroma components

1.1 前處理方法

同時(shí)蒸餾萃取法、超臨界流體萃取法、頂空法、固相微萃取法等幾種方法均可用于提取香氣成分。SDE[2]是Nickerson 和Likens 在1964 年設(shè)計(jì)的一種將水蒸氣蒸餾和溶劑萃取結(jié)合起來的分析方法。SDE 的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，香氣的回收率和提取率均較高。但由于整個(gè)分析過程是在高溫密閉的環(huán)境下進(jìn)行，熱敏感的香氣組分會(huì)受到影響，從而導(dǎo)致分析不完全，不能反映原料的完整香氣特征。SFE 是指當(dāng)溫度和壓力均超過臨界點(diǎn)時(shí)，作為溶劑的超臨界流體將從樣品中萃取目標(biāo)物。該方法的優(yōu)點(diǎn)是有效保護(hù)揮發(fā)性物質(zhì)中的熱敏性成分不被破壞，缺點(diǎn)則是工藝要求高，費(fèi)用大。SPME 和HS 是香氣成分研究中最常使用的方法。Arthur C L 等[5]在 1990 年首次應(yīng)用 SPME，萃取、濃縮同時(shí)進(jìn)行且無需溶劑，使樣品的制備變得更加簡單。SPME 萃取效率主要取決于幾個(gè)可優(yōu)化的因素，如要提取的化合物性質(zhì)、提取溫度、提取時(shí)間、纖維的涂層材料以及鹽析效果等[6]。SPME 提取技術(shù)快速、簡便，適用于從水溶液中提取和濃縮揮發(fā)性和半揮發(fā)性化合物。相對SPME 來說，HS 不使用昂貴的萃取頭，直接進(jìn)樣頂部空間的揮發(fā)性氣體，不足之處則在于沒有富集的過程，同樣的檢測條件，HS 檢測到的化合物相對少于SPME。HS 和SPME 的主要區(qū)別在于：HS 沒有富集樣品的過程，而SPME 使用了萃取頭富集，檢測到的化合物更多。Zhong 等[7]使用SPME 的前處理方法，GCMS 聯(lián)用技術(shù)檢測到紫蘇中所含揮發(fā)性成分單萜、倍半萜、脂肪酸等56 個(gè)。

1.2 檢測方法

GC-MS 聯(lián)用技術(shù)主要分析易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化或衍生化后具有揮發(fā)性的小分子代謝物[8]。它因其具有較高的靈敏度、分辨率和大量標(biāo)準(zhǔn)譜庫而成為目前揮發(fā)性成分的主要分析平臺(tái)之一，常被用于分析農(nóng)產(chǎn)品中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性代謝物[9]。此外，氣相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜（gas chromatography-time of flight，GC-TOF）結(jié)合，使用非靶向分析可獲得大量的化學(xué)信息，這主要是因?yàn)槠渚哂蟹治鑫餀z測速度快和反卷積處理效率高等優(yōu)點(diǎn)[10]。評價(jià)花果品質(zhì)還有一種感官分析方法，但是感官分析受人的主觀意識(shí)影響較大，對產(chǎn)品的最終評價(jià)將造成不可避免的誤差?；诓溉閯?dòng)物嗅覺和味覺機(jī)理的人工電子鼻和電子舌正好能夠彌補(bǔ)此不足之處。電子鼻系統(tǒng)由氣敏傳感器、信號處理模塊和模式識(shí)別三大部分組成，具有識(shí)別氣體的能力[11]。與電子鼻結(jié)構(gòu)類似，電子舌的組成也同樣分為這三部分。與電子鼻不同的是，電子舌檢測的對象是液體，其工作原理與電子鼻類似。電子舌的工作原理是：味覺傳感器感受到樣品中的不同呈味物質(zhì)，從而產(chǎn)生電信號；信號調(diào)節(jié)電路，電信號放大電路；進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換，將這些信號發(fā)送至電腦；軟件分析，進(jìn)行模式識(shí)別分析；最后做出判斷并輸出結(jié)果[12]。GC-MS 與電子舌結(jié)合對花果品質(zhì)的檢測研究較少。Escriche 等[13]采用伏安型電子舌檢測不同處理的蜂蜜，經(jīng)過主成分分析和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析后，對來自不同產(chǎn)地的蜂蜜具有很好的區(qū)分度。

2 花果香氣成分的物質(zhì)種類

2.1 花香

花香是觀賞植物所具有的重要性狀特征，人們不僅僅只在意花的觀賞價(jià)值給人帶來的視覺美感，同時(shí)也期望其芳香性狀越來越好。隨著分析儀器和樣品前處理技術(shù)的迅速發(fā)展，花香研究也進(jìn)行地比較順利。桂花、丁香花、白蘭花、茉莉花、梔子花等常見園林樹木花的揮發(fā)性物質(zhì)已初步鑒定。現(xiàn)將常見植物花香的主要香氣成分歸納如表1。

目前，從桂花（Osmanthus frsgrans Lou.）中鑒定到60 多種香氣物質(zhì)[15]。使用GC-MS 聯(lián)用技術(shù)檢測白蘭花（Michelia alba DC.）所含的香氣成分，芳樟醇是其主要香氣成分[16]。李麗華等[17]采用HS-SPME/GC-MS 聯(lián)用技術(shù)分析茉莉花（Jasminum sambac L.）的香氣成分，分別采用3 種萃取頭型號DVB、PDMS、PA，分離出100 多種香氣成分，所得主成分基本一致。分別使用動(dòng)態(tài)頂空法和固相微萃取法分離梔子花（Gardenia）的香氣成分，用GC-MS 技術(shù)分析檢測到54 種香氣物質(zhì)[18]。陳奇奇[19]利用頂空進(jìn)樣對棗花（Ziziphus jujuba Mill.）的香氣成分進(jìn)行分析。經(jīng)系統(tǒng)譜庫檢索、譜圖分析，9 個(gè)品種的棗花共鑒定出60 個(gè)化合物，蜜蜂罐棗花的4 個(gè)器官共鑒定出59 個(gè)化合物，不同樣品揮發(fā)性物質(zhì)有所差異，但主要成分都是酯類、醛類、酮類、烷烴類。

表1 植物花香的主要香氣成分Table 1 The main aroma of plant fragrance

快速的科技發(fā)展將花香成分的研究推向了新高度，使得代謝組學(xué)與基因組學(xué)整合起來。白玉蘭（Magnolia Champaca），是一種因花香而出名的樹。這些花香廣泛應(yīng)用于香精和香料行業(yè)。盡管具有重要的商業(yè)意義，但這些花卉中的VOCs 生物合成途徑鮮為人知。Savitha 團(tuán)隊(duì)[20]結(jié)合代謝物和 RNA 序列（RNA-seq）對完全開放的白玉蘭進(jìn)行分析，用頂空法和氣相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)合分析。共鑒定出43 種揮發(fā)性有機(jī)物，其中46.9%為萜類化合物，38.9%為揮發(fā)性酯類，5.2%為苯丙類/苯類化合物。VOCs 詳細(xì)輪廓譜使得從RNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了與花香味生物合成有關(guān)的通路和基因。對花和葉中許多與花香合成相關(guān)的單基因表達(dá)水平的分析表明，大多數(shù)基因在花中的表達(dá)量高于在葉片組織中的表達(dá)量。

雖然國內(nèi)學(xué)者對花香的研究取得了一些進(jìn)展，但大多仍徘徊于不同品種之間的香氣成分區(qū)別研究，不同種類植物花香組分的分析，其代謝與合成途徑研究很少。近20 年來，國內(nèi)外研究人員開始研究花香物質(zhì)的代謝路徑及其基因和相關(guān)酶的作用機(jī)理，了解香氣的形成機(jī)制，為培育新品種提供理論依據(jù)[22]。由于復(fù)雜的植物代謝和種屬特異性，花香物質(zhì)代謝機(jī)理還有許多問題。例如，一些目標(biāo)基因的過表達(dá)或抑制，并沒有對目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生影響。在不同的植物體或轉(zhuǎn)化體中，仍然存在目標(biāo)基因表達(dá)差異大，酶活性高低與目標(biāo)產(chǎn)物合成及限速酶基因表達(dá)有時(shí)不一致等問題。因此，植物花香成分代謝途徑的基因工程仍然面臨著很多具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，應(yīng)用基因工程技術(shù)對植物花香物質(zhì)代謝途徑進(jìn)行改良時(shí)，應(yīng)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，穩(wěn)定花香性狀的同時(shí)，有效整合優(yōu)良性狀，培育新品種。隨著對植物花香物質(zhì)代謝途徑的全面解析、克隆相關(guān)基因以及現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，現(xiàn)有植物性狀將更加有效地改造，培育出色香型俱佳的觀賞植物，構(gòu)建芳香幽幽的園林，帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

2.2 果香

隨著食品工業(yè)對天然風(fēng)味成分需求的增加以及國際市場對果品品質(zhì)的要求越來越高，果品香氣受到大眾的日益關(guān)注。果實(shí)的揮發(fā)性香氣化合物多達(dá)2 000余種，主要香氣成分類別見表2。

表2 常見果實(shí)的主要香氣成分Table 2 Main aroma components of common fruits

香氣成分種類及其含量客觀地反映出不同果品所具有的風(fēng)味特點(diǎn)，是評價(jià)其風(fēng)味的重要指標(biāo)之一。香氣成分會(huì)在一定程度上指示食品的營養(yǎng)價(jià)值和健康狀況[30]，草莓因其具有令人愉悅的香味和營養(yǎng)而世界聞名。研究表明，甜味和復(fù)雜風(fēng)味是“理想”草莓體驗(yàn)的一貫優(yōu)點(diǎn)[31]。調(diào)查研究表明，在草莓中鑒定出300多種香氣成分[29]。不同果實(shí)的香氣由不同的揮發(fā)性成分組成，這體現(xiàn)出品種之間的差異性。研究香氣成分對提高果實(shí)質(zhì)量、育種及其深加工等均具有重要意義。20 世紀(jì)60 年代開始研究果實(shí)香氣成分，起初多研究葡萄、草莓等常見水果[32]。80 年代重點(diǎn)研究香氣物質(zhì)對水果的感官貢獻(xiàn)。然而，由于儀器設(shè)備落后，測定結(jié)果不準(zhǔn)確，限制了其發(fā)展。進(jìn)入90 年代后，隨著GC-MS 技術(shù)的發(fā)展，以及開發(fā)了新型香氣成分提取方法SPME[5]。國內(nèi)外在不同果實(shí)香氣成分的測定方面取得了一些階段性的成果，香氣成分的研究也進(jìn)行地更加廣泛更加深入。在果實(shí)的不同發(fā)育階段，香氣成分及含量差異較大。張序等[24]研究“紅燈”甜櫻桃發(fā)育過程中香氣成分的組分及積累過程，櫻桃成熟時(shí)，其成熟特征性香氣成分見表2。研究“新世紀(jì)”、“紅豐”兩個(gè)杏品種所含香氣成分，分別鑒定出74 種和72 種[25]。劉勝輝等[27]采用HS-SPME/GC-MS 分析3 個(gè)不同品種的楊桃成熟果實(shí)。不同沙果品種，香氣成分種類及含量不盡相同，“大花紅”與“泰山花紅”果實(shí)香氣物質(zhì)以醇類為主，分別占總含量的79.27%和67.24%；“秋風(fēng)蜜”、“一窩蜂”、“小花紅”和“萊蕪花紅”的果實(shí)香氣成分以酯類為主，其含量分別占總含量的98.86%、94.62%、81.35%和 73.56%[33]。研究臺(tái)農(nóng) 21、Phuket、Josapine 等6 個(gè)菠蘿品種揮發(fā)物種類。結(jié)果表明：MD-2、MacGregor、臺(tái)農(nóng) 21、Phuket 以酯類為主，而 Josapine 以萜烯類為主。引自馬來西亞的Josapine 與其他5 個(gè)品種的揮發(fā)性物質(zhì)差異較大[28]。綜上所述，同一果品，不同品種，主要香氣物質(zhì)有相同也有不同，不能一概而論。

結(jié)合感官評價(jià)和儀器分析，對食品的風(fēng)味和口感進(jìn)行研究。采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法，水果中存在的許多VOCs 對香氣和風(fēng)味有積極的促進(jìn)作用，能給人留下愉快的印象[34]。在過去的30 年里，草莓育種計(jì)劃的主要目標(biāo)是提高農(nóng)藝表現(xiàn)，從而生產(chǎn)出鮮艷的大型果實(shí)。但研究發(fā)現(xiàn)其香味才是影響消費(fèi)者的主要品質(zhì)性狀[31，35]。但只有少數(shù)被報(bào)道對人類感知到的草莓香氣有貢獻(xiàn)[36-38]。與其他水果作物一樣，生物合成途徑、酶和揮發(fā)性化合物積累的調(diào)控在草莓屬中也得到了部分闡明。Goff[30]研究發(fā)現(xiàn)果實(shí)的揮發(fā)性特征取決于遺傳（水果種類和品種）、發(fā)育階段和采后因素以及分析技術(shù)。Samykanno[39]使用GC×GC-MS 檢測兩個(gè)澳大利亞生長的草莓品種，從中鑒定了94 個(gè)化合物。

利用 GC-MS 技術(shù)，結(jié)合 HS、SPME 或者 HSSPME 等前處理方法進(jìn)行揮發(fā)性成分的研究現(xiàn)已廣泛開展。Colinacoca 等[3]建立一種新方法，使用HS-GCMS 檢測方法分析洋蔥中的揮發(fā)性物質(zhì)，鑒定到18 種揮發(fā)性成分并定量分析其中9 種。至今，最為成功的分析技術(shù)是 HS-SPME/GC-MS[40-41]。2014 年，Allwood 等[42]提出了一種簡單可靠的聚二甲基硅氧烷（poly dimethyl siloxane，PDMS）分析方法。通過主成分分析，在香瓜中檢測到58 種VOCs。通過與傳統(tǒng)的SPME-GC-MS 分析數(shù)據(jù)比較，表明高通量PDMS 分析方法對香瓜香氣和品質(zhì)的評價(jià)具有很大的潛力。Vrhovsek 等[43]開發(fā)并驗(yàn)證一種通用的GC-MS/MS 方法，利用該技術(shù)分析蘋果、覆盆子和葡萄中的揮發(fā)性化合物。主要類別是酯類、醇、單萜類、醛、酮、酸、去甲異丙烯酮、倍半萜、吡嗪和醚，蘋果中的69 種化合物、葡萄中的122 種和覆盆子中的42 種。該方法易于推廣到其他水果中的揮發(fā)性化合物，因此可廣泛應(yīng)用于水果香氣領(lǐng)域的定性或定量研究。

2.3 加工制品的香氣成分

由植物花和果制成的加工品尤其之多，最常見的莫過于葡萄酒。葡萄酒的香氣成分研究較早。早在上世紀(jì)五十年代，Bayer 等[44]首次采用氣相色譜技術(shù)對葡萄酒的揮發(fā)性組分進(jìn)行了研究，并成功鑒定出了一些酯類和高級醇物質(zhì)。色譜質(zhì)譜等現(xiàn)代分析方法的發(fā)展，為揮發(fā)性物質(zhì)的研究提供了重要的分析手段。目前，從葡萄酒中鑒定出的揮發(fā)性成分大約有800 多種，主要包括萜烯類、酯類、內(nèi)酯類、醇類、有機(jī)酸類、揮發(fā)性酚類和雜環(huán)類化合物等[45]。近年來，對于葡萄酒的香氣成分研究主要集中于不同制作方法和不同采摘期，區(qū)分葡萄酒香氣成分。李娜娜等[46]研究表明，3 個(gè)采收期，蒸餾酒品種最好的是采于8 月18 日的葡萄制成；葡萄酒質(zhì)量最好的是9 月5 日采收的。因此，制作不同的加工品，需研究其最佳采收原料時(shí)間，使得香氣質(zhì)量最好。除了葡萄酒還有人用草莓釀造草莓酒，HSSPME/GC-MS 分析草莓酒的香氣成分，共鑒定出32 種成分，主成分為乙醇、異戊醇、正丙醇、十六酸2-甲基丙酯等，主要為醇類和酯類[47]。蘋果酒香氣是評價(jià)蘋果酒質(zhì)量的重要指標(biāo)，其香氣成分是影響蘋果酒品質(zhì)的主要影響因素。蘋果酒的香氣成分主要是一些高級醇類、酯類、內(nèi)酯、縮醛、萜烯和低級脂肪酸等微量成分[48]。

3 花香的功能

植物花朵的芳香來源于花瓣或花被釋放的多種揮發(fā)性香氣成分。花香揮發(fā)物的釋放不僅是植物引誘昆蟲授粉、受精的重要表達(dá)信號，也是植物對食草生物主動(dòng)防御的適應(yīng)機(jī)制。而且，植物的花香能使人心情愉悅，是表征觀賞植物的重要指標(biāo)。大自然中的許多植物花朵都能散發(fā)出香氣，許多香氣成分混合在一起形成了花香，不同的香氣成分及其含量差異構(gòu)成了其獨(dú)特的顯著特征。普遍認(rèn)為花香有兩種功能：吸引昆蟲授粉以及抵御昆蟲侵害[49]。許多種類的植物不能進(jìn)行自花授粉，需要吸引昆蟲進(jìn)行授粉從而繁殖?；ǘ淦恋耐庑魏推G麗的色彩與花香一起作用吸引昆蟲[50]。根據(jù)花香特性，昆蟲訪問具有它感興趣花香的植物花朵。另外一些花朵通過其揮發(fā)出來的氣味抵御或避免昆蟲對自己的傷害，或者當(dāng)植物被細(xì)菌真菌感染后，花香作為信號激起免疫反應(yīng)進(jìn)行自愈。

植物花朵所具有的揮發(fā)性物質(zhì)是其次生代謝產(chǎn)物，在植物的傳粉過程中擔(dān)任著至關(guān)重要的角色。開花過程中，香氣成分的種類、含量及其比例對引誘傳粉者覓食影響較大[51]，并為花香代謝與調(diào)控提供理論依據(jù)[52]。趙印泉等[53]以“三輪玉蝶”梅花為材料，使用HS-SPME/GC-MS 聯(lián)用技術(shù)，研究梅花香氣物質(zhì)的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化，對5 個(gè)不同階段的花朵及不同花器官釋放的香氣成分進(jìn)行檢測。推測，在開花的第4 階段，花萼、雌蕊群和花盤釋放乙酸己酯含量較高，丁子香酚含量較低，這或許是引誘蜜蜂覓食的重要信號。

4 小結(jié)與展望

有綜述表明[29]，不同的前處理方法，提取草莓中的香氣成分，重現(xiàn)性較差。在其整理的25 項(xiàng)研究中，沒有一種物質(zhì)在所有的研究中均被檢測到。而且，有67%的物質(zhì)只在一項(xiàng)研究中所檢測到。前期總結(jié)花果香氣成分的前處理方法，例如同時(shí)蒸餾萃取法、超臨界流體萃取法、頂空法、固相微萃取法，每個(gè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。綜合比較，SPME 萃取效果最佳，能檢測到較多香氣成分，但由于其萃取頭的纖維材料制作不盡完全相同，且隨著時(shí)間的推移，使用程度對其纖維有所損傷，因而，同一處理之間的數(shù)據(jù)重復(fù)性較差，且不能對香氣成分進(jìn)行完全定量。所以，在今后的研究中，為減少試驗(yàn)誤差，找到一種重現(xiàn)性穩(wěn)定性較好的研究方法至關(guān)重要。分析花果香氣成分的研究很多，但迄今為止，仍然不存在一種方法能夠適用于多種材料。目前，對高復(fù)雜混合物的大規(guī)模分析采用了一系列的綜合技術(shù)和方法。近年來，有報(bào)道稱，利用基因工程的方法可以改良植物花果香氣，比如倍半萜合成酶基因[54]、法呢基焦磷酸合成酶基因[55]等花香基因。目前，對花果香氣成分的研究已取得一些進(jìn)展。但大多只研究不同花果種類、不同品種之間的香氣物質(zhì)及含量差異，而對香氣的形成過程及相關(guān)酶的作用機(jī)制研究很少。應(yīng)加大對改善花果的香氣及提高花果質(zhì)量的研究。此外，香氣是通過人體嗅覺器官感知而評價(jià)的。因此，香氣物質(zhì)的鑒定須結(jié)合感官評價(jià)，才會(huì)使香氣成分的研究更有意義。在未來，應(yīng)該越來越重視氣相色譜與感官分析相結(jié)合。