魏婕，丁爽，張明，羅敏，周珊，羅璠

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，現(xiàn)代生物技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041）

乳酸菌細(xì)菌素是由乳酸菌在核糖體合成并分泌的一種具有抑菌活性的蛋白或多肽類物質(zhì)[1-2]，其作為添加劑使用時(shí)具有許多優(yōu)良性質(zhì)，如選擇性殺菌、對動(dòng)物無毒性、無抗原性、熱穩(wěn)定性、無副作用、不會(huì)對環(huán)境造成污染等，因此具有廣闊的應(yīng)用前景[3-4]，成為近年來的研究熱點(diǎn)。乳酸菌細(xì)菌素可以通過黏在細(xì)胞膜上形成通透孔道來達(dá)到殺死細(xì)胞的目的，還可以通過破壞細(xì)胞膜完整性使目標(biāo)細(xì)胞死亡[5-6]。目前許多研究表明添加細(xì)菌素有效的提高了各類產(chǎn)品的安全性和品質(zhì)[7-9]，市場的需求量逐漸提高。

但是，在自然狀態(tài)下，周圍環(huán)境以及理化因素對乳酸菌素生物合成過程影響很大[10]。而在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)或工業(yè)生產(chǎn)中，乳酸菌素生物合成的能力和產(chǎn)量，除了受菌株自身生長情況的影響外[11]，還受發(fā)酵條件如培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等諸多因素的影響[12]，有研究表明，細(xì)菌素的產(chǎn)量和發(fā)酵條件有關(guān)，但是細(xì)菌的最佳發(fā)酵條件和細(xì)菌的最適生長條件往往是不同的[13]，這種情況造成乳酸菌素的產(chǎn)量很低，嚴(yán)重制約了乳酸菌素的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。

本試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室自行篩選的高產(chǎn)乳酸菌素屎腸球菌B13為研究對象，其所產(chǎn)的乳酸菌素對革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、沙門氏菌以及志賀氏菌等）都具有良好的抑菌性能，有作為天然防腐劑替代抗生素的潛力，因此在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件，獲得該菌產(chǎn)乳酸菌素的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)，以提高該菌株細(xì)菌素的產(chǎn)量，為進(jìn)一步的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

試驗(yàn)菌株：來源于腸道中的高產(chǎn)乳酸菌素屎腸球菌B13，西南民族大學(xué)現(xiàn)代生物技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保藏。

指示菌：金黃色葡萄球菌，西南民族大學(xué)現(xiàn)代生物技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保藏。

MRS 液體培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 5.0 g，酵母粉4.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，葡萄糖 20.0 g，吐溫 80 1.0 mL，硫酸鎂 0.2 g，硫酸錳 0.05 g，去離子水 1 000 mL，121 ℃滅菌 20 min，冷卻備用。

MRS 固體培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 5.0 g，酵母粉4.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，葡萄糖 20.0 g，吐溫 80 1.0 mL，硫酸鎂 0.2 g，硫酸錳0.05 g，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL，121℃滅菌20 min，倒平板備用。

LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉 10 g，去離子水 1 000 mL，121 ℃滅菌 20 min，冷卻備用；LB 固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，去離子水 1 000 mL，瓊脂 15 g，121 ℃滅菌 20 min，倒平板備用。

1.2 菌株的活化

將冷凍保藏的屎腸球菌B13劃線于MRS 固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h；挑取單菌落接種于10 mL 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，作為種子液。

1.3 發(fā)酵上清液的制備

將種子液依照2 %的接種量接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，得到試驗(yàn)所需的發(fā)酵液。離心（6 000 r/min，15 min），棄菌體沉淀，將上清液迅速轉(zhuǎn)移至新的滅菌EP 管中，用HCl 溶液和NaOH 溶液將上清液 pH 調(diào)至 6.0，用 0.22 μm 無菌濾膜過濾，4 ℃冷藏保存。

1.4 抑菌活性的測定

運(yùn)用牛津杯法[14]，取100 μL 金黃色葡萄球菌稀釋液（OD600=0.5），用滅菌棉簽均勻涂布于事先制備好的LB 固體培養(yǎng)平板上，每個(gè)平板上等距放置3 個(gè)牛津杯，每個(gè)牛津杯加入200 μL 屎腸球菌B13上清液。將上述平板先放在4 ℃冰箱3 h～4 h，使上清液充分滲透到培養(yǎng)基中，再于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，正置培養(yǎng)6 h～8 h。以游標(biāo)卡尺測定的抑菌圈直徑來顯示抑菌能力大小，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，求其平均值。

乳酸菌素抑菌效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：以Nisin（尼生素）標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)曲推演出回歸方程：y=3.55x-10.19（R2=0.996 0），式中：y 為抑菌效價(jià)的對數(shù)值；x 為抑菌圈直徑，mm，由此方程確定屎腸球菌B13所產(chǎn)乳酸菌素的相對效價(jià)。

1.5 單因素試驗(yàn)

1.5.1 培養(yǎng)基初始pH 值

按照2%的接種量將培養(yǎng)24 h 的屎腸球菌B13種子液，分別接種到初始 pH 值為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的滅菌的 MRS 液體培養(yǎng)基中，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)平行，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。檢測上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.5.2 種齡

分別將種齡為 10、12、14、16、18、20、22、24 h 的屎腸球菌B13種子液，按照2%的接種量接種于pH=6.0的MRS 液體培養(yǎng)基中，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)平行，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。檢測上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.5.3 接種量

將培養(yǎng)24 h 的屎腸球菌B13種子液按照1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量，分別接種于pH=6.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)平行，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。檢測上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.5.4 發(fā)酵溫度

將培養(yǎng)24 h 的屎腸球菌B13種子液按照2%的接種量，接種到pH=6.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中，分別在31、34、37 ℃的條件下發(fā)酵 24 h，每個(gè)處理設(shè)置 3 個(gè)平行。檢測上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.5.5 發(fā)酵時(shí)間

將培養(yǎng)24 h 的屎腸球菌B13種子液按照2%的接種量，接種到pH=6.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中，恒溫37 ℃，分別發(fā)酵 12、14、16、18、20、22、24、36 h，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)平行。檢測上清液的抑菌性能，求其平均值。

1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化屎腸球菌B13發(fā)酵條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，確定中心組合試驗(yàn)因素與水平，并以相對抑菌效價(jià)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，優(yōu)化屎腸球菌B13產(chǎn)乳酸菌素的發(fā)酵條件，試驗(yàn)因素水平及編碼見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factors，levels and codes of response surface tests

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

首先運(yùn)用Microsoft Excel 對上述試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，再利用SPSS 18.0 軟件輔助進(jìn)行分析，最后應(yīng)用Design Expert 7.1 軟件對響應(yīng)曲面優(yōu)化數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，推導(dǎo)擬合方程。數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析（One-way ANOVA）分析，Duncan 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)基初始pH 值對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響

培養(yǎng)基的初始pH 值對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響結(jié)果見圖1。

圖1 起始pH 值對屎腸球菌B13 合成乳酸菌素的影響Fig.1 Effect of initial pH on bacteriocin production from Enterococcus faecium B13

如圖1 所示當(dāng)培養(yǎng)基初始pH 值在5.0～6.0 的范圍內(nèi)，屎腸球菌B13合成乳酸菌素的抑菌效價(jià)呈現(xiàn)峰值（P＜0.05），當(dāng) pH 值超過 6.0 以后，乳酸菌素的抑菌活性明顯降低。因此選取培養(yǎng)基初始pH=5.5 為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的中心試驗(yàn)點(diǎn)。

2.1.2 接種量對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響

接種量對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響結(jié)果見圖2。

圖2 接種量對屎腸球菌B13 合成乳酸菌素的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on bacteriocin production from Enterococcus faecium B13

如圖2 所示，接種量達(dá)為5%時(shí)，相對抑菌效價(jià)最高。雖然方差分析表明接種量對屎腸球菌B13合成乳酸菌素?zé)o顯著影響（P＞0.05），但圖中卻明確顯示出抑菌效價(jià)隨著接種量的增大呈現(xiàn)先增后減的態(tài)勢。因此，選取接種量4.5%為響應(yīng)面的中心試驗(yàn)點(diǎn)。

2.1.3 發(fā)酵溫度對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響

發(fā)酵溫度對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響結(jié)果見圖3。

圖3 培養(yǎng)溫度對屎腸球菌B13 合成乳酸菌素的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on bacteriocin production from Enterococcus faecium B13

如圖3 所示，在31 ℃時(shí)，乳酸菌素的抑菌效果最好（P＜0.05），隨著培養(yǎng)溫度的升高，抑菌效價(jià)不斷降低。因此，選取培養(yǎng)溫度34 ℃作為響應(yīng)面的中心試驗(yàn)點(diǎn)。

2.1.4 其它因素對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明種齡和發(fā)酵時(shí)間對屎腸球菌B13合成乳酸菌素影響不顯著（P＞0.05），因此不選用種齡和發(fā)酵時(shí)間作為考察因素。一般來說，細(xì)菌素的合成與菌體自身的生長繁殖存在一定關(guān)系。但有研究顯示[15]，當(dāng)菌體細(xì)胞生長到中后期時(shí)，有害代謝產(chǎn)物不斷積累導(dǎo)致細(xì)胞自溶，胞內(nèi)的蛋白酶釋放到培養(yǎng)基中，使細(xì)菌素被降解，抑菌效價(jià)也隨之減弱；同時(shí)細(xì)菌產(chǎn)生的酸性物質(zhì)在培養(yǎng)液中大量富集，這使得菌體細(xì)胞對細(xì)菌素產(chǎn)生吸附作用，也會(huì)降低培養(yǎng)液的抑菌效價(jià)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests

如表2 所示，按照Box-Benhnken 設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)由Design Expert 7.13 軟件進(jìn)行分析，建立Y（屎腸球菌B13合成乳酸菌素的相對抑菌效價(jià)）關(guān)于編碼自變量X1（接種量）、X2（培養(yǎng)基初始pH）、X3（發(fā)酵溫度）的二次多項(xiàng)回歸方程：

響應(yīng)面的回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression model

對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3 所示，本試驗(yàn)構(gòu)建的二次多項(xiàng)模型具有極高的顯著性（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.717 4），且模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.998 0，僅有總變異的0.20%不能用此模型來解釋，表明該模型與試驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間存在顯著的線性關(guān)系，能夠描述和預(yù)測不同培養(yǎng)條件對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的影響。

由表3 可知：3 個(gè)因素中發(fā)酵溫度對屎腸球菌B13合成細(xì)菌素有顯著影響；接種量與培養(yǎng)基初始pH 之間、培養(yǎng)基初始pH 與發(fā)酵溫度之間互作明顯，但接種量與發(fā)酵溫度之間沒有互作效應(yīng)。屎腸球菌B13合成乳酸菌素會(huì)受到以上3 個(gè)因素的交互影響，且影響程度依次為：發(fā)酵溫度＞培養(yǎng)基初始pH＞接種量。

2.2.2 響應(yīng)曲面圖及其等高線

接種量和培養(yǎng)基初始pH 值對屎腸球菌B13合成乳酸菌素影響的響應(yīng)面圖及等高線如圖4 所示。

圖4 接種量和培養(yǎng)基初始pH 值對屎腸球菌B13 合成乳酸菌素影響的響應(yīng)曲面圖及等高線Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between inoculation amount and innitial pH on bacteriocin production

由圖4 中的響應(yīng)曲面可以看出，當(dāng)接種量固定時(shí)，若培養(yǎng)基初始pH 值小于5.5，該菌所產(chǎn)乳酸菌素的效價(jià)隨起始pH 值的增加而增大；若培養(yǎng)基初始pH 值超過5.5，抑菌活性則隨之下降。當(dāng)接種量在4.5%左右、培養(yǎng)基初始pH 值在5.5 左右時(shí)，屎腸球菌B13合成乳酸菌素的抑菌活性最高。陳琳等研究表明pH 值較低的培養(yǎng)條件更適于細(xì)菌素的合成[16]。其他研究[17]表明屎腸球菌WHE81 分泌的乳酸菌素的最適pH 值為5.0。由此可見最適pH 值可能與菌株個(gè)體特性有關(guān)。

接種量和發(fā)酵溫度對屎腸球菌B13合成乳酸菌素影響的響應(yīng)曲面圖及等高線如圖5 所示。

圖5 接種量和發(fā)酵溫度對屎腸球菌B13 合成乳酸菌素影響的響應(yīng)曲面圖及等高線Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between inoculation amount and fermentation temperature on bacteriocin production

由圖5 中的響應(yīng)曲面可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度固定時(shí)，若接種量小于4.5%，該菌所產(chǎn)乳酸菌素的效價(jià)隨接種量的增加而增大；若接種量大于4.5%，抑菌活性則隨之下降。當(dāng)接種量在4.5%左右、發(fā)酵溫度在34 ℃左右時(shí)，屎腸球菌B13合成乳酸菌素的抑菌活性最高。研究結(jié)果與Aasen 等[18]研究結(jié)果一致。

培養(yǎng)基初始pH 值和發(fā)酵溫度對屎腸球菌B13合成乳酸菌素影響的響應(yīng)曲面圖及等高線圖如圖6 所示。

圖6 培養(yǎng)基初始pH 值和發(fā)酵溫度對屎腸球菌B13 合成乳酸菌素影響的響應(yīng)曲面圖及等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between innitial pH and fermentation temperature on bacteriocin production

由圖6 中的響應(yīng)曲面可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值固定時(shí)，若培養(yǎng)溫度小于34 ℃，該菌所產(chǎn)乳酸菌素的效價(jià)隨溫度的提高而增大；若培養(yǎng)溫度高于34 ℃，抑菌活性也隨之下降。當(dāng)培養(yǎng)溫度在34 ℃左右，初始pH 值在5.5 左右時(shí)，屎腸球菌B13合成乳酸菌素的抑菌活性最高。前期研究關(guān)于菌種合成細(xì)菌素的最適溫度的報(bào)道差異較大，魯晶晶等[19]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌LJ-3產(chǎn)細(xì)菌素的最適溫度為30 ℃。Leroy 等[20]在研究屎腸球菌RZSC5 時(shí)發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)細(xì)菌素的最適溫度為35 ℃，說明細(xì)菌素合成的最適溫度具有菌株特異性。雖然不同的菌株產(chǎn)細(xì)菌素的最適溫度不同，但多數(shù)研究證明當(dāng)菌株處于較低的培養(yǎng)溫度時(shí)反而能獲得相對較高的細(xì)菌素產(chǎn)量[21]。菌體之所以會(huì)生成細(xì)菌素很可能是出于對不利環(huán)境的應(yīng)激，因此略低于細(xì)菌最適生長溫度的培養(yǎng)條件有助于獲得更多的細(xì)菌素[22-23]。

2.2.3 回歸模型的驗(yàn)證

應(yīng)用Design-Expert 7.1.3 軟件求得二次曲面方程的極值，得到：當(dāng)接種量為4.37%、培養(yǎng)基初始pH 值為5.28、培養(yǎng)溫度為32.80 ℃時(shí)，屎腸球菌B13合成乳酸菌素的抑菌效價(jià)最高，可達(dá)5.16×108IU/mL。

為檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)對優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)實(shí)際值（5.32×108IU/mL）與預(yù)測值（5.16×108IU/mL）擬合程度高，并對原始培養(yǎng)條件下和優(yōu)化條件下的乳酸菌素抑菌效價(jià)進(jìn)行對比，結(jié)果顯示響應(yīng)曲面優(yōu)化后的乳酸菌素抑菌效價(jià)達(dá)到5.32×108IU/mL，較原始培養(yǎng)條件（2.18×108IU/mL）提高了1.44 倍。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首先采用單因素法，篩選出接種量、培養(yǎng)基初始pH 值、發(fā)酵溫度3 種因素對屎腸球菌B13合成乳酸菌素的抑菌效價(jià)有較大影響，然后進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定其最佳培養(yǎng)條件為：接種量4.4%、培養(yǎng)基初始pH 5.3、發(fā)酵溫度33 ℃，在此條件下，屎腸球菌B13合成乳酸菌素的抑菌效價(jià)高達(dá)5.32×108IU/mL，較原培養(yǎng)條件下抑菌效價(jià)提高1.44 倍。