何怡，劉翰飛，林冰，岳靜，周英，張俊連

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州貴陽(yáng)550025；3.貴州德江易盛農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，貴州銅仁554300）

羅漢果（Siraitia grosvenorii）為葫蘆科多年生草質(zhì)藤本植物羅漢果的干燥成熟果實(shí)，為中國(guó)特有的藥食同源植物，中醫(yī)上認(rèn)為其具有清熱潤(rùn)肺，利咽開音，滑腸通便等效用[1]。羅漢果主要分布于兩廣、貴州、江西、湖南等地區(qū)[2]。羅漢果含有大量的黃酮類，酚酸和萜類以及碳水化合物，蛋白質(zhì)，氨基酸和維生素成分[3-5]。除在中國(guó)藥典中公布的藥用特性外，國(guó)內(nèi)外研究人員還研究了羅漢果及其提取物的其他作用，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除，抗炎和抗癌活性，抗疲勞，免疫調(diào)節(jié)，以及血脂代謝的調(diào)節(jié)以及血脂代謝的調(diào)節(jié)血糖代謝的改善[6-15]。羅漢果苷V 是一種葫蘆烷三萜皂苷，是羅漢果的主要生物活性成分[16]。咀嚼片是一種實(shí)用且方便有效的片劑形式。經(jīng)嚼碎后，藥片的表面積增大，可促進(jìn)藥物在人體內(nèi)的代謝吸收。制成咀嚼片可使一些難崩解的藥物加速崩解，提高藥物的療效[17]。

本研究以羅漢果浸膏為主藥，添加適當(dāng)?shù)妮o料，研制出口感爽口、食用方便的羅漢果咀嚼片，并建立了羅漢果皂苷V 的含量測(cè)定方法，對(duì)其抑菌活性進(jìn)行了研究，為羅漢果等藥食同源藥物的開發(fā)和利用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅漢果由貴州德江易盛農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為羅漢果[Siraitia grosvenorii（Swingle）C Jeffrey ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang]的干燥果實(shí)；羅漢果皂苷V 標(biāo)準(zhǔn)品：四川維克奇生物科技有限公司，純度≥98 %；淀粉、微晶纖維素鈉、甘露醇、無(wú)水檸檬酸、硬脂酸鎂：河南亞統(tǒng)食品原料有限公司；蒸餾水；甲醇、乙腈為色譜純：Fisher 公司；水：娃哈哈純凈水；金黃色葡萄球菌（BNCC 186335）；銅綠假單胞桿菌（CMCC 10104）；枯草芽孢桿菌（CMCC 63501）；移液槍及配套槍頭：大龍；營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂：上海博微生物科技有限公司；MH 瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)公司；抗生素藥敏紙片：杭州微生物試劑有限公司。

RE-52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；藥檢篩：上虞市瑞志儀器廠；DGG-8501A 型電熱恒溫干燥箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；5T 油壓式壓片機(jī)：鶴壁市鑫利煤質(zhì)儀器有限公司；FA2004 型電子天平：上海象平儀器儀表有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；KH-500DE 型超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；PTF-DR 全自動(dòng)脆碎度測(cè)定儀：德國(guó)Pharma-test 公司；1260 型自動(dòng)進(jìn)樣高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；HWS-150 恒溫恒濕培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZWYR-2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；30KBS 高壓滅菌鍋：上海中安醫(yī)療器械廠；WH-2 微型渦旋混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 工藝流程

羅漢果→干燥（30 min）→粉碎→水浴提取→抽濾→濃縮→羅漢果浸膏（+輔料）→混合干燥（60 ℃，30 min）→研磨→過(guò)篩（200 目）→（+硬脂酸鎂）→壓片

1.3 操作要點(diǎn)

1.3.1 羅漢果浸膏的制備

稱取羅漢果粉末10 g，置于500 mL 燒杯中，加入100 mL 蒸餾水，置于70 ℃恒溫水浴鍋上加熱提取120 min，過(guò)濾得濾液，減壓旋干得浸膏，稱量得浸膏總質(zhì)量為4.881 g，得膏率為48.81%。

1.3.2 混合干燥

羅漢果浸膏易吸水，加入輔料后需干燥，置于60 ℃烘箱中，干燥30 min，然后再研磨過(guò)篩。

1.3.4 壓片

加硬脂酸鎂作為潤(rùn)滑劑，控制壓片壓力在5 kN。

1.4 羅漢果咀嚼片配方的研究

本研究以羅漢果浸膏為主藥，選用淀粉、微晶纖維素、甘露醇、檸檬酸、硬脂酸鎂等輔料，進(jìn)行羅漢果咀嚼片的制備。因羅漢果浸膏、檸檬酸、甘露醇的添加量對(duì)咀嚼片口感的影響較大，進(jìn)行單因素、正交試驗(yàn)，以得到其最佳制備配方。淀粉和微晶纖維素的添加量則根據(jù)羅漢果浸膏、檸檬酸、甘露醇的添加量而調(diào)整比例。

1.4.1 單因素試驗(yàn)

1.4.1.1 羅漢果浸膏的考察

羅漢果浸膏的比例會(huì)對(duì)整個(gè)咀嚼片的風(fēng)味影響較大。因此，針對(duì)羅漢果浸膏添加量的單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)25%、20%、15%、10%、5%羅漢果浸膏添加量進(jìn)行單因素考察。

1.4.1.2 檸檬酸的考察

采用甘露醇、淀粉、檸檬酸、微晶纖維素鈉等輔料，考慮到檸檬酸對(duì)口味影響較大，因此設(shè)計(jì)0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%檸檬酸含量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.4.1.3 甘露醇的考察

羅漢果雖具有它特有的味道，甘露醇可以增加其清爽的口感，因此設(shè)計(jì)甘露醇含量5%、10%、15%、20%、25%進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.4.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取考察因素為羅漢果浸膏、檸檬酸、甘露醇，每個(gè)因素3 個(gè)水平。設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表，表1 為因素水平。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for optimizing theformulation

1.5 質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)

根據(jù)《中國(guó)藥典》2015 版對(duì)于咀嚼片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，對(duì)羅漢果咀嚼片的片重差異、脆碎度、微生物指標(biāo)、感官評(píng)價(jià)，羅漢果皂苷V 含量等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 感官評(píng)價(jià)

根據(jù)片劑感官評(píng)分，包括外觀（20 分）、風(fēng)味（40分）、質(zhì)地（20 分）、口感（20 分），將每一項(xiàng)目分為 3 個(gè)等級(jí)進(jìn)行打分。每一項(xiàng)目的等級(jí)以及分值都進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，得出感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)表，見表8[18]。評(píng)分滿分為100 分，由10 人組成評(píng)鑒小組，以感官評(píng)價(jià)法進(jìn)行評(píng)分，以平均分計(jì)算。

表2 羅漢果感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)表Table 2 Sensory evaluation standards of mogroside chewing tablets

1.7 羅漢果咀嚼片中羅漢果皂苷V 的含量測(cè)定

1.7.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 ∶水=21 ∶79 體積比；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：8 μL；柱溫：30 ℃。

1.7.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液

精密稱取10 mg 羅漢果皂苷V 標(biāo)準(zhǔn)品，置25 mL容量瓶中，加入適量流動(dòng)相，振搖溶解，并定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.4 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.7.3 供試品溶液

按照“1.2”項(xiàng)下制備得羅漢果咀嚼片，研磨成粉末，精密稱取0.5 g 置于10 mL 容量瓶中，加入適量流動(dòng)相，超聲（150 W，40 kHz）15 min，定容至刻度，搖勻并用0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，備用。

1.7.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“1.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣色譜分析，測(cè)得羅漢果皂苷V 對(duì)照品、供試品峰面積，計(jì)算其理論塔板數(shù)（n）。

1.7.5 線性關(guān)系的考察

按照“1.7.2”項(xiàng)下，配制濃度為0.08、0.12、0.16、0.2、0.24 mg/mL 羅漢果皂苷 V 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“1.7.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定記錄峰面積。以羅漢果皂苷 V 濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7.6 精密性試驗(yàn)

羅漢果皂苷V 對(duì)照品溶液，按“1.7.1”項(xiàng)下連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定羅漢果皂苷V 的色譜峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.7.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取0.5 g 同一批羅漢果咀嚼片粉末共6 份，按“1.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.7.1”項(xiàng)下方法測(cè)定羅漢果皂苷V 的色譜峰面積，計(jì)算RSD。

1.7.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按“1.7.1”項(xiàng)下方法2 h 進(jìn)樣一次，共6 次，測(cè)定羅漢果皂苷V 色譜峰面積。計(jì)算RSD。

1.7.9 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的羅漢果咀嚼片粉末6 份，按“1.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別加入適量羅漢果皂苷V 對(duì)照品，稀釋后按“1.7.1”項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積，計(jì)算加樣回收率。

1.7.10 羅漢果皂苷V 含量測(cè)定

分別稱取三批咀嚼片各0.5 g 按照“1.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.7.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算羅漢果皂苷V 的含量。

1.8 抑菌活性研究

1.8.1 菌懸液的制備

將供試菌株分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h～24 h 活化，待用。使用時(shí)，挑取瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落，在恒溫培養(yǎng)振蕩器中搖動(dòng)24 h。取100 μL 菌懸液逐倍稀釋后涂布到平板上，培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，按照稀釋的倍數(shù)與接種量計(jì)算含菌量（平板菌落計(jì)數(shù)法）。使用時(shí)，將菌懸液的濃度調(diào)為1×107CFU/mL，放4 ℃冰箱備用。

1.8.2 供試液的制備

稱取50 mg 羅漢果咀嚼片粉末置于10 mL 塑料EP 管中，加入5 mL 水溶解，滅菌備用。

1.8.3 濾紙片法測(cè)定抗菌活性

向培養(yǎng)皿中倒入瓊脂培養(yǎng)基，凝固后加入100 μL菌液（濃度調(diào)整為1×107CFU/mL），均勻涂布。將浸有供試液、鏈霉素（陽(yáng)性對(duì)照）或水的濾紙片（直徑6 mm）置于涂菌平板上，平行3 次，靜置5 min。培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。

抑菌圈直徑（mm）=測(cè)量值（mm）-濾紙片直徑（mm）

2 結(jié)果與分析

2.1 羅漢果咀嚼片配方單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 羅漢果浸膏的考察

以感官評(píng)分為指標(biāo)考察羅漢果浸膏的影響，結(jié)果如圖1。

圖1 羅漢果浸膏添加量對(duì)羅漢果咀嚼片感官評(píng)價(jià)的影響Fig.1 Effect of amount of mogroside extract on sensory quality of mogroside chewable tablets

由圖1 可知，咀嚼片中羅漢果浸膏添加量為15%時(shí)感官評(píng)分最高，故選擇羅漢果浸膏15%的添加量制備咀嚼片。

2.1.2 檸檬酸考察

以感官評(píng)分為指標(biāo)考察檸檬酸的影響，結(jié)果如圖2。

圖2 檸檬酸添加量對(duì)羅漢果咀嚼片感官評(píng)價(jià)的影響Fig.2 Effects of amount of citric acid on sensory quality of mogroside chewing tablets

由圖2 可知，咀嚼片中檸檬酸添加量為0.5%時(shí)感官評(píng)分最高，故選擇檸檬酸0.5%的添加量制備咀嚼片。

2.1.3 甘露醇的考察

以感官評(píng)分為指標(biāo)考察甘露醇的影響，結(jié)果如圖3。

圖3 甘露醇添加量對(duì)羅漢果咀嚼片感官評(píng)價(jià)的影響Fig.3 Effects of amount of mannitol on sensory quality of mogroside chewing tablets

由圖3 可知，甘露醇添加量為20%時(shí)感官評(píng)分最高，故選擇甘露醇20%的添加量制備咀嚼片。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果如表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

由表3 的極差R 可以說(shuō)明，對(duì)羅漢果咀嚼片影響的主次關(guān)系為羅漢果浸膏＞甘露醇＞檸檬酸，其最佳組合是A2B2C2，即羅漢果浸膏為15%，檸檬酸為0.5%，甘露醇為20%。

2.3 質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1 外觀性狀

羅漢果咀嚼片表面色澤均勻、無(wú)異物、無(wú)任何雜斑。

2.3.2 片重差異

測(cè)得羅漢果咀嚼片平均片重為0.258 6 g，片重范圍在 0.250 4 g～0.271 6 g，片重差異范圍-3.31%～4.81%，符合中國(guó)藥典規(guī)定。

2.3.3 脆碎度

所有咀嚼片均未檢出斷裂、龜裂及粉碎的片劑，且咀嚼片減失質(zhì)量為0.005 4 g，為0.83%，符合中國(guó)藥典規(guī)定。

2.3.4 微生物指標(biāo)

咀嚼片中的細(xì)菌總數(shù)≤750 CFU/g；大腸菌群≤30 MPN/100 g；霉菌≤25 CFU/g；酵母菌≤25 CFU/g；致病菌（沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌），不得檢出。

2.3.5 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

感官評(píng)定為10 人小組評(píng)定結(jié)果見表4。

從表4 感官評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出，15%浸膏、33 %淀粉、25 %微晶纖維素、20 %甘露醇、0.5 %檸檬酸、1.5%硬脂酸鎂為最佳配方。

表4 感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4 Results sensory evaluation

2.4 羅漢果咀嚼片中羅漢果皂苷V的含量測(cè)定結(jié)果

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

經(jīng)HPLC 測(cè)定羅漢果皂苷V 對(duì)照品、供試品圖譜如圖4。

圖4 羅漢果皂苷V 的HPLC 圖Fig.4 HPLC chromatograms of mogroside V standard

按“1.7.1”項(xiàng)下色譜條件分析，得羅漢果皂苷V 對(duì)照品、供試品色譜圖，計(jì)算得兩者理論塔板數(shù)均大于17 000。在該色譜條件下，樣品的分離較好。

2.4.2 線性關(guān)系的考察

以羅漢果皂苷V 濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程y=1 916.5x-5.96，R2=0.999 2，結(jié)果表明，羅漢果皂苷V 的含量在0.08 mg/mL～0.24 mg/mL 的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.4.3 精密性試驗(yàn)

羅漢果皂苷V 對(duì)照品溶液，按“1.7.1”項(xiàng)下連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定羅漢果皂苷V 的色譜峰面積，計(jì)算RSD 為0.80%，表明儀器的精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取0.5 g 同一批粉末共6 份，按“1.7.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.7.1”項(xiàng)下方法測(cè)定羅漢果皂苷V 的色譜峰面積，計(jì)算RSD 為0.82%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按“1.7.1”項(xiàng)下色譜方法2 h進(jìn)樣一次，共6 次，測(cè)定羅漢果皂苷V 色譜峰面積，計(jì)算RSD 為0.54%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的羅漢果咀嚼片粉末6 份，按“1.7.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別加入適量羅漢果皂苷V 對(duì)照品，稀釋后按“1.7.1”項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表5。

表5 羅漢果皂苷V 的加標(biāo)回收試驗(yàn)Table 5 Additive recovery test of mogroside V sample

由表5 可知，羅漢果皂苷V 的平均加樣回收率為100.412 %，6 份樣品加樣回收率均在95 %～105 %之間，且RSD<5%，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4.7 樣品含量測(cè)定結(jié)果

根據(jù)3 批樣品色譜峰面積，通過(guò)線性方程計(jì)算出其含量如表6。

表6 3 個(gè)批次羅漢果咀嚼片中的羅漢果皂苷V 含量Table 6 Results of determination of mogroside V content in three batches of mogroside chewing tablets

結(jié)果表明，羅漢果咀嚼片中羅漢果皂苷V 含量為3.744 mg/g。

2.5 抑菌活性研究結(jié)果

通過(guò)羅漢果咀嚼片對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞桿菌的抑菌活性試驗(yàn)，測(cè)量其抑菌圈直徑，結(jié)果如表7 所示。

表7 羅漢果咀嚼片抑菌圈直徑Table 7 Diameter of inhibition zone of mogroside chewable tablets

由表7 可知，羅漢果咀嚼片對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌敏感，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，對(duì)枯草芽孢桿菌次之，對(duì)銅綠假單包桿菌則無(wú)抑菌作用。因此，羅漢果咀嚼片具有一定的抑菌活性。

3 結(jié)論

本研究以羅漢果浸膏為主藥，選用適當(dāng)?shù)妮o料，完成羅漢果咀嚼片的制備。進(jìn)行單因素、正交試驗(yàn)，得到其最佳制備配方為：浸膏15%、淀粉33%、微晶纖維素25 %、甘露醇20 %、檸檬酸 0.5 %、硬脂酸鎂1.5 %。按該配方制成的咀嚼片表面光滑，色澤均勻，具有羅漢果特有的香味且酸甜爽口。經(jīng)HPLC 測(cè)定，咀嚼片中羅漢果皂苷V 含量為3.744 mg/g。抑菌結(jié)果表明，羅漢果咀嚼片對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有一定的敏感性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌效果最好，對(duì)銅綠假單孢桿菌則無(wú)抑菌活性。本品配方合理，各項(xiàng)指標(biāo)均符合藥典要求，含片質(zhì)量穩(wěn)定，工藝可行，為羅漢果的開發(fā)提供了理論依據(jù)。