魏婕，丁爽，張明，羅敏，周珊，羅璠

（西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，現(xiàn)代生物技術(shù)國家民委重點實驗室，青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川成都610041）

乳酸菌細菌素是由乳酸菌在核糖體合成并分泌的一種具有抑菌活性的蛋白或多肽類物質(zhì)[1-2]，其作為添加劑使用時具有許多優(yōu)良性質(zhì)，如選擇性殺菌、對動物無毒性、無抗原性、熱穩(wěn)定性、無副作用、不會對環(huán)境造成污染等，因此具有廣闊的應用前景[3-4]，成為近年來的研究熱點。乳酸菌細菌素可以通過黏在細胞膜上形成通透孔道來達到殺死細胞的目的，還可以通過破壞細胞膜完整性使目標細胞死亡[5-6]。目前許多研究表明添加細菌素有效的提高了各類產(chǎn)品的安全性和品質(zhì)[7-9]，市場的需求量逐漸提高。

但是，在自然狀態(tài)下，周圍環(huán)境以及理化因素對乳酸菌素生物合成過程影響很大[10]。而在實驗室培養(yǎng)或工業(yè)生產(chǎn)中，乳酸菌素生物合成的能力和產(chǎn)量，除了受菌株自身生長情況的影響外[11]，還受發(fā)酵條件如培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等諸多因素的影響[12]，有研究表明，細菌素的產(chǎn)量和發(fā)酵條件有關(guān)，但是細菌的最佳發(fā)酵條件和細菌的最適生長條件往往是不同的[13]，這種情況造成乳酸菌素的產(chǎn)量很低，嚴重制約了乳酸菌素的工業(yè)化生產(chǎn)及應用。

本試驗以實驗室自行篩選的高產(chǎn)乳酸菌素屎腸球菌B13為研究對象，其所產(chǎn)的乳酸菌素對革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、沙門氏菌以及志賀氏菌等）都具有良好的抑菌性能，有作為天然防腐劑替代抗生素的潛力，因此在單因素試驗的基礎上用響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件，獲得該菌產(chǎn)乳酸菌素的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)，以提高該菌株細菌素的產(chǎn)量，為進一步的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)和試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

試驗菌株：來源于腸道中的高產(chǎn)乳酸菌素屎腸球菌B13，西南民族大學現(xiàn)代生物技術(shù)國家民委重點實驗室分離鑒定保藏。

指示菌：金黃色葡萄球菌，西南民族大學現(xiàn)代生物技術(shù)國家民委重點實驗室分離鑒定保藏。

MRS 液體培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 5.0 g，酵母粉4.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，葡萄糖 20.0 g，吐溫 80 1.0 mL，硫酸鎂 0.2 g，硫酸錳 0.05 g，去離子水 1 000 mL，121 ℃滅菌 20 min，冷卻備用。

MRS 固體培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 5.0 g，酵母粉4.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，葡萄糖 20.0 g，吐溫 80 1.0 mL，硫酸鎂 0.2 g，硫酸錳0.05 g，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL，121℃滅菌20 min，倒平板備用。

LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉 10 g，去離子水 1 000 mL，121 ℃滅菌 20 min，冷卻備用；LB 固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，去離子水 1 000 mL，瓊脂 15 g，121 ℃滅菌 20 min，倒平板備用。

1.2 菌株的活化

將冷凍保藏的屎腸球菌B13劃線于MRS 固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h；挑取單菌落接種于10 mL 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，作為種子液。

1.3 發(fā)酵上清液的制備

將種子液依照2 %的接種量接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，得到試驗所需的發(fā)酵液。離心（6 000 r/min，15 min），棄菌體沉淀，將上清液迅速轉(zhuǎn)移至新的滅菌EP 管中，用HCl 溶液和NaOH 溶液將上清液 pH 調(diào)至 6.0，用 0.22 μm 無菌濾膜過濾，4 ℃冷藏保存。

1.4 抑菌活性的測定

運用牛津杯法[14]，取100 μL 金黃色葡萄球菌稀釋液（OD600=0.5），用滅菌棉簽均勻涂布于事先制備好的LB 固體培養(yǎng)平板上，每個平板上等距放置3 個牛津杯，每個牛津杯加入200 μL 屎腸球菌B13上清液。將上述平板先放在4 ℃冰箱3 h～4 h，使上清液充分滲透到培養(yǎng)基中，再于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，正置培養(yǎng)6 h～8 h。以游標卡尺測定的抑菌圈直徑來顯示抑菌能力大小，每個處理3 個重復，求其平均值。

乳酸菌素抑菌效價標準曲線的測定：以Nisin（尼生素）標準效價的對數(shù)值為橫坐標，以抑菌圈直徑為縱坐標，繪制標準曲線，根據(jù)標曲推演出回歸方程：y=3.55x-10.19（R2=0.996 0），式中：y 為抑菌效價的對數(shù)值；x 為抑菌圈直徑，mm，由此方程確定屎腸球菌B13所產(chǎn)乳酸菌素的相對效價。

1.5 單因素試驗

1.5.1 培養(yǎng)基初始pH 值

按照2%的接種量將培養(yǎng)24 h 的屎腸球菌B13種子液，分別接種到初始 pH 值為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的滅菌的 MRS 液體培養(yǎng)基中，每個處理設置3 個平行，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。檢測上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.5.2 種齡

分別將種齡為 10、12、14、16、18、20、22、24 h 的屎腸球菌B13種子液，按照2%的接種量接種于pH=6.0的MRS 液體培養(yǎng)基中，每個處理設置3 個平行，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。檢測上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.5.3 接種量

將培養(yǎng)24 h 的屎腸球菌B13種子液按照1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量，分別接種于pH=6.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中，每個處理設置3 個平行，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。檢測上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.5.4 發(fā)酵溫度

將培養(yǎng)24 h 的屎腸球菌B13種子液按照2%的接種量，接種到pH=6.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中，分別在31、34、37 ℃的條件下發(fā)酵 24 h，每個處理設置 3 個平行。檢測上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.5.5 發(fā)酵時間

將培養(yǎng)24 h 的屎腸球菌B13種子液按照2%的接種量，接種到pH=6.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中，恒溫37 ℃，分別發(fā)酵 12、14、16、18、20、22、24、36 h，每個處理設置3 個平行。檢測上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.6 響應面法優(yōu)化屎腸球菌B13發(fā)酵條件

在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken 的中心組合試驗設計原理，確定中心組合試驗因素與水平，并以相對抑菌效價為響應值進行響應面分析試驗，優(yōu)化屎腸球菌B13產(chǎn)乳酸菌素的發(fā)酵條件，試驗因素水平及編碼見表1。

表1 試驗因素水平及編碼Table 1 Factors，levels and codes of response surface tests

1.7 統(tǒng)計分析

首先運用Microsoft Excel 對上述試驗所得數(shù)據(jù)進行初步處理，再利用SPSS 18.0 軟件輔助進行分析，最后應用Design Expert 7.1 軟件對響應曲面優(yōu)化數(shù)據(jù)進行擬合分析，推導擬合方程。數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗采用單因素方差分析（One-way ANOVA）分析，Duncan 法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 培養(yǎng)基初始pH 值對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響

培養(yǎng)基的初始pH 值對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響結(jié)果見圖1。

圖1 起始pH 值對屎腸球菌B13 合成乳酸菌素的影響Fig.1 Effect of initial pH on bacteriocin production from Enterococcus faecium B13

如圖1 所示當培養(yǎng)基初始pH 值在5.0～6.0 的范圍內(nèi)，屎腸球菌B13合成乳酸菌素的抑菌效價呈現(xiàn)峰值（P＜0.05），當 pH 值超過 6.0 以后，乳酸菌素的抑菌活性明顯降低。因此選取培養(yǎng)基初始pH=5.5 為響應面優(yōu)化試驗的中心試驗點。

2.1.2 接種量對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響

接種量對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響結(jié)果見圖2。

圖2 接種量對屎腸球菌B13 合成乳酸菌素的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on bacteriocin production from Enterococcus faecium B13

如圖2 所示，接種量達為5%時，相對抑菌效價最高。雖然方差分析表明接種量對屎腸球菌B13合成乳酸菌素無顯著影響（P＞0.05），但圖中卻明確顯示出抑菌效價隨著接種量的增大呈現(xiàn)先增后減的態(tài)勢。因此，選取接種量4.5%為響應面的中心試驗點。

2.1.3 發(fā)酵溫度對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響

發(fā)酵溫度對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響結(jié)果見圖3。

圖3 培養(yǎng)溫度對屎腸球菌B13 合成乳酸菌素的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on bacteriocin production from Enterococcus faecium B13

如圖3 所示，在31 ℃時，乳酸菌素的抑菌效果最好（P＜0.05），隨著培養(yǎng)溫度的升高，抑菌效價不斷降低。因此，選取培養(yǎng)溫度34 ℃作為響應面的中心試驗點。

2.1.4 其它因素對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響

試驗結(jié)果表明種齡和發(fā)酵時間對屎腸球菌B13合成乳酸菌素影響不顯著（P＞0.05），因此不選用種齡和發(fā)酵時間作為考察因素。一般來說，細菌素的合成與菌體自身的生長繁殖存在一定關(guān)系。但有研究顯示[15]，當菌體細胞生長到中后期時，有害代謝產(chǎn)物不斷積累導致細胞自溶，胞內(nèi)的蛋白酶釋放到培養(yǎng)基中，使細菌素被降解，抑菌效價也隨之減弱；同時細菌產(chǎn)生的酸性物質(zhì)在培養(yǎng)液中大量富集，這使得菌體細胞對細菌素產(chǎn)生吸附作用，也會降低培養(yǎng)液的抑菌效價。

2.2 響應面試驗分析

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

響應面試驗設計與結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設計與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests

如表2 所示，按照Box-Benhnken 設計進行試驗，所得數(shù)據(jù)由Design Expert 7.13 軟件進行分析，建立Y（屎腸球菌B13合成乳酸菌素的相對抑菌效價）關(guān)于編碼自變量X1（接種量）、X2（培養(yǎng)基初始pH）、X3（發(fā)酵溫度）的二次多項回歸方程：

響應面的回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression model

對該模型進行方差分析，結(jié)果如表3 所示，本試驗構(gòu)建的二次多項模型具有極高的顯著性（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.717 4），且模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.998 0，僅有總變異的0.20%不能用此模型來解釋，表明該模型與試驗擬合良好，自變量與響應值之間存在顯著的線性關(guān)系，能夠描述和預測不同培養(yǎng)條件對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響。

由表3 可知：3 個因素中發(fā)酵溫度對屎腸球菌B13合成細菌素有顯著影響；接種量與培養(yǎng)基初始pH 之間、培養(yǎng)基初始pH 與發(fā)酵溫度之間互作明顯，但接種量與發(fā)酵溫度之間沒有互作效應。屎腸球菌B13合成乳酸菌素會受到以上3 個因素的交互影響，且影響程度依次為：發(fā)酵溫度＞培養(yǎng)基初始pH＞接種量。

2.2.2 響應曲面圖及其等高線

接種量和培養(yǎng)基初始pH 值對屎腸球菌B13合成乳酸菌素影響的響應面圖及等高線如圖4 所示。

圖4 接種量和培養(yǎng)基初始pH 值對屎腸球菌B13 合成乳酸菌素影響的響應曲面圖及等高線Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between inoculation amount and innitial pH on bacteriocin production

由圖4 中的響應曲面可以看出，當接種量固定時，若培養(yǎng)基初始pH 值小于5.5，該菌所產(chǎn)乳酸菌素的效價隨起始pH 值的增加而增大；若培養(yǎng)基初始pH 值超過5.5，抑菌活性則隨之下降。當接種量在4.5%左右、培養(yǎng)基初始pH 值在5.5 左右時，屎腸球菌B13合成乳酸菌素的抑菌活性最高。陳琳等研究表明pH 值較低的培養(yǎng)條件更適于細菌素的合成[16]。其他研究[17]表明屎腸球菌WHE81 分泌的乳酸菌素的最適pH 值為5.0。由此可見最適pH 值可能與菌株個體特性有關(guān)。

接種量和發(fā)酵溫度對屎腸球菌B13合成乳酸菌素影響的響應曲面圖及等高線如圖5 所示。

圖5 接種量和發(fā)酵溫度對屎腸球菌B13 合成乳酸菌素影響的響應曲面圖及等高線Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between inoculation amount and fermentation temperature on bacteriocin production

由圖5 中的響應曲面可以看出，當發(fā)酵溫度固定時，若接種量小于4.5%，該菌所產(chǎn)乳酸菌素的效價隨接種量的增加而增大；若接種量大于4.5%，抑菌活性則隨之下降。當接種量在4.5%左右、發(fā)酵溫度在34 ℃左右時，屎腸球菌B13合成乳酸菌素的抑菌活性最高。研究結(jié)果與Aasen 等[18]研究結(jié)果一致。

培養(yǎng)基初始pH 值和發(fā)酵溫度對屎腸球菌B13合成乳酸菌素影響的響應曲面圖及等高線圖如圖6 所示。

圖6 培養(yǎng)基初始pH 值和發(fā)酵溫度對屎腸球菌B13 合成乳酸菌素影響的響應曲面圖及等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between innitial pH and fermentation temperature on bacteriocin production

由圖6 中的響應曲面可以看出，當培養(yǎng)基初始pH值固定時，若培養(yǎng)溫度小于34 ℃，該菌所產(chǎn)乳酸菌素的效價隨溫度的提高而增大；若培養(yǎng)溫度高于34 ℃，抑菌活性也隨之下降。當培養(yǎng)溫度在34 ℃左右，初始pH 值在5.5 左右時，屎腸球菌B13合成乳酸菌素的抑菌活性最高。前期研究關(guān)于菌種合成細菌素的最適溫度的報道差異較大，魯晶晶等[19]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌LJ-3產(chǎn)細菌素的最適溫度為30 ℃。Leroy 等[20]在研究屎腸球菌RZSC5 時發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)細菌素的最適溫度為35 ℃，說明細菌素合成的最適溫度具有菌株特異性。雖然不同的菌株產(chǎn)細菌素的最適溫度不同，但多數(shù)研究證明當菌株處于較低的培養(yǎng)溫度時反而能獲得相對較高的細菌素產(chǎn)量[21]。菌體之所以會生成細菌素很可能是出于對不利環(huán)境的應激，因此略低于細菌最適生長溫度的培養(yǎng)條件有助于獲得更多的細菌素[22-23]。

2.2.3 回歸模型的驗證

應用Design-Expert 7.1.3 軟件求得二次曲面方程的極值，得到：當接種量為4.37%、培養(yǎng)基初始pH 值為5.28、培養(yǎng)溫度為32.80 ℃時，屎腸球菌B13合成乳酸菌素的抑菌效價最高，可達5.16×108IU/mL。

為檢驗響應面法優(yōu)化的準確性，本試驗對優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進行驗證，發(fā)現(xiàn)實際值（5.32×108IU/mL）與預測值（5.16×108IU/mL）擬合程度高，并對原始培養(yǎng)條件下和優(yōu)化條件下的乳酸菌素抑菌效價進行對比，結(jié)果顯示響應曲面優(yōu)化后的乳酸菌素抑菌效價達到5.32×108IU/mL，較原始培養(yǎng)條件（2.18×108IU/mL）提高了1.44 倍。

3 結(jié)論

本試驗首先采用單因素法，篩選出接種量、培養(yǎng)基初始pH 值、發(fā)酵溫度3 種因素對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的抑菌效價有較大影響，然后進行響應曲面優(yōu)化試驗，最終確定其最佳培養(yǎng)條件為：接種量4.4%、培養(yǎng)基初始pH 5.3、發(fā)酵溫度33 ℃，在此條件下，屎腸球菌B13合成乳酸菌素的抑菌效價高達5.32×108IU/mL，較原培養(yǎng)條件下抑菌效價提高1.44 倍。