趙梓月，王思遠(yuǎn)，廖森泰，*，穆利霞，鄒宇曉

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東廣州510610；2.廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510610；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510610）

鈣是人體中最豐富的無(wú)機(jī)元素，在人體生命活動(dòng)中起著極為重要的作用。若鈣攝入量不足，會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、佝僂病、骨質(zhì)軟化等疾病[1]。隨著全球老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松患者逐年遞增，中老年人骨質(zhì)疏松已成為一個(gè)重要的公共健康問(wèn)題，被世界衛(wèi)生組織稱(chēng)為“無(wú)聲無(wú)息的流行病”。女性更年期后，高齡骨折直接或間接的致死率已持平于乳腺癌[2]。因此，補(bǔ)鈣對(duì)人體非常重要，嬰幼兒、老人及孕婦等人群對(duì)補(bǔ)鈣的需求則更高。

目前，補(bǔ)鈣主要以補(bǔ)充離子鈣為主，如碳酸鈣、乳酸鈣、葡萄糖酸鈣等。這些離子鈣溶解性較差，吸收時(shí)需消耗大量胃酸，吸收率和生物利用率低，在腸道中易形成鈣沉淀[3]，對(duì)腸胃有一定刺激性，過(guò)量攝入甚至有可能引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化痙攣，血管鈣化及軟組織鈣化、腎結(jié)石等疾病。而氨基酸、多肽分子可與鈣離子發(fā)生螯合反應(yīng)，所形成的肽鈣復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在消化過(guò)程pH 值變化時(shí)仍保持可溶且不易發(fā)生化學(xué)變化，可在腸道內(nèi)通過(guò)特定通道直接被吸收，吸收速度快且吸收量大。與氨基酸相比，小肽的吸收具有耗能少，運(yùn)輸速度快，不易飽和等優(yōu)點(diǎn)[4]。目前市場(chǎng)上已開(kāi)發(fā)有鈣酪蛋白磷酸肽咀嚼片、可溶性海藻鈣肽粉、膠原蛋白鈣肽粉等產(chǎn)品，肽鈣螯合物作為新一代鈣補(bǔ)充劑，開(kāi)發(fā)前景廣闊。

1 肽鈣結(jié)合機(jī)制研究

目前關(guān)于肽鈣結(jié)合機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)有磷酸基團(tuán)-鈣、羧基-鈣、氨基酸-鈣等模式，其結(jié)合模式如圖1所示。

圖1 肽鈣結(jié)合模式Fig.1 Peptide calcium binding mode

1.1 磷酸基-鈣結(jié)合模式

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）和卵黃磷蛋白磷酸肽（phosvitin phosphopeptides，PPPs）是磷酸基-鈣結(jié)合模式的代表。CPPs 是目前為止發(fā)現(xiàn)的促鈣吸收效果最好的短肽，已作為鈣強(qiáng)化劑廣泛應(yīng)用于嬰幼兒食品及其它補(bǔ)鈣類(lèi)功能食品當(dāng)中。牛乳中含有約80%的酪蛋白，酪蛋白經(jīng)胃蛋白酶消化后生成酪蛋白多肽衍生物并被磷酸化，即生成CPPs，實(shí)際上是一系列含有磷酸絲氨酸簇的短肽-Ser（P）-Ser（P）-Ser（P）-Glu-Glu-。Ferraretto 等發(fā)現(xiàn)，該核心序列上的磷酸絲氨酸殘基可與鈣結(jié)合可形成Ca3（PO4）2納米團(tuán)簇，從而聚集鈣離子并引起細(xì)胞對(duì)鈣的攝取[5]。CPPs 在動(dòng)物和人體小腸內(nèi)能與鈣結(jié)合，防止鈣沉淀產(chǎn)生，使腸內(nèi)溶解性鈣的濃度大大增加，從而促進(jìn)鈣的吸收和利用，同時(shí)還可促進(jìn)鋅、鎂、鐵等的吸收，并防止齲齒[6]。

磷酸基-鈣結(jié)合模式的鈣結(jié)合能力與磷酸化水平有關(guān)。與酪蛋白相似，卵黃高磷蛋白也是高度磷酸化蛋白，磷含量高達(dá)8.2%，其相對(duì)分子量約為35 000 Da，由216 個(gè)氨基酸殘基組成，其中絲氨酸殘基更為豐富，有124 個(gè)，占總氨基酸含量的56%，并且90%以上被磷酸化。研究表明，當(dāng)對(duì)CPPs 和PPPs 進(jìn)行脫磷處理后，其結(jié)合鈣活性基本喪失，這充分說(shuō)明這些肽是依靠磷酸基團(tuán)與鈣結(jié)合。另外，Jiang 等利用胰蛋白酶水解卵黃高磷蛋白后，用堿法脫磷將PPPs 處理成17.5%～96.3%不同磷酸化程度的多肽，研究其與鈣結(jié)合能力后發(fā)現(xiàn)，含35%磷酸化的PPPs 對(duì)增強(qiáng)鈣結(jié)合能力和抑制不溶性磷酸鈣的形成是最有效的[7]。

對(duì)于磷酸肽來(lái)說(shuō)，鈣結(jié)合性能也與分子大小有關(guān)。Jiang 等通過(guò)胰蛋白酶消化制備了兩種不同分子量的磷酸肽（PPPs）片段，結(jié)果表明，小于1 kDa 的片段不可與Ca2+結(jié)合，而1 kDa～3 kDa 的片段顯示出比CPPs更好的可溶性鈣結(jié)合能力[8]。

鈣結(jié)合性能力可能還與磷酸絲氨酸殘基的數(shù)量和位置有關(guān)。Zong 等研究了磷酸肽的分子結(jié)構(gòu)與鈣結(jié)合性能之間的關(guān)系，基于酪蛋白磷酸肽的核心結(jié)構(gòu)，分別用0～3 個(gè)連續(xù)或不連續(xù)的磷酸化絲氨酸合成了6 種磷酸肽，發(fā)現(xiàn)磷酸絲氨酸含量越高，鈣結(jié)合活性越強(qiáng)，磷酸絲氨酸之間相隔一個(gè)氨基酸排列比連續(xù)排列活性強(qiáng)[9]。Choi 等從蛋黃中提取出純化的卵黃高磷蛋白肽，研究發(fā)現(xiàn)，卵黃高磷蛋白肽與鈣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比高于1.0 時(shí)，鈣溶解能力遠(yuǎn)高于商業(yè)酪蛋白磷酸肽（CPPs）[10]。

1.2 羧基-鈣結(jié)合模式

除磷酸基-鈣結(jié)合外，Ca2+還可與肽中特定的基團(tuán)結(jié)合，研究發(fā)現(xiàn)最多的是羧基-鈣結(jié)合模式，這類(lèi)肽分子中天冬氨酸（Asp）或谷氨酸（Glu）含量較高，可提供易與Ca2+結(jié)合的羧基位點(diǎn)。Bao 等研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白肽（soybean protein hydrolysates，SPHs）的鈣結(jié)合能力與羧基基團(tuán)呈線(xiàn)性相關(guān)，并且最可能的鈣結(jié)合位點(diǎn)是Asp 和Glu 的羧基[11]。目前研究制備出的具有促進(jìn)鈣吸收作用的非磷酸化肽，如乳清蛋白衍生肽（-Glu-Gly-、-Phe-Asp-）[12-13]、牛血清蛋白衍生肽（-Asp-Asn-Leu-Pro-Asn-Pro-Glu-Asp-Arg-Lys-Asn-Tyr-Glu-）[14]、豬血漿蛋白衍生肽（-Val-Ser-Gly-Val-Glu-Asp-Val-Asn-）[15]、太平洋鱈魚(yú)骨膠原肽（Gly-Pro-Glu-Gly，Gly-Glu-Lys）[16]和大豆蛋白肽（-Asp-Glu-Gly-Glu-Gln-Pro-Phe-Pro-Phe-Pro-）等[17]，結(jié)構(gòu)中都含有谷氨酸或天冬氨酸，可通過(guò)羧基與鈣結(jié)合。

1.3 其他模式

有研究發(fā)現(xiàn)一些其他的氨基酸和基團(tuán)也能參與鈣的結(jié)合。如從蝦廢棄物中得到的鈣離子結(jié)合活性肽由3 個(gè)氨基酸組成，且不帶有負(fù)電基團(tuán)，只含有組氨酸和半胱氨酸[18]。Zhao 等從乳清蛋白水解物中分離出可與鈣結(jié)合的特異性肽，鑒定出其序列為-Phe-Asp-，并發(fā)現(xiàn)其酰胺基和羧基參與了螯合作用，羧基的氧原子和酰氨基的氮原子通過(guò)供給電子與鈣形成配位鍵[13]。

同時(shí)，分子量大小也可能對(duì)鈣結(jié)合特性產(chǎn)生影響。Lv 等的研究表明當(dāng)大豆蛋白多肽復(fù)合鈣（soybean protein hydrolysates-calcium，SPH-Ca） 分子量達(dá)到10 kDa～30 kDa 時(shí)可促進(jìn)鈣的吸收[19]。Liu 等研究了小麥胚芽蛋白肽（wheat germ protein hydrolysates，WGPHs）結(jié)合鈣的能力，分離出分子量＜2 000 Da 的肽段鈣結(jié)合能力較高，該肽段主要由Glu、Arg、Asp 和Gly 組成，并發(fā)現(xiàn)鈣結(jié)合能力與WGPHs 中的疏水氨基酸含量有關(guān)[20]。

2 肽鈣螯合物的制備、分離純化及檢測(cè)方法

2.1 肽鈣螯合物的制備

2.1.1 直接法

目前，肽鈣螯合物的制備方法主要先將蛋白水解為多肽，再與CaCl2等鈣源反應(yīng)而成，其螯合效率與蛋白水解度、反應(yīng)時(shí)間、pH 值、溫度、肽鈣比等因素有關(guān)。Charoenphun 等采用不同蛋白酶對(duì)羅非魚(yú)蛋白進(jìn)行酶解后發(fā)現(xiàn)，鈣結(jié)合能力與蛋白酶的種類(lèi)和水解度有關(guān)，選用Alcalase 酶水解，底物濃度65 mg/g，當(dāng)水解度為27.7%時(shí)，所制多肽的鈣結(jié)合能力最強(qiáng)，序列為T(mén)rp-Glu-Trp-Leu-His-Tyr-Trp，其分子量約為1.2 kDa[21]。此外，Chen 等用胃蛋白酶（pH1.8、40 ℃、5 h），胰蛋白酶（pH8.0、40 ℃、5 h）和風(fēng)味蛋白酶（pH7.0、50 ℃、5 h）分段水解羅非魚(yú)魚(yú)鱗獲得魚(yú)鱗多肽-Asp-Gly-Asp-Asp-Gly-Glu-Ala-Gly-Lys-Ile-Gly-（tilapia scale protein hydrolysate，TSPH），然后向 10 %TSPHs 中添加Ca2+至 1.3 mol/L，50 ℃條件下反應(yīng) 30 min 制得肽鈣復(fù)合物TSPH-Ca。進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該肽鈣復(fù)合物TSPH-Ca 可顯著改善缺鈣大鼠股骨的物理和生物力學(xué)性能，在預(yù)防鈣缺乏和提高鈣生物利用度方面效果良好[22]。

與酶解法不同，Wang 等利用枯草芽孢桿菌HYT液態(tài)發(fā)酵黃瓜籽粕，接種量8%，28 ℃發(fā)酵2 d 制得黃瓜籽多肽（cucumber seed peptide，CSP），再用超濾方式篩選出其中多肽組分CSP3（＜6 KDa）與鈣結(jié)合能力最佳，并發(fā)現(xiàn)CSP3 和CSP3-Ca 二級(jí)結(jié)構(gòu)有很大差異，鈣離子與CSP3 中的金屬結(jié)合位點(diǎn)羧基氧、羥基氧、氨基氮等發(fā)生了反應(yīng)，影響了其構(gòu)象[23]。

2.1.2 修飾改性

修飾改性是蛋白及多肽加工中常用的技術(shù)手段，包括物理、化學(xué)、酶法、基因工程改性等方法。通過(guò)改性可改變多肽結(jié)構(gòu)進(jìn)而提高其鈣結(jié)合能力，目前的研究中有利用磷酸化和脫酰胺化等化學(xué)法對(duì)金屬多肽進(jìn)行改性研究。溫慶輝對(duì)珠蚌肽進(jìn)行磷酸化改性后與鈣螯合，珠蚌肽經(jīng)磷酸化改性后鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)由3.3%增加到7.3%，這可能是由于多肽經(jīng)過(guò)磷酸化改性后電負(fù)性增加，進(jìn)而使其持鈣能力增強(qiáng)[24]。Zhu 等利用加熱法在人造膠原（human-like collagen，HLC）中引入活性磷酸基團(tuán)后與鈣結(jié)合制備出了磷酸化人造膠原鈣復(fù)合物（phosphorylated human-like collagen calcium，PHLC-Ca）。用PHLC-Ca 飼喂缺鈣小鼠后發(fā)現(xiàn)，骨密度、骨鈣含量等均優(yōu)于CaCl2、葡萄糖酸鈣，是一種良好的補(bǔ)鈣制劑[5]。崔宇等利用酸法和酶法對(duì)大豆肽進(jìn)行脫酰胺改性，結(jié)果顯示，酸法和酶法脫酰胺均可改善大豆肽螯合鈣的能力，但酸法脫酰胺效果更佳，且發(fā)現(xiàn)先酶解再脫酰胺的方式在產(chǎn)物得率、螯合率、鈣結(jié)合量上均優(yōu)于先脫酰胺再酶解的方式[25]。

2.2 肽螯合鈣分離純化方法

通常情況下，制備肽螯合鈣首先將原料制成多肽，后與鈣源進(jìn)行螯合形成肽螯合鈣。為了能夠提高利用度，將與鈣離子親和能力強(qiáng)的多肽分離出來(lái)，可以在一定程度上得到純度更高的肽螯合鈣。目前，應(yīng)用于純化多肽的方法主要有凝膠過(guò)濾色譜法，離子交換色譜法，反相高效液相色譜法和固定金屬親和色譜法。

固定金屬親和層析色譜法是目前廣泛使用的分離純化方法，通過(guò)利用固定相的結(jié)合特性分離分子，具有高結(jié)合能力和高回收率的優(yōu)點(diǎn)。凝膠過(guò)濾色譜法一般用于不同分子量多肽的分離和鑒定。離子交換色譜法一般用于分離離子或可離解的多肽。反相液相色譜是目前液相色譜分離中使用最為廣泛的一種模式，它的特點(diǎn)是固定相的極性比流動(dòng)相弱。由于反相液相色譜固相載體的疏水性，它可以根據(jù)流動(dòng)相中被分離物質(zhì)分子疏水性的不同而發(fā)生強(qiáng)弱不同的相互作用，從而使不同分子在反相柱中彼此分離。Liu 等使用固定金屬離子色譜法、凝膠過(guò)濾色譜法和反相高效液相色譜法分離純化出大豆蛋白水解物（SPHs）的兩種可與鈣結(jié)合的肽段F1、F2，研究了疏水性對(duì)肽鈣結(jié)合性能的影響[26]。Hou 等以羥基磷灰石作為固定相，從南極磷蝦肽獲得了3 個(gè)具有高鈣螯合活性的級(jí)分H1、H2和H3，其中H3 鈣結(jié)合能力最好。將H3 通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜及反相高效液相色譜進(jìn)一步純化后得到了具有高鈣螯合活性的肽段VLGYIQIR[27]。Zhao 等使用DEAE陰離子交換色譜，Sephadex G-25 凝膠過(guò)濾和反相高效液相色譜從乳清蛋白中分離純化出肽段Phe-Asp，該肽段具有較高的鈣結(jié)合能力[13]。

2.3 肽鈣螯合物中鈣含量的檢測(cè)方法

測(cè)定鈣含量的方法主要有滴定法、分光光度法、火焰原子吸收分光光度法、離子選擇電極法、電感耦合等離子光譜發(fā)射法等，其中使用最廣泛的有滴定法、火焰原子吸收分光光度法以及比色法。滴定法操作簡(jiǎn)便，成本低，但滴定時(shí)顏色變化受到樣品的影響，存在個(gè)體誤差。Wang 通過(guò)乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）滴定法評(píng)估鈣螯合能力，以螯合率為指標(biāo)，添加鈣指示劑后，用合適濃度的EDTA 滴定溶液使其變色，以消耗的EDTA 體積計(jì)算螯合率[28]。Sun 等在進(jìn)行海參卵子肽螯合鈣體外模擬消化試驗(yàn)中也使用EDTA 滴定法進(jìn)行鈣含量的測(cè)定[29]。分光光度法即比色法也是測(cè)定鈣離子的一種手段，其操作簡(jiǎn)單，成本較低，同時(shí)也不受人為因素的影響。李桂伶比較了測(cè)定鈣常用的3 種方法：高錳酸鉀滴定法、EDTA 滴定法和分光光度法，通過(guò)數(shù)據(jù)得出，分光光度法誤差最小[30]。Wu 等采用鄰甲酚酞絡(luò)合酮試劑法測(cè)定章魚(yú)肽的鈣結(jié)合活性，即通過(guò)比色法在570 nm 處測(cè)定鈣含量[31]。Sun 等也使用比色法測(cè)定了海參卵子水解物（sea cucumber ovum hydrolysates，SCOH）的鈣螯合活性，通過(guò)離心去除不溶性鈣鹽后，通過(guò)比色法進(jìn)行鈣含量測(cè)定[30]?；鹧嬖游辗止夤舛确ㄊ抢帽粶y(cè)元素基態(tài)原子蒸氣對(duì)其共振輻射線(xiàn)的吸收特性進(jìn)行元素定量分析的方法，因其具有較高的靈敏度、精密度、應(yīng)用范圍廣等而受到歡迎，但其價(jià)格昂貴，成本較高。Hou 等通過(guò)火焰原子吸收光譜法測(cè)定南極磷蝦蛋白水解物螯合鈣的鈣含量[26]。Guo 也利用同樣的方法測(cè)定了鱈魚(yú)魚(yú)皮蛋白水解物肽螯合鈣中的可溶性鈣含量[32]。

3 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性是研究肽螯合鈣生物利用性能的重要指標(biāo)，包括在胃腸道中的消化穩(wěn)定性和受植酸、纖維等食物的影響。

Sun 等將海參卵子水解肽螯合鈣（SCOH-Ca），酪蛋白磷酸肽結(jié)合鈣（CPP-Ca）和CaCl2水溶液在37 ℃下將pH 值調(diào)節(jié)至2.0，加入胃液后模擬胃消化過(guò)程。90 min 后，將pH 值調(diào)節(jié)至7.5，然后將腸液加入溶液中模擬腸道消化150 min，離心后的上清液鈣含量即為溶解度。結(jié)果顯示，模擬胃消化階段SCOH-Ca 與CPP-Ca 鈣溶解度無(wú)顯著差異，且顯著高于CaCl2。腸道中，在草酸鹽共存的情況下，SCOH-Ca 溶解度顯著高于 CaCl2，但低于 CPP-Ca[30]。

Lin 等比較了SPH-Ca 螯合物和CaCl2在不同pH范圍內(nèi)的鈣溶解度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH 值范圍為2.0～8.0范圍時(shí)，SPH-Ca 螯合物鈣溶解度無(wú)顯著差異，但CaCl2隨著pH 值的增加鈣溶解度呈逐漸下降趨勢(shì)[33]。劉鳳茹也研究了麥胚蛋白肽螯合鈣的穩(wěn)定性，研究發(fā)現(xiàn)，麥胚蛋白肽螯合鈣與CaCO3和葡萄糖酸鈣相比有較高的溶解度，且對(duì)pH 值耐受性較高，溶解度相對(duì)穩(wěn)定。在腸中，隨著消化時(shí)間不斷延長(zhǎng)，3 種鈣制劑溶解度均逐漸降低，但麥胚蛋白肽螯合鈣溶解度仍高于CaCO3、葡萄糖酸鈣。且在食物共存成分如植酸、草酸、膳食纖維的影響下，麥胚蛋白肽螯合與CaCO3、葡萄糖酸鈣酸鈣相比，溶解度較高。其中，3 種鈣源的透過(guò)率均隨植酸含量的增加的而降低，但是CaCO3一直處于較低的透過(guò)率水平（24%～26%），P-Ca 的鈣透過(guò)率相對(duì)最高，維持在35%水平。溶液中加入草酸以后，P-Ca 的鈣溶解度保持在75%～95 %之間，而葡萄糖酸鈣和CaCO3的鈣溶解度則低于70 %；P-Ca 的鈣透析率在24 %～38 %之間，CaCO3的鈣透析率在22 %～29 %之間。模擬胃腸道環(huán)境消化試驗(yàn)中，粗纖維對(duì)P-Ca、CaCO3和葡萄糖酸鈣3 種鈣源的溶解度和透過(guò)率副作用影響均顯著，呈現(xiàn)線(xiàn)性相關(guān)性。由此可得出，肽螯合鈣具有較好的穩(wěn)定性，生物利用度高[34]。

Mi 等將PHLC-Ca 進(jìn)行微囊化處理后，通過(guò)體外模擬消化試驗(yàn)證明了微囊化可以有效減少?gòu)?qiáng)酸性胃環(huán)境對(duì)PHLC-Ca 的破壞。同時(shí)動(dòng)物試驗(yàn)也證明了將PHLC-Ca 進(jìn)行微囊化處理后對(duì)骨質(zhì)疏松癥有更好的治療效果[35]。

4 肽鈣螯合物的生物活性

4.1 細(xì)胞吸收模型研究

近些年，人腸腺癌細(xì)胞Caco-2 和HT-29 被廣泛應(yīng)用于金屬離子的體外吸收研究。Caco-2 與十二指腸的腸細(xì)胞相似[36]，在發(fā)生主動(dòng)運(yùn)輸?shù)氖改c內(nèi)，TRPV6 通道占主導(dǎo)地位[37]。而HT-29 細(xì)胞類(lèi)似于回腸區(qū)的細(xì)胞，鈣吸收主要通過(guò)L-型鈣通道發(fā)生。Cosentino等通過(guò)研究證明，用維生素D 代謝物1，25-（OH）2D3分別預(yù)處理Caco-2 細(xì)胞和HT-29 細(xì)胞后添加CPPs，發(fā)現(xiàn)Caco-2 細(xì)胞中鈣吸收量增加，而在HT-29 細(xì)胞中，未發(fā)現(xiàn)HT-29 有相關(guān)應(yīng)答[38]。

CPPs 作為典型的肽螯合鈣，對(duì)肽類(lèi)鈣在腸道內(nèi)吸收機(jī)制方面的研究發(fā)揮了重要作用。Cosentino 等證實(shí)了添加CPPs 后，HT-29 和Caco-2 吸收細(xì)胞外鈣離子的能力僅在細(xì)胞分化時(shí)表現(xiàn)出來(lái)[38]。Ferraretto 等指出，CPPs 可能將自身插入質(zhì)膜形成其自身的鈣選擇性通道或通過(guò)內(nèi)吞作用實(shí)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)鈣的吸收。以HT-29細(xì)胞為模型，發(fā)現(xiàn)CPPs 通過(guò)直接與質(zhì)膜相互作用而增強(qiáng)細(xì)胞中的鈣攝取，但不影響其中存在的受體或離子通道[39]。另外，通過(guò)研究證明，引起HT-29 細(xì)胞內(nèi)鈣流入似乎取決于CPPs 磷酸化的“酸性基序”和前面的N 末端區(qū)域。并且在分化的HT-29 細(xì)胞中，封閉在CPPs 聚集體中的鈣離子直接參與礦物質(zhì)吸收[6]。

除CPPs 外，大豆蛋白水解物（SPHs）、干酪乳清蛋白消化物（cheese whey protein digest，CWP-D）等衍生的肽也可促進(jìn)鈣的吸收。Lv 等以Caco-2 細(xì)胞為模型評(píng)估了不同分子量的SPH-鈣復(fù)合物對(duì)體外鈣攝取的影響。結(jié)果證明，10 kDa～30 kDa 的 SPH-Ca 復(fù)合物對(duì)Ca2+的吸收有重要作用，Ca2+的增加在0.5 mg/mL～4 mg/mL 范圍內(nèi)具有濃度依賴(lài)性[19]。Takano 等表明，CWP-D 可增強(qiáng)人類(lèi)腸道Caco-2 細(xì)胞中的鈣攝取，并且CWP-D 可以抑制小鼠腸道內(nèi)鈣濃度下降[40]。Hou 等以Caco-2 細(xì)胞和外翻腸囊為模型研究了脫鹽鴨蛋清肽（duck egg white peptides，DPs）對(duì)鈣吸收的影響，發(fā)現(xiàn)DPs 可以增強(qiáng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)，可以通過(guò)充當(dāng)鈣載體并與細(xì)胞膜相互作用以打開(kāi)特定的Ca2+通道來(lái)實(shí)現(xiàn)，而旁細(xì)胞途徑可能僅作出少量貢獻(xiàn)[41]。

綜上所述，鈣在體內(nèi)的吸收可能受多種因素的影響，如轉(zhuǎn)運(yùn)通道、肽的磷酸化及一級(jí)結(jié)構(gòu)、分子量等。

4.2 動(dòng)物模型試驗(yàn)研究

為了研究肽螯合鈣在體內(nèi)的生物利用度，動(dòng)物模型在其中起著關(guān)鍵作用。我國(guó)保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范中指出，確定某種物質(zhì)是否具有補(bǔ)鈣功能，需使受試組骨鈣含量或骨密度顯著高于低鈣受試組且不低于相應(yīng)劑量CaCO3對(duì)照組，同時(shí)，鈣的吸收率也不得低于對(duì)照組[42]。Tsuchita 等利用雄性生長(zhǎng)大鼠研究CPPs 的Ca 和P 可用性，通過(guò)制備含有9.6%的CPPCa 或9.0%無(wú)鈣CPPs 的實(shí)驗(yàn)飲食，作為Ca 或P 的唯一來(lái)源。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用CPPs 喂養(yǎng)的大鼠腎小管重吸收率、股骨和肱骨重量顯著高于對(duì)照組大鼠，其中用CPPs-Ca 喂養(yǎng)的大鼠與對(duì)照組相比股骨磷含量、股骨密度顯著升高，同時(shí)也顯示出高血清骨鈣素和低尿cAMP 值，表明了骨形成增加和骨吸收減少[43]。Lv 等利用生長(zhǎng)期大鼠探索了SPH-Ca 復(fù)合物對(duì)骨量的作用。用乳酸鈣，SPH-Ca 復(fù)合物和酪蛋白磷酸肽鈣飼喂大鼠4 周后，與對(duì)照組和乳酸鈣組相比，口服SPH-Ca 顯著增加了大鼠股骨密度，同時(shí)SPH-Ca 與CPP-Ca 組之間股骨和腰椎骨密度無(wú)明顯差異[44]。除此之外，Zhao等研究了脫鹽鴨蛋清肽（DPs），磷酸化 DPs（PDPs）和脫鹽鴨蛋清肽-鈣復(fù)合物（DPs-Ca）對(duì)體內(nèi)鈣吸收的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明PDPs 比DPs 更有效地提高鈣吸收和骨強(qiáng)度，并且DPs-Ca 復(fù)合物比DPs 和CaCO3混合物更有利于骨的累積[45]。

絕經(jīng)后女性早期骨量下降較為明顯，鈣流失嚴(yán)重，容易引起骨質(zhì)疏松的發(fā)生。雌性成年大鼠卵巢切除后，體內(nèi)雌激素的缺乏，骨質(zhì)量也會(huì)逐漸下降并出現(xiàn)骨質(zhì)疏松性改變，類(lèi)似于絕經(jīng)后婦女會(huì)產(chǎn)生的一些特征。因此，有研究利用卵巢切除大鼠作為研究絕經(jīng)后鈣流失和鈣在體內(nèi)吸收利用的模型。Yamaguchi 等使用去卵巢大鼠研究了CPPs 對(duì)Ca 生物利用度的影響，指出補(bǔ)充CPPs 的膳食補(bǔ)充劑可以改善OVX 大鼠對(duì)Ca 的利用，且對(duì)OVX 誘導(dǎo)的骨損失具有預(yù)防作用[46]。Liu 等發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合口服牛膠原肽和檸檬酸鈣可以抑制OVX 大鼠的骨質(zhì)流失[47]。

另外，缺鈣大鼠也是研究鈣生物利用度的模型，黃海等通過(guò)飼喂缺鈣飼料構(gòu)造缺鈣大鼠模型，研究魚(yú)卵肽鈣復(fù)合物（EPP-Ca）對(duì)缺鈣大鼠的補(bǔ)鈣效果。結(jié)果表明EPP-Ca 的補(bǔ)鈣效果顯著優(yōu)于無(wú)機(jī)鈣，且與酪蛋白磷酸肽鈣復(fù)合物（CPPs-Ca）效果相當(dāng)[48]。韓櫻等也利用缺鈣大鼠模型研究了蛋清肽-鈣配合物（egg white peptide binding with calcium，EWP-Ca）在動(dòng)物體內(nèi)的補(bǔ)鈣效果，試驗(yàn)結(jié)果證明與缺鈣模型組相比，高劑量EWP-Ca 組能極顯著增加大鼠股骨直徑、干質(zhì)量、骨鈣含量及股骨密度等，與鈣含量相同的CaCO3組相比，EWP-Ca 高劑量組股骨直徑、骨鈣含量極顯著和顯著增加[49]。Chen 等人發(fā)現(xiàn)，羅非魚(yú)水解蛋白水解鈣復(fù)合物（TSPH-Ca）也可顯著改善缺鈣大鼠股骨的物理和生物力學(xué)特性[22]。

肽的磷酸部分對(duì)鈣的利用是必不可少的，Tsuchita等的發(fā)現(xiàn)說(shuō)明CPPs 可以提供P 來(lái)促進(jìn)骨形成[43]。Zhao、Choi 等也證明了磷酸部分的重要性。同時(shí)，肽螯合鈣與無(wú)機(jī)鈣相比，具有較好的生物利用度，可作為良好的鈣補(bǔ)充劑[45，10]。

5 結(jié)論與展望

本文概述了肽鈣復(fù)合物在結(jié)合機(jī)制、制備方法、吸收途徑、生物利用度等方面的相關(guān)研究?jī)?nèi)容。肽鈣復(fù)合物作為新一代鈣制劑，其多肽來(lái)源十分豐富，同時(shí)不同的多肽還具有不同的生理活性，這類(lèi)生物鈣穩(wěn)定性好、利用度高，可作為食品功能成分或鈣補(bǔ)充劑，對(duì)促進(jìn)國(guó)民健康具有極大的意義。

近年來(lái)，隨著生活水平的不斷提高，國(guó)民缺鈣問(wèn)題有所改善，但仍然存在攝入量不足的問(wèn)題，《2017 年中國(guó)居民食品營(yíng)養(yǎng)健康關(guān)注度大數(shù)據(jù)》顯示，鈣、鐵、鉀是最受關(guān)注的兒童營(yíng)養(yǎng)素前三甲。目前，市場(chǎng)上補(bǔ)鈣制劑的品種和劑型都日益豐富，但大多還集中在無(wú)機(jī)鈣和有機(jī)鈣，螯合鈣商業(yè)產(chǎn)品還主要是酪蛋白磷酸肽螯合鈣、乳清蛋白肽螯合鈣，且價(jià)格較高，如何發(fā)掘優(yōu)質(zhì)原料、改進(jìn)生產(chǎn)工藝、提升產(chǎn)品質(zhì)量，推進(jìn)螯合鈣的商業(yè)化進(jìn)程是亟需解決的問(wèn)題，其中也包含一些科學(xué)問(wèn)題需進(jìn)一步深入探索和明確。一是除磷酸基團(tuán)-鈣、羧基-鈣結(jié)合模式外，還有些哪些基團(tuán)可與鈣結(jié)合，哪種結(jié)合模式的效率更高；二是酪蛋白磷酸肽和卵黃磷蛋白磷酸肽等磷酸化肽被發(fā)現(xiàn)對(duì)鈣的促進(jìn)吸收效果較好，是否與其磷酸化結(jié)構(gòu)有關(guān)，可否通過(guò)對(duì)多肽進(jìn)行磷酸化改性進(jìn)一步提高多肽螯合鈣的生物利用度；三是食物中的植酸、草酸、單寧以及纖維等會(huì)影響鈣的吸收，如何通過(guò)包埋等技術(shù)手段提高鈣在腸道中的可溶性和生物有效性。