李安，劉小雨，張惟廣

（西南大學食品科學學院，重慶400715）

黃酒主要是以稻米為原料釀造而成的酒精度低、酒性醇和、營養(yǎng)豐富的發(fā)酵酒，是國家提倡重點發(fā)展的飲料酒之一[1]。谷子（Setaria itatica），屬禾本科狗尾草屬，具有生育期短、耐干旱、耐貧瘠、耐儲存、價格低廉等優(yōu)點。小米為谷子碾米后的產物，各種營養(yǎng)素含量豐富、比例適宜且消化率高，其中蛋白質、脂肪、礦物質和維生素等均高于大米和玉米[2]。小米黃色素是小米特有的活性成分，主要為類胡蘿卜素類物質，具有保護視覺與上皮細胞、提高人體免疫力、淬滅體內過多自由基等作用[3-4]。采用小米為原料釀制黃酒不僅能提升黃酒營養(yǎng)價值、改善其觀感，同時合理利用小米資源，增加其附加值。因此本研究對小米黃酒的釀造工藝進行探究，并通過響應面分析試驗進行進一步優(yōu)化。

釀造工藝條件的控制水平會在很大程度上影響酒液的品質[5-10]，并且通過對釀造工藝的優(yōu)化能有效控制酒液中有害物質含量[11-13]。本試驗以傳統(tǒng)黃酒釀造工藝及前人研究作為研究的基礎[2，14-15]，重點對小米黃酒釀造中的浸米、糖化、發(fā)酵工藝流程展開研究。以小米黃酒的基本理化指標及感官評分為依據對主發(fā)酵用酵母菌的種類進行篩選，優(yōu)化浸米、糖化工藝，并在單因素試驗的基礎之上，通過響應面試驗設計來確定最佳發(fā)酵工藝，旨在為工業(yè)化生產高質量的小米黃酒提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米：山西東方亮生命科技股份有限公司；安琪釀酒曲（紹酒風味T3）、安琪耐高溫高活性干酵母、安琪生香活性干酵母、安琪黃酒高活性干酵母：安琪酵母公司；D254、2323、K1 酵母：煙臺帝伯士有限公司；葡萄糖標準品（色譜純）：美國Sigma-Aldrich 公司；無水乙醇（色譜純）：成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

LHS-150SC 恒溫恒濕箱：上海齊欣科學儀器有限公司；PB-10 酸度計：德國賽多利斯集團；UV1000 紫外可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；WZS-32 手持式糖度計：上海儀電物理光學儀器有限公司；TGL-16M 臺式高速冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小米黃酒基本釀造工藝流程

選擇6 種釀酒酵母（安琪黃酒高活性干酵母、安琪耐高溫高活性干酵母、安琪生香活性干酵母、D254 酵母、2323 酵母、K1 酵母）進行小米黃酒的釀造，對酒樣的基本理化指標進行測定，并做感官評價，擇優(yōu)選取最適酵母。小米黃酒基本釀造工藝流程：

1.3.2 操作要點

添加小米重量200%的水20 ℃浸米36 h，常壓蒸煮50 min（考慮小米特性，蒸煮時間較糯米適當延長[16]）。酒曲添加量0.4%、水添加量50%、30 ℃糖化48 h。酵母添加量 0.2%、35 ℃發(fā)酵 5 d（1 L 發(fā)酵罐）。

主發(fā)酵結束后，密封后于18 ℃陳釀15 d，離心分離酒糟（8 000 r/min，15 min）取上清液。試驗平行3 次，各指標取平均值。

1.3.3 小米黃酒浸米工藝條件的確定

1.3.3.1 浸米時間對浸米的影響

浸米時間 12、24、36、48、60、72 h。水添加量 200%、25 ℃浸米，測定小米吸水率及米漿水總酸。吸水率通過對小米浸泡前、后稱重進行測定，按如下公式計算：

式中：m0為浸泡前小米質量，g；m1為浸泡后小米質量，g。

1.3.3.2 浸米溫度對浸米的影響

浸米溫度 15、20、25、30、35 ℃。水添加量 200%、浸米48 h，測定小米吸水率及米漿水總酸。

1.3.3.3 水添加量對浸米的影響

水添加量50%、100%、150%、200%、250%。25 ℃浸米48 h，測定小米吸水率及米漿水總酸。

1.3.4 小米黃酒糖化工藝條件的確定

1.3.4.1 糖化溫度對小米糖化的影響

糖化溫度 20、25、30、35、40 ℃。酒曲添加量 0.4%、糖化60 h，測定醪液的糖度、總酸。

1.3.4.2 糖化時間對小米糖化的影響

糖化時間24、36、48、60、72、84h。酒曲添加量0.4%、30 ℃糖化，測定醪液的糖度、總酸。

1.3.4.3 酒曲添加量對小米糖化的影響

酒曲添加量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%。30 ℃糖化60 h，測定醪液的糖度、總酸。

1.3.5 小米黃酒發(fā)酵工藝的單因素試驗

1.3.5.1 發(fā)酵溫度對小米黃酒的影響

發(fā)酵溫度 20、25、30、35、40 ℃。酵母添加量 0.20%、發(fā)酵5 d，測定出糟率及醪液的理化指標。出糟率為酒糟在分離前發(fā)酵體系中的占比，按以下公式計算：

式中：m1為酒糟質量，g；m2為分離前酒糟和醪液總質量，g。

1.3.5.2 發(fā)酵時間對小米黃酒的影響

發(fā)酵時間 2、3、4、5、6 d。酵母添加量 0.20%、35 ℃發(fā)酵，測定出糟率及醪液的理化指標。

1.3.5.3 酵母添加量對小米黃酒的影響

酵母添加量0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%。35 ℃發(fā)酵5 d，測定出糟率及醪液的理化指標。

1.3.6 小米黃酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

依據小米黃酒單因素試驗的結果以及響應面中Box-Behnken 中心組合設計的原理，選取3 個主要優(yōu)化因素，將酒精度作為響應值，對小米黃酒的發(fā)酵工藝參數進行優(yōu)化，試驗因素水平如表1 所示。

表1 響應面試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.7 小米黃酒基本理化指標的測定

pH 值用酸度計直接測定；糖度用糖度儀直接測定；還原糖用二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測定[17]；酒精度、總酸、殘?zhí)前凑誈B/T 13662-2018《黃酒》測定。試驗平行3 次，各指標取平均值。

1.3.8 小米黃酒感官評價方法

選擇10 名經培訓的人員組成感官品評小組。要求小組成員從小米黃酒的色澤、香氣、口感、典型性和組織狀態(tài)5 個方面進行評分，每個酒樣評定3 次，結果取平均值。小米黃酒品質的優(yōu)劣以綜合得分為依據，滿分 100 分，59 分及以下為不合格，60 分～79 分為良好，80 分～100 分為優(yōu)質[18]。

2 結果與分析

2.1 小米黃酒發(fā)酵酵母的篩選

6 種酵母菌種發(fā)酵的小米黃酒的基本指標見表2。

表2 不同酵母菌種發(fā)酵的小米黃酒的基本指標Table 2 Basic indicators of millet wine fermented by different yeasts

由表2 可知，安琪黃酒高活性干酵母發(fā)酵的小米黃酒酒精度最高，與其他組有顯著性差異（p＜0.05）。在總酸、還原糖、出糟率方面，安琪黃酒高活性干酵母也占較大的優(yōu)勢。感官評價方面，安琪黃酒高活性干酵母與安琪生香活性干酵母均有較優(yōu)表現(xiàn)。所以從整體上分析，選擇安琪黃酒高活性干酵母作為發(fā)酵小米黃酒的酵母更為合適。

2.2 小米黃酒浸米工藝條件的確定

2.2.1 浸米時間對浸米效果的影響

浸米時間對小米吸水率及米漿水總酸的影響見圖1。

圖1 浸米時間對小米黃酒浸米效果的影響Fig.1 Effect of soaking time on soaking process of millet wine

由圖1 可知，隨著浸米時間增加，小米吸水率迅速升高并在36 h 之后趨于平穩(wěn)。這主要是因為當浸米時間較短時，水分可迅速進入干燥小米顆粒中，但時間不斷增加時，小米中水分逐漸達到飽和，吸水率趨于平穩(wěn)，吸水速率趨于0。隨著浸米時間的增加，浸米米漿水中總酸含量迅速增加并在36 h 后增長趨勢變緩，這可能是因為在浸米過程中小米中酸類物質溶出，并且受小米本身存在的微生物（如乳酸鏈球菌）及酶類的作用，產生乳酸等有機酸，使米漿水總酸含量增加，較傳統(tǒng)以大米為原料制作黃酒變化有所提前，但總體趨勢一致[19-21]。綜合以上分析，且考慮到本文后續(xù)釀造工藝中不添加米漿水進行發(fā)酵，因此在小米吸水率逐漸趨于平穩(wěn)的條件下應盡量減少小米營養(yǎng)成分的流失，浸米36 h 時小米吸水率為17.46%，通過SPSS 進行差異顯著性分析可知，其與該指標在浸米24 h 時差異顯著（p＜0.05）、浸米48 h 時差異不顯著，進而確定小米黃酒釀造的較優(yōu)浸米時間為36 h，這與傳統(tǒng)攤飯法釀造黃酒浸米長達15 d 不同[22]。

2.2.2 浸米溫度對浸米效果的影響

浸米溫度對小米黃酒浸米效果的影響見圖2。

圖2 浸米溫度對小米黃酒浸米效果的影響Fig.2 Effects of temperature on soaking process of millet wine

由圖2 可知，在相同浸泡時間下，當浸米溫度為20 ℃時，小米的吸水率可以達到最高，為17.77%。當浸米溫度在15 ℃～35 ℃時，小米的吸水率隨著浸米溫度的升高而先升后降。這主要是因為溫度的升高能促進水分子進入小米，使得小米吸水率在溫度從15 ℃升至20 ℃時迅速升高。但當溫度從20 ℃升至35 ℃時，逐漸處于體系中微生物生長繁殖的適宜溫度范圍，小米中有機物質被分解利用，溫度升高對小米吸水的促進作用成為非主要影響因素，進而小米總體質量下降，而吸水率是通過小米重量變化測定的，所以有所下降。在15 ℃～35 ℃，米漿水的總酸含量隨浸米溫度的升高而增加。這可能是因為溫度的升高會促進小米中有機物質的溶出，并且較的高溫度可能更適合米漿水中微生物生長繁殖，如30 ℃～35 ℃適宜乳酸菌生長以及大多數霉菌繁殖溫度都在25 ℃～30 ℃，微生物代謝活動使米漿水中代謝產物增多，總酸含量上升[23]。綜合以上分析，要在達到較高吸水率的同時盡可能保留小米營養(yǎng)物質，通過吸水率差異顯著性性分析（p 為0.05），需選取20 ℃為小米黃酒浸米工藝的較適溫度。

2.2.3 水添加量對浸米效果的影響

水添加量對小米黃酒浸米效果的影響見圖3。

圖3 水添加量對小米黃酒浸米效果的影響Fig.3 Effects of water addition proportion on soaking process of millet wine

由圖3 可知，當浸米水添加量為150%～200%時，小米吸水率可達到最高。當水添加量低于150%時，小米吸水率隨水添加量增加而升高，即在此范圍內水添加量增多能促進水分子進入小米。這可能主要是由于水添加量在50%時，小米不能被充分浸沒，導致極低的吸水率，之后吸水率隨水添加量增多而逐漸升高并在水添加量達到150%時趨于飽和。而當水添加量過高時，可能由于水的密封性在容器中形成了無氧環(huán)境，促進了厭氧微生物的生長，代謝分解小米中有機物質，導致小米質量降低，造成吸水率略有下降的現(xiàn)象。而米漿水中總酸含量隨水添加量升高而降低主要是由于稀釋作用引起。綜合以上分析，并通過顯著性分析可知，水添加量在150%與100%時吸水率差異顯著（p＜0.05），在 150%與 200%時差異不顯著（p＞0.05）確定浸米水較適添加量為150%。

2.3 小米黃酒糖化工藝條件的確定

2.3.1 糖化時間對糖化效果的影響

糖化時間對糖化效果的影響見圖4。

圖4 糖化時間對糖化效果的影響Fig.4 Effects of saccharifying time on saccharifying process of millet wine

在糖化階段，小米黃酒醪液糖度隨時間增加先迅速升高，在60 h 達到最高11.7%，與其他組有顯著性差異（p＜0.05），然后有所下降。隨著時間增加，酒曲中根霉等微生物迅速生長繁殖，代謝產生還原糖，但到一定時間后醪液中其生長所需營養(yǎng)物質不足代謝停止，并且隨著時間增加醪液中存在的其它微生物及酒曲帶入的酵母對醪液中還原糖進行利用，代謝轉換為其它物質，因此醪液糖度有所下降。隨著時間增加，小米黃酒醪液總酸含量也有所增加，這證明產酸微生物在糖化階段仍然較為活躍，這與崔闖等的研究一致[24]。綜合以上考慮，小米黃酒的較適糖化時間為60 h。

2.3.2 糖化溫度對糖化效果的影響

糖化溫度對糖化效果的影響見圖5。

圖5 糖化溫度對糖化效果的影響Fig.5 Effects of saccharifying temperature on saccharifying process of millet wine

由圖5 可知，小米黃酒在糖化階段醪液糖度隨溫度升高在30 ℃前迅速增加，30 ℃～40 ℃緩慢增加后有所下降。這表明在低于30 ℃時，溫度為影響糖化微生物代謝的主要因素，溫度提升能有效提高糖化效率，在30 ℃～35 ℃時，達到根霉等糖化微生物的最適生長溫度，其代謝活力趨于平穩(wěn)，進而糖化效率隨溫度升高提升緩慢，糖度差異不顯著（p＞0.05），溫度繼續(xù)升高，糖化微生物活力降低，醪液糖度又有所降低。隨著溫度升高，醪液總酸含量有些波動，但總體變化不大。因此綜合以上考慮，小米黃酒較佳糖化溫度為30 ℃。

2.3.3 酒曲添加量對糖化效果的影響

酒曲添加量對糖化效果的影響見圖6。

圖6 酒曲添加量對糖化效果的影響Fig.6 Effects of koji addition proportion on saccharifying process of millet wine

由圖6 可知，在糖化階段，小米黃酒醪液的糖度隨酒曲添加量的增加先迅速升高，從淀粉到可發(fā)酵糖的轉化效率顯著提升，在酒曲添加量達到0.6%時轉化效率逐漸趨于穩(wěn)定，糖度達到11.3%，之后增加緩慢，變化不顯著（p＞0.05）。這主要是由于低酒曲添加量延緩了根霉等微生物的生長繁殖，糖化速率低，進而在相同糖化時間下醪液糖度低。而酒曲添加量對醪液總酸含量的影響較小，醪液總酸含量隨著酒曲添加量的變化幾乎不會出現(xiàn)顯著的變化。因此，綜合上述分析，酒曲較適添加量應為0.6%。

2.4 小米黃酒發(fā)酵工藝單因素試驗

2.4.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響

發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響見圖7。

圖7 發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響Fig.7 Effects of fermentation time on fermentation efficiency of millet wine

由圖7 可知，在主發(fā)酵階段，小米黃酒醪液的酒精度隨時間增加先迅速升高，在5 d 達到11.0%vol 后緩慢增長，逐漸趨于穩(wěn)定，無顯著差異（p＞0.05），發(fā)酵完全。在發(fā)酵過程中，醪液中釀酒酵母迅速生長繁殖，將糖化階段產生的還原糖轉化成乙醇，但隨著還原糖逐漸耗盡，酵母代謝減慢，產酒速率下降，所以隨著發(fā)酵時間繼續(xù)增加，醪液酒精度增長緩慢。隨著發(fā)酵時間增加，小米黃酒出糟率顯著降低，在4 d 時下降到23.37%，之后緩慢下降。因此綜合酒精度及出糟率考慮，小米黃酒較適發(fā)酵時間為5 d。

2.4.2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果的影響

發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果的影響見圖8。

圖8 發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果的影響Fig.8 Effects of fermentation temperature on fermentation efficiency of millet wine

由圖8 可知，在相同發(fā)酵時間下，小米黃酒醪液酒精度隨溫度升高在30 ℃前迅速增加，在30 ℃～35 ℃達到最高之后下降。這主要是由于在低于30 ℃時，溫度低導致酵母代謝活力低產酒速率慢，在相同發(fā)酵時間下小米未能發(fā)酵完全進而酒精度低，溫度的提升能有效提高酵母產酒速率并在30 ℃～35 ℃趨于穩(wěn)定。當溫度高于35 ℃時，溫度過高已不適于酵母的生長繁殖，其產酒速率下降，因此在相同發(fā)酵時間下，醪液酒精度顯著下降（p＜0.05）。隨著溫度升高，醪液出糟率顯著下降，這主要是由于體系中微生物對小米的分解作用，在高于35 ℃時出糟率持續(xù)下降，可能是因為溫度過高時雖然不適于酵母生長，但發(fā)酵體系中存在耐高溫微生物仍能進行代謝。因此綜合考慮發(fā)酵醪液酒精度及出糟率，小米黃酒較適發(fā)酵溫度在30 ℃～35 ℃。

2.4.3 酵母添加量對發(fā)酵效果的影響

酵母添加量對發(fā)酵效果的影響見圖9。

圖9 酵母添加量對發(fā)酵效果的影響Fig.9 Effects of yeast addition proportion on fermentation efficiency of millet wine

由圖9 可知，在相同發(fā)酵時間下，小米黃酒醪液的酒精度隨酵母添加量的增加先迅速升高，即酵母添加量的增多能顯著提升體系從糖到酒精的轉化效率，在酵母添加量達到0.2%時，轉化效率增加趨勢變緩，酵母添加量達到0.25%后，轉化效率逐漸趨于穩(wěn)定，無顯著變化（p＞0.05），酒精度達到 11.2%vol。隨著酵母添加量的升高，發(fā)酵醪液的出糟率顯著下降并且在酵母添加量達到0.2%后下降趨勢變緩，即酵母對小米的利用效率在酵母添加量達到0.2%后趨于穩(wěn)定。因此，綜合上述分析，酵母較適添加量應在0.2%～0.25%。

2.5 響應面優(yōu)化小米黃酒發(fā)酵工藝

小米黃酒發(fā)酵工藝響應面試驗方案及結果見表3。以小米黃酒醪液的酒精度為響應值，依據Box-Behnken 試驗設計分析得到醪液酒精度Y 關于發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）及酵母添加量（C）編碼值的二次多元回歸方程：

Y ＝10.70+1.35A+0.025B+0.98C+0.05AB-0.3AC-0.05BC-0.65A2-1.2B2-0.55C2。

響應面分析法對小米黃酒酒精度的方差分析見表4，各因素交互作用及等高線見圖10～圖12。

表3 小米黃酒發(fā)酵工藝響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response interview for fermentation process of millet wine

表4 響應面分析法對小米黃酒酒精度的方差分析Table 4 Response surface analysis for variance analysis of alcohol content of millet wine

圖10 發(fā)酵時間和溫度對酒精度影響的等高線和響應面圖Fig.10 Contour and response surface maps of the effects of fermentation time and temperature on alcohol content

圖11 發(fā)酵時間和酵母添加量對酒精度影響的等高線和響應面圖Fig.11 Contour and response surface maps of the effects of fermentation time and yeast addition on alcohol content

圖12 發(fā)酵溫度和酵母添加量對酒精度影響的等高線和響應面圖Fig.12 Contour and response surface maps of the effects of fermentation temperature and yeast addition on alcohol content

以小米黃酒醪液的糖度為響應值時，二次方程模型差異顯著（F=58.94），受非試驗因素影響極小，且適用性良好（R2=0.973 4），即該數學模型能夠預測不同發(fā)酵條件下所得小米黃酒醪液的酒精度。同時結合圖10～圖12 可以看出，在該試驗中，發(fā)酵時間對小米黃酒醪液酒精度的影響最為顯著。

利用Design-Export8.0.6 分析并結合實際操作可行性，獲得小米黃酒發(fā)酵工藝的最優(yōu)參數：發(fā)酵時間5 d、發(fā)酵溫度32 ℃、酵母添加量0.22%，預測醪液酒精度11.4%。根據以上條件進行小米黃酒發(fā)酵試驗，實際試驗結果為小米黃酒酒精度為11.3%vol，與響應面預測值大體一致。

3 結論

研究根據傳統(tǒng)黃酒釀造工藝，對小米黃酒的釀造進行研制及優(yōu)化。以小米黃酒的基本理化指標及感官評分為依據篩選出最適酵母為安琪黃酒高活性干酵母。通過單因素試驗確定了較優(yōu)的浸米條件：加水量150%、20 ℃浸米36 h；糖化條件：酒曲添加量0.6%、30 ℃糖化60 h。并在通過響應面試驗進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝條件：安琪黃酒高活性干酵母、酵母添加量0.22%、32 ℃發(fā)酵5 d，酒精度達11.3%vol。在最優(yōu)的工藝條件下釀造的小米黃酒各階段相應指標與響應面所預測結果基本一致，為獲得高品質小米黃酒及其工業(yè)化生產提供了一定的參考。