劉衛(wèi)華，于文龍，楊茜，王向紅

（河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定071000）

食品的安全危害主要來自農(nóng)藥、獸藥以及飼料添加劑等[1]。隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，獸藥及飼料添加劑廣泛應用，濫用和超標使用的問題一直存在，造成殘留。獸藥殘留的危害主要有毒性作用、過敏及變態(tài)反應、致癌或致畸變等[2]。氟甲喹（flumequine，F(xiàn)LU）屬于第二代喹諾酮類抗菌藥物，用于預防和治療畜禽類、魚類、蝦蟹類的疾病，作用機理是通過抑制細菌DNA解旋酶的作用，抑制細菌核酸的合成，從而起到殺菌的效果[3]。一些學者研究了氟甲喹的毒性及危害[4-6]。低劑量的氟甲喹對人及和動物產(chǎn)生的危害雖沒有明確的報道，但長期攝入含氟甲喹殘留的食品，可能對人體健康產(chǎn)生潛在的危害。

為了保障動物性食品的安全，保護消費者的健康，世界各國都對氟甲喹的殘留限量作出了規(guī)定。歐盟規(guī)定，F(xiàn)LU 的最高殘留量為：牛、羊、豬肌肉中200 μg/kg，肝臟中 500 μg/kg；牛奶中 50 μg/kg；家禽肌肉中 400 μg/kg，其它種類：肌肉中 200 μg/kg[7]。2002年，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布公告，規(guī)定FLU 的最高殘留量為：牛、羊、豬肌肉中 500 μg/kg，肝臟中 500 μg/kg，奶中50 μg/kg；雞肉中 500 μg/kg[8]。2018 年 6 月 13 日，加拿大食品檢驗局發(fā)布水產(chǎn)品藥物殘留監(jiān)測清單，明確規(guī)定不接受使用氟甲喹[9]。為加強動物性食品安全的監(jiān)管，研究新型、簡便、快速、靈敏度高的氟甲喹檢測方法十分重要。

國內(nèi)外有關氟甲喹檢測的方法主要是儀器分析法[10-13]、免疫分析法[14-16]及其它方法。相比之下，免疫分析法具有成本低、操作簡單、快速、特異性強、靈敏度及準確性較高等優(yōu)點，很適合大量樣本的篩查。固相膜免疫檢測技術是一種基于抗原抗體結(jié)合反應原理、以微孔膜作為固相載體的免疫檢測技術，其最常用的標記物是膠體金。其特點是檢測速度快、靈敏度高、特異性強、操作方便、結(jié)果直觀，無需儀器[17]。目前已有氟甲喹固相膜免疫分析方法的報道[18-19]，但檢測的靈敏度和準確性還有待提高。本研究針對動物性食品中的氟甲喹殘留問題，建立靈敏度和準確性較高的膠體金標記固相膜免疫檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

氟甲喹、氯金酸（HAuCl4）：上海源葉生物科技有限公司；雞卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、福氏不完全佐劑、福氏完全佐劑、過氧化氫脲（CH6N2O3）：美國Sigma 公司；磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O），磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、檸檬酸三鈉：天津科密歐化學試劑公司；Protein ASepharose CL-4B 凝膠層析柱：北京市熱景生物技術有限公司；硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane，NC）：美國 Millipore 公司。

DYCZ-24KS 垂直電泳儀：北京市六一儀器廠；GL-10000C 冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；99-1 型磁力攪拌器：常州市國華儀器有限公司；Sk-1 型旋渦混勻器：海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；UV-2800 紫外可見分光光度計：尤尼克（上海）儀器有限公司；toppeffe 單道微量可調(diào)移液器：上海大龍醫(yī)療設備有限公司；Multiskansky 全波長酶標儀：美國Thermo 公司；96 孔酶標板：廣州潔特生物過濾股份有限公司。

純牛奶、蝦肉、牛肉、豬肉、豬肝：河北省保定市沃爾瑪超市。

試驗動物為2 只健康的新西蘭大耳白兔，雄性，6 周齡，體重約為 1.5 kg。

1.2 完全抗原的合成與鑒定

選用BSA 和OVA 作為載體，采用活潑酯法將FLU 與載體進行偶聯(lián)，制備免疫原FLU-BSA 和包被原FLU-OVA。

采用紫外分光光度法和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法對獲得的偶聯(lián)物進行鑒定。

1.3 氟甲喹多克隆抗體的制備與純化

以FLU-BSA 為免疫原，免疫新西蘭大耳白兔，在頸背部皮下六點和大腿肌肉兩點注射，一共免疫6 次。第六次加強免疫10 d 之后，心臟取血，采用間接競爭ELISA 法測定抗血清的效價和親和力[20]。

采用ProteinA-Sepharose 4B 凝膠柱層析法對抗體進行純化[21]，并采用紫外分光光度法和間接競爭ELISA法鑒定抗體的純化效果。

1.4 膠體金及金標抗體的制備

1.4.1 膠體金的制備及質(zhì)量鑒定

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金[22]。

先通過肉眼觀察膠體金溶液的透明度和顏色以及是否有漂浮物，初步判斷其質(zhì)量。量取3 mL 的膠體金溶液，在450 nm～600 nm 范圍內(nèi)進行紫外掃描，確定其最大吸收峰的波長，并對金顆粒的大小做出初步的估計。

1.4.2 膠體金與FLU 抗體結(jié)合最適pH 值的確定

分別用0.1 mol/L K2CO3或0.1 mol/L HCl 將膠體金溶液的 pH 值調(diào)節(jié)為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0（為了防止膠體金堵塞pH 計的電極，故用精密pH 試紙進行測定）；取100 μL 上述溶液，分別添加到酶標板的孔里，再向每孔中加入0.5 mg/mL 的氟甲喹抗體6 μL，同時設對照組，混合均勻后室溫下靜置15 min；每孔添加20 μL 的10%NaCl 溶液（對照組添加等體積去離子水），混合均勻，525 nm 波長處測定OD 值。

1.4.3 膠體金標記最佳抗體加入量的確定

用硼酸鹽緩沖液將抗體稀釋到0.5 mg/mL，依照表3 的方法確定稀釋后抗體的加入量，對照管中只加硼酸鹽緩沖液。于525 nm 處測吸光值，繪制吸光值-抗體量曲線。曲線發(fā)生轉(zhuǎn)折處所對應的抗體量即是需要的抗體量；在此基礎上增加10%～20%，即是使1 mL 膠體金溶液穩(wěn)定實際所需要抗體的最小量。穩(wěn)定膠體金溶液所需氟甲喹抗體量的優(yōu)化方案見表1。

表1 穩(wěn)定膠體金溶液所需氟甲喹抗體量的優(yōu)化方案Table 1 Optimization methods of FLU antibody quantity for stabilizing colloidal gold solution

將稀釋后抗體、硼酸鹽緩沖液和膠體金溶液混合均勻后，靜置 5 min，分別加入 100 μL 10%NaCl，混合均勻后靜置10 min，于525 nm 下測吸光值。

1.4.4 金標抗體的制備

于磁力攪拌下，逐滴地將抗體加入10 mL 膠體金溶液中，攪拌10 min；逐滴加入10 % BSA，一直加到溶液中的BSA 濃度達到1%，緩慢地攪拌30 min，4 ℃下靜置12 h 過夜。以10 000 r/min 的速度4 ℃離心30 min，將上清液去除，加入金標抗體儲存液至原體積的1/10，備用。

1.5 膠體金標記固相膜的制備

固相膜選用硝酸纖維素膜，在其上面分別包被酶標羊抗兔二抗和FLU-OVA 作為C 帶（控制線）和T 帶（檢測線），二者之間間隔5 mm，37 ℃固定15 min，再用5%脫脂乳封閉30 min 后，用含吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline with Tween 20，PBST）沖洗 3 次，37 ℃干燥后，4 ℃保存。

將金標抗體與待測液混合均勻后，滴加到反應區(qū)。觀察T 帶和C 帶的顯色，根據(jù)顯色情況進行檢測結(jié)果的判斷。結(jié)果判斷如圖1 所示。

圖1 膠體金標記固相膜結(jié)果判斷Fig.1 Results judgment of colloidal gold labeled solid phase membrane

1.6 膠體金標記固相膜檢測條件的優(yōu)化

1.6.1 封閉液的優(yōu)化

以1%明膠、1%BSA、1%酪蛋白、5%脫脂乳、5%甘氨酸封閉膠體金標記固相膜，對照則不經(jīng)任何處理。觀察顯色情況，選擇固相膜的顯色條帶清晰并且沒有背景色的封閉液為優(yōu)化的結(jié)果。

1.6.2 酶標二抗稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

以0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L phosphate buffered saline，1× PBS）溶液稀釋酶標二抗，分別稀釋20、40、80、160、320 倍，然后將其涂在硝酸纖維素膜上，作為控制線（C 帶）。進行顯色后，比較C 帶與T 帶的顯色情況。

1.6.3 包被原包被量與金標抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

用 0.5、1.0、1.5 μg 的包被原在硝酸纖維素膜上包被。用抗體儲存液按 1：1、1：5、1：10（體積比）的比例將免疫金稀釋后，滴加到包被區(qū)，觀察顯色情況，比較顯色的強弱。

1.6.4 氟甲喹標準品與金標抗體混合比例的優(yōu)化

將免疫金分別與濃度為 0、20、40 μg/L 的氟甲喹標準溶液按照 1 ∶1、1 ∶5、1 ∶10（體積比）混合，滴加到包被區(qū)進行顯色。

1.7 最低檢出限的確定

將 0、10、20、40 μg/L 的氟甲喹標準品分別與金標抗體混合，反應5 min 后，再與包被原進行競爭反應，觀察顯色情況，與空白對照相比，出現(xiàn)明顯色差時所對應的最小濃度即為最低檢出限。

1.8 實際樣品的測定

1.8.1 樣品的基質(zhì)消除

準確稱取牛奶（脫脂后的）、蝦肉、牛肉、豬肉、生豬肝、熟豬肝樣品各1.0 g，加入6 mL 1%的乙酸乙腈溶液，超聲處理5 min 后，3 500 r/min 離心5 min。取上清液加入3 mL 的正己烷，渦旋混勻1 min，離心5 min，取下層的液體過0.22 μm 有機濾膜后，備用。

用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L phosphate buffered saline，1×PBS）將樣品提取液分別稀釋 0、10、20、40、80 倍，用膠體金標記固相膜進行測定，觀察顯色情況，找出背景顏色與對照顏色接近時樣品提取液的稀釋倍數(shù)，確定樣品基質(zhì)消除的最佳方法。

1.8.2 樣品的加標回收測定

分別向牛奶（脫脂后的）、蝦肉、牛肉、豬肉、生豬肝、熟豬肝等6 個樣品中，加入3 個不同濃度水平的氟甲喹標準品溶液，按1.8.1 進行基質(zhì)消除，使稀釋后的最終濃度為0、40、60 μg/L，用膠體金標記固相膜測定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 完全抗原的鑒定

2.1.1 紫外分光光度法

由FLU 半抗原、載體蛋白BSA、OVA 及其偶聯(lián)物FLU-BSA、FLU-OVA 的紫外光譜圖可知，F(xiàn)LU 與載體蛋白BSA、OVA 發(fā)生偶聯(lián)后，得到的產(chǎn)物FLU-BSA 和FLU-OVA 的紫外掃描光譜圖與 FLU、BSA 和 OVA 的紫外掃描光譜圖相比，吸收曲線發(fā)生了變化，最大吸收峰的吸光值增加了，這證明載體蛋白上連接上了一定量的FLU 半抗原。

2.1.2 SDS-PAGE 分析法

通過載體蛋白與抗原偶聯(lián)的電泳結(jié)果可知，F(xiàn)LUBSA 的條帶略滯后于BSA 條帶，F(xiàn)LU-OVA 條帶也略滯后于OVA 條帶。SDS 使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，形成蛋白質(zhì)亞基，蛋白質(zhì)亞基的遷移率主要取決于其分子量，而可以忽略電荷的影響。分子量大的遷移率小，反之則大[21]。由此即可判斷，人工合成完全抗原分子量比載體蛋白分子量大，說明人工抗原合成成功。

2.2 氟甲喹多克隆抗體的制備及純化

2.2.1 抗血清效價的測定

抗血清效價隨著免疫次數(shù)的增加而呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，從第一次取血到最后一次心臟取血，抗血清效價均從1 600 升高到較高的12 800。

2.2.2 抗血清親和力測定

圖2 為4 次取血后測定的抗血清親和力的變化圖。

由圖2 可以看出，隨免疫次數(shù)增多，F(xiàn)LU 的抑制率逐漸增大，IC50從 19.79 μg/mL 降低至 0.213 ng/mL。

2.2.3 抗血清純化及純化效果鑒定

抗體純化曲線見圖3。

經(jīng)過計算得出，純化后抗體的濃度為0.64 mg/mL。圖4 為抗血清在純化前和純化后的紫外掃描圖。

圖2 抗血清親和力的變化圖Fig.2 Changes of antiserum affinity

圖3 ProteinA-Sepharose-4B 凝膠柱層析法純化抗血清的色譜圖Fig.3 Antiserum purification by ProteinA-Sepharose-4B column chromatography

圖4 抗血清在純化前和純化后的紫外掃描圖Fig.4 Ultraviolet spectrum of antiserum before and after purified

從圖4 可看出，在純化前的抗血清紫外掃描圖中，出現(xiàn)在波長415、537 nm 和578 nm 處的峰是由抗血清中影響抗原抗體特異性反應的雜質(zhì)（例如血紅蛋白、脂類、維生素以及無機物）所形成的；而在純化后的抗血清紫外掃描圖中，雜質(zhì)峰消失了，只有280 nm 波長處存在一個明顯的蛋白質(zhì)吸收峰。這說明，抗血清經(jīng)過純化后得到的抗體蛋白較為單一。圖5 為抗血清純化前和純化后的親和力變化圖。

圖5 抗血清純化前和純化后的親和力變化圖Fig.5 Changes of antiserum affinity before and after purified

從圖5 可以看出，經(jīng)過純化后，抗血清與抗原的親和力得到了顯著的提高，靈敏度IC50和檢測限IC15均顯著地降低。這說明，抗血清純化能夠明顯增強抗原和抗體的特異性反應。

2.3 膠體金的質(zhì)量鑒定

通過肉眼觀察，制備的膠體金無雜質(zhì)，表面無漂浮物，澄清透明，呈酒紅色。可以初步判斷，膠體金顆粒大小比較均勻，質(zhì)量比較好。

由膠體金溶液的紫外光譜圖可知，在525 nm 處有最大吸收峰。根據(jù)最大吸收波長（y）與金顆粒直徑（x）的線性回歸方程y=0.427 1x+514.56[22]，計算出膠體金顆粒直徑為24.4 nm。

2.4 膠體金與FLU抗體結(jié)合最適pH值的確定

圖6 為與抗體結(jié)合的膠體金溶液pH 值范圍的優(yōu)化結(jié)果。

圖6 膠體金溶液pH 值范圍的優(yōu)化Fig.6 Optimization of pH of colloidal gold

當pH 值大于或等于7.0 時，吸光值趨于穩(wěn)定。一般認為，在大于等于等電點時，被標記的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)電中性，表面張力最大，而且不易聚集，最容易形成牢固的膠體金-蛋白質(zhì)復合物，使膠體金處于穩(wěn)定的狀態(tài)，電解質(zhì)不能將它破壞。所以，確定標記抗體所用膠體金的pH 值為9.0。

2.5 膠體金標記最佳抗體加入量的確定

圖7 為抗體用量的優(yōu)化試驗結(jié)果。

圖7 抗體蛋白用量的優(yōu)化Fig.7 Optimization of antibody protein dosage

與目測的結(jié)果一致，當抗體用量<12 μg 時，有很多游離的金顆粒存在于溶液中，氯化鈉產(chǎn)生的鹽離子效應會使膠體金溶液由紅變藍、出現(xiàn)沉淀；當抗體用量≥12 μg 時，膠體金溶液始終保持紅色，且沒有沉淀產(chǎn)生，吸光值趨于穩(wěn)定。故選擇氟甲喹抗體的加入量為12 μg，在此基礎上增加20%，確定為實際的抗體需要量。

2.6 膠體金標記固相膜檢測條件的優(yōu)化

2.6.1 封閉液的優(yōu)化

從膠體金固相膜封閉液的優(yōu)化結(jié)果可以看出，沒有進行封閉處理的NC 膜在顯色后，條帶較寬；經(jīng)5%甘氨酸處理的顯色條帶寬且背景色深；經(jīng)1%BSA 封閉處理的幾乎看不到顯色條帶，背景色很深；經(jīng)1%明膠和1%酪蛋白封閉的顯色及背景的顏色都比較淺；經(jīng)5%脫脂乳封閉的NC 膜在顯色后，條帶顏色很鮮明，且基本上無背景色。而以5%脫脂乳作為封閉液，成本較低且易于取得，因此，本試驗的封閉液確定選用5%脫脂乳。

2.6.2 酶標二抗稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

從酶標二抗的稀釋倍數(shù)優(yōu)化結(jié)果可以看出，隨酶標二抗稀釋倍數(shù)增大，C 線的顯色變得越來越淺，直至肉眼看不出來。當酶標二抗稀釋40 倍時，C 線的顯色與T 線接近，容易判斷結(jié)果。當酶標二抗稀釋20 倍時，可以明顯地看出，C 線的顯色比T 線深；當酶標二抗稀釋倍數(shù)過大時，C 線的顯色明顯地比T 線淺，則梯度差距不大，均不利于結(jié)果的判斷。所以，酶標二抗的最佳稀釋倍數(shù)選定為40。

2.6.3 包被原包被量與金標抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

包被原包被量及金標抗體稀釋倍數(shù)直接影響到固相膜的顯色，需進行優(yōu)化。其優(yōu)化的結(jié)果見表2。

從表2 可以看出，包被原包被量為0.5 μg 時，檢測線顯色偏淺，說明結(jié)合的金標抗體比較少；包被原包被量為1.5 μg 時，檢測線顯色則偏深；包被原包被量為1.0 μg 時，檢測線顯色較為理想，所以選擇包被量為1.0 μg。金標抗體稀釋倍數(shù)為5 時，所有包被量的固相膜顯色均較為理想。因此，確定包被原包被量1.0 μg、金標抗體稀釋5 倍為最優(yōu)。

2.6.4 氟甲喹標準品與金標抗體混合比例的優(yōu)化

當金標抗體與氟甲喹標準品溶液的混合比例為1 ∶1（體積比）時，檢測線的顏色及背景的顏色都比較深，對于不同濃度的氟甲喹標準溶液，看不出明顯的差異，不易觀察和判斷；當金標抗體與氟甲喹標準品溶液的混合比例為1 ∶10（體積比）時，盡管檢測靈敏度提高了，但顯色整體上都比較淺，也不易觀察和判斷。而當金標抗體與氟甲喹標準品溶液的混合比例為1 ∶5（體積比）時，都容易進行觀察和判斷。因此，確定金標抗體與樣品溶液的混合比例為1 ∶5（體積比）。

2.6.5 最低檢出限的確定

在優(yōu)化的條件下，用試驗制備的膠體金標記固相膜對氟甲喹進行測定，檢測結(jié)果見圖8。

圖8 固相膜檢測結(jié)果Fig.8 Detection result of the solid phase membrane

由圖8 可以看出，隨氟甲喹濃度逐步提高，檢測線的顏色逐步變得越來越淺；氟甲喹濃度<40 μg/L 時，雖然可以看見T 線的顏色，但其顏色與空白對照相比，無法通過目測區(qū)分開；當氟甲喹濃度≥40 μg/L 時，T線的顏色變淺，能夠通過目測將T 線的顏色與空白對照的顏色區(qū)分開。因此，該膠體金標記固相膜對氟甲喹的檢出限為40 μg/L，比文獻報道的基于多克隆抗體的固相膜檢測方法的檢出限低[18-19]。

2.7 樣品的基質(zhì)消除

用1×PBS 緩沖液將生鮮的豬肉、牛肉、蝦肉的提取液稀釋20 倍，將牛奶、生豬肝、熟豬肝的提取液稀釋40 倍后，固相膜的顯色條帶很清晰，并且沒有背景顏色，其顯色效果接近對照的顯色效果，說明消除了基質(zhì)影響。

2.8 樣品的加標回收測定

分別向牛奶（脫脂后的）、蝦肉、牛肉、豬肉、生豬肝、熟豬肝等 6 個樣品中加入 0、10、20 μg/kg 的氟甲喹標準品溶液，進行加標回收測定，結(jié)果見圖9。

圖9 6 種樣品的氟甲喹添加回收測定結(jié)果Fig.9 Detection results of recovery of FLU in six kinds of samples

通過肉眼觀察可知，所有的樣品都可以看到明顯的顯色梯度，說明建立的膠體金標記固相膜免疫檢測方法有效，適用于現(xiàn)場的快速檢測篩查。

3 結(jié)論

本研究制備了氟甲喹多克隆抗體，建立了動物性食品中氟甲喹殘留的膠體金標記固相膜免疫檢測方法，對氟甲喹的最低檢出限為40 μg/L。該方法不需要任何儀器，目測結(jié)果，時間較短，適用于現(xiàn)場大批量樣品的快速檢測和篩選。