王桂林，徐未芳，劉樂，范建鳳，趙三虎，趙二勞

（忻州師范學(xué)院，山西忻州034000）

金銀花（Lonicera japonica）為忍冬科多年生植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1]，藥食兩用，為藥用歷史悠久的常用中藥，我國各省均有分布，資源豐富[2-4]。金銀花性寒，味甘，入肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、抗炎、補(bǔ)虛療風(fēng)之功效[5]，臨床常用于脹滿下疾、溫病發(fā)熱，熱毒癰瘍和腫瘤等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，多酚是金銀花中的主要有效成分，具有抗氧化、抗病毒、抗炎、解熱、保肝、降血脂、興奮中樞神經(jīng)和調(diào)節(jié)免疫等功效[6-8]，在食品、調(diào)味品、保健和醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。但近年來有關(guān)金銀花中多酚的研究，僅見游玉明等[9]金銀花中多酚高效液相色譜-二極管陣列法測定、鄒容等[10]干燥方式對金銀花多酚及其抗氧化活性影響、以及陳壘等[11]金銀花多酚誘導(dǎo)癌H1299 細(xì)胞凋亡的研究，鮮見金銀花多酚提取及其抗氧化活性的研究?；诖?，本研究采用不同溶劑提取金銀花多酚，并利用清除 DPPH·、·OH 和 ABTS+·法評價(jià)其抗氧化活性，以期為金銀花資源的深度開發(fā)及其多酚研究應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

金銀花：忻州市本草堂大藥房（產(chǎn)地河南封丘），烘箱中45 ℃干燥后，粉碎過40 目篩，裝瓶保存，待用。

DPPH：日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；ABTS：sigma公司；福林-酚試劑（生化試劑）：上海源聚生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器

723 型分光光度計(jì)、pHS-3B 型精密pH 計(jì)：上海光譜儀器有限公司；AL104 電子分析天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；THZ-82 水浴恒溫振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金銀花提取液制備

精確稱取金銀花粉各3.0 g，參考文獻(xiàn)[12-13]的方法，按料液比 1 ∶20（g/mL）分別加入不同溶劑（水、70%甲醇、70%乙醇和70%丙酮），充分潤濕后，在溫度50 ℃、超聲功率200 W 的條件下，提取20 min，抽濾，濾液濃縮，真空干燥得不同溶劑提取浸膏，浸膏分別用無水乙醇溶解后定容為100 mL，冰箱保存待測。

1.2.2 多酚提取量的測定

1.2.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，參考文獻(xiàn)[14-15]采用Folin-Ciocalten 法進(jìn)行。測得在0.0～7.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)沒食子酸與其吸光度線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=0.071 4c+0.007 2，R2=0.999 2。

式中：A 為吸光度值；c 為沒食子酸質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.2.2 不同溶劑金銀花中多酚提取量的測定

適當(dāng)稀釋后移取不同溶劑金銀花多酚提取液各1.0 mL，置于25 mL 比色管中，按1.2.2.1 的方法測定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多酚提取量。多酚提取量計(jì)算按下式進(jìn)行。

多酚提取量/（mg/g）=提取液中多酚量（mg）/金銀花用量（g）

1.2.3 不同溶劑金銀花多酚的抗氧化活性

以氧化劑2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）為陽性對照，采用清除 DPPH·、·OH 和ABTS+·法評價(jià)不同溶劑金銀花多酚的抗氧化性。對自由基的清除率越大，其抗氧化活性越強(qiáng)。

1.2.3.1 不同溶劑金銀花多酚對DPPH·的清除率

試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[16-17]方法，測定不同溶劑金銀花多酚和BHT 對DPPH·的清除率。由下式計(jì)算清除率。

式中：A0為DPPH·溶液體系的吸光度；Ai為加入金銀花多酚溶液（或BHT 溶液）后DPPH·溶液體系吸光度；Aj為金銀花多酚溶液（或BHT 溶液）本底吸光度。

1.2.3.2 不同溶劑金銀花多酚對·OH 的清除率

試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[18-19]采用水楊酸法測定不同溶劑金銀花多酚和BHT 對·OH 的清除率。由下式計(jì)算清除率。

式中：A0為未加金銀花多酚溶液（或BHT 溶液）·OH 體系的吸光度；A1為加入金銀花多酚溶液（或BHT 溶液）·OH 體系的吸光度；A2為金銀花多酚溶液（或BHT 溶液）本底吸光度。

1.2.3.3 不同溶劑金銀花多酚對ABTS+·的清除率

參照文獻(xiàn)[20-21]方法，配置反應(yīng)溶液并測定不同溶劑金銀花多酚和BHT 對ABTS+·的清除率。由下式計(jì)算清除率。

式中：A0為未加金銀花多酚溶液（或BHT 溶液）ABTS+·體系的吸光度；A1為加入金銀花多酚溶液（或BHT 溶液）ABTS+·體系的吸光度；A2為金銀花多酚溶液（或BHT 溶液）本底吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均重復(fù) 3 次，Excel2007 作圖，SPSS 分析數(shù)據(jù)（p＜0.01 差異極顯著；p＜0.05 差異顯著；p＞0.05 差異不顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑金銀花多酚提取量

按試驗(yàn)方法，測得金銀花多酚不同溶劑提取量如表1。

表1 金銀花多酚提取量Table 1 Extraction amount of polyphenols from honeysuckle

由表1 可知，在其它提取條件相同時(shí)，金銀花多酚不同溶劑提取量不同，70%丙酮提取量＞70%乙醇提取量＞70%甲醇提取量＞水，即溶劑極性小，多酚提取量多。以水為溶劑與以有機(jī)溶液為溶劑，金銀花多酚提取量有極顯著差異（p＜0.01），有機(jī)溶劑70 %甲醇和70 %乙醇與70 %丙酮的多酚提取量也有顯著差異（p＜0.05），70%甲醇與70%乙醇的多酚提取量基本相當(dāng)（p＞0.05）。表明金銀花中脂溶性多酚的含量遠(yuǎn)大于水溶性多酚。提示在進(jìn)行金銀花多酚提取研究時(shí)，應(yīng)選擇有機(jī)溶液為溶劑，同時(shí)考慮金銀花多酚的食用或藥用安全性，應(yīng)選擇乙醇溶液為溶劑。有關(guān)金銀花中多酚的種類，還有待進(jìn)一步深入研究。

2.2 不同溶劑金銀花多酚對DPPH·的清除率

按試驗(yàn)方法測定不同溶劑金銀花多酚和BHT 對DPPH·清除率，結(jié)果如圖1。

圖1 不同溶劑金銀花多酚和BHT 對DPPH·的清除率Fig.1 Scavenging rate different solvent polyphenols from honeysuckle and BHT on DPPH·

由圖1 可知，不同溶劑金銀花多酚和BHT 對DPPH·的清除率均隨其濃度升高而增大，與濃度具有一定的相關(guān)性。不同溶劑金銀花多酚對DPPH·的清除率均小于BHT，且差異顯著（p＜0.05），但也表明不同溶劑金銀花多酚對DPPH·均具有一定的清除能力，即抗氧化活性。同時(shí)也可知，對DPPH·清除能力的強(qiáng)弱為甲醇提多酚＞水提多酚＞丙酮提多酚＞乙醇提多酚。表明不同溶劑提取的金銀花多酚，對DPPH·的清除能力不同，其原因可能是由于不同溶劑提取的金銀花多酚種類不同，其活性不同，清除DPPH·能力不同，這與文獻(xiàn)[9]研究表明金銀花中含有多種多酚類成分的結(jié)果一致。

2.3 不同溶劑金銀花多酚對·OH的清除率

按試驗(yàn)方法測定不同溶劑金銀花多酚和BHT 對·OH 的清除率，結(jié)果如圖2。

圖2 不同溶劑金銀花多酚和BHT 對·OH 的清除率Fig.2 Scavenging rate different solvent polyphenols from honeysuckle and BHT on·OH

由圖2 可知，不同溶劑金銀花多酚對·OH 均具有一定的清除能力，隨其濃度的增加清除率增大，具有一定的濃度相關(guān)性，且不同溶劑金銀花多酚對·OH 的清除率均大于BHT。同時(shí)也可知，對·OH 清除能力的強(qiáng)弱基本為丙酮提多酚＞乙醇提多酚＞甲醇提多酚＞水提多酚。表明不同溶劑金銀花多酚，對·OH 的清除能力不同，同樣反映不同溶劑提取的金銀花多酚種類可能不同，導(dǎo)致對·OH 的清除率不同。

2.4 不同溶劑金銀花多酚對ABTS+·的清除率

按試驗(yàn)方法測定不同溶劑金銀花多酚和BHT 對ABTS+·的清除率，結(jié)果如圖3。

圖3 不同溶劑金銀花多酚和BHT 對ABTS＋·的清除率Fig.3 Scavenging rate different solvent polyphenols from honeysuckle and BHT on ABTS＋·

由圖3 可知，不同溶劑金銀花多酚對ABTS+·均具有一定的清除能力，其和BHT 對ABTS+·的清除率隨濃度的增加而增大，且不同溶劑金銀花多酚對ABTS+·的清除率均小于BHT。此外，對ABTS+·清除能力的強(qiáng)弱基本為水提多酚＞甲醇提多酚＞丙酮提多酚＞乙醇提多酚。表明不同溶劑提取的金銀花多酚，對ABTS+·的清除能力不同，也反映不同溶劑提取的金銀花多酚種類可能不同，導(dǎo)致對ABTS+·的清除率不同。

綜上不同溶劑金銀花多酚和BHT 溶液對DPPH·、·OH 和ABTS+·的體外清除試驗(yàn)研究表明，不同溶劑提取的金銀花多酚均具有一定的清除DPPH·、·OH 和ABTS+·能力，即具有一定的抗氧化活性，但它們清除DPPH·、·OH 和 ABTS+·的能力不同，存在明顯差異（p＜0.05）。表明金銀花中含有不同種類的多酚，不同溶劑提取的金銀花多酚種類不同。同時(shí)由不同溶劑提取的金銀花多酚對DPPH·和ABTS+·的清除率小于BHT，而對·OH 的清除率大于BHT，也提示我們，通過清除自由基法評價(jià)物質(zhì)抗氧化活性，不能僅采用一種清除自由基體系，而應(yīng)同時(shí)采用多種清除自由基體系綜合分析，才能得到科學(xué)、準(zhǔn)確的結(jié)論。

3 結(jié)論

分別以水、70%甲醇、70%乙醇和70%丙酮為提取劑，超聲輔助提取金銀花中多酚，采用Folin-Ciocalteu 法測定提取物中多酚量，并利用清除DPPH·、·OH和ABTS+·法評價(jià)其抗氧化活性。結(jié)果表明，金銀花不同溶劑水、70%甲醇、70%乙醇和70%丙酮提取物中多酚含量分別為 18.97、46.56、46.63、48.49 mg/g，以水為溶劑與以有機(jī)溶液為溶劑，金銀花多酚提取量有極顯著差異（p＜0.01）。不同溶劑金銀花多酚均具有一定的清除DPPH·、·OH 和ABTS+·能力，即抗氧化活性，但不同溶劑金銀花多酚對自由基的清除能力不同，推測不同溶劑提取的金銀花多酚種類有所不同。研究結(jié)果為金銀花多酚的深入研究及作為天然抗氧化劑用于食品、保健和醫(yī)藥等領(lǐng)域提供了依據(jù)。