劉暢，吳雪輝，陳嘉慧

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

金花茶（Camellia nitidissima Chi）為山茶科，山茶屬，金花茶組植物，是中國(guó)的珍貴茶種，擁有“茶族皇后”、“植物界大熊貓”等美譽(yù)[1-2]。金花茶的主產(chǎn)地在我國(guó)廣西，目前云南、廣東、貴州等地區(qū)也有分布。許多研究表明，金花茶的花、莖、葉都有充分利用的價(jià)值，金花茶是唯一帶有金黃色花瓣的茶花品種，花瓣呈蠟質(zhì)，富含可溶性糖、多酚、黃酮等多種生物活性成分以及微量元素，擁有降血糖、降血壓、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫力等多種功效作用，具有極高的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和極大的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)潛力，受到了廣泛地關(guān)注[1-8]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)金花茶的研究主要集中于金花茶的遺傳多樣性、功能活性成分的分離純化、結(jié)構(gòu)分析以及新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用。目前已上市的金花茶產(chǎn)品主要分為3 類(lèi)包括茶飲料、保健品以及化妝品，其中茶飲料以金花茶葉為主，而金花茶花的產(chǎn)品較為稀少[9-14]。金花茶花的產(chǎn)品主要是花朵茶和花蕾茶，需要進(jìn)行一定的加工、干燥而成，在加工過(guò)程中如何保持花的顏色和形態(tài)尤為關(guān)鍵[4]。

研究表明，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是造成果蔬和植物褐變的主要酶類(lèi)，PPO 活性與褐變程度一般呈顯著相關(guān)性[15-18]。前期試驗(yàn)結(jié)果表明，以PPO 為主的酶促褐變是金花茶花加工過(guò)程中顏色變化的主要原因。為深入探究金花茶花PPO 活性與褐變的相關(guān)性、尋求抑制褐變的方法，對(duì)金花茶花PPO 提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究，這也為金花茶花PPO 的性質(zhì)進(jìn)一步研究以及金花茶花的開(kāi)發(fā)利用提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金花茶鮮花：廣東省佛山市林業(yè)科學(xué)研究所金花茶示范林，品種為普通金花茶。

聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、磷酸氫二鈉、檸檬酸、鄰苯二酚（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

722 可見(jiàn)分光光度計(jì)、PHS-3C 型精密 PH 計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；TGL-16M 高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；HZK-FA110電子天平：福州華志科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 金花茶花PPO 粗酶液的提取

參照周燕燕方法[19]，稍作修改。挑選金花茶鮮花1 g 左右，加入pH 6.4 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液6 mL，（內(nèi)含 15%PVP），研磨 10 min，在 4 ℃浸提 30 min，9 000 r/min 冷凍離心15 min，收集上清液即為粗酶液。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

采用1.3.1 的方法提取金花茶花PPO，考察不同pH 值、浸提時(shí)間、PVP 添加量對(duì)金花茶花PPO 提取量的影響。

1.3.3 Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型，以緩沖液pH 值、浸提時(shí)間以及PVP 添加量為自變量，以PPO 提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，因素水平如表1 所示。

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Experimental factors and horizontal design

1.3.4 建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

本試驗(yàn)運(yùn)用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行建模，模型包含3層拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，輸入層、隱含層以及輸出層，其中將自變量3 個(gè)因素作為網(wǎng)絡(luò)的輸入，因變量作為網(wǎng)絡(luò)的輸出，構(gòu)建一個(gè)3-6-1 結(jié)構(gòu)的級(jí)聯(lián)BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。模型建立后，采用Matlab（2016b）軟件進(jìn)行編程，選擇雙曲正切傳遞函數(shù)（tansig）作為隱含層傳遞函數(shù)，線性傳遞函數(shù)（purelin）作為輸出層傳遞函數(shù)，設(shè)置隱含層1 個(gè)，內(nèi)含神經(jīng)元6 個(gè)，通過(guò)Levenberg-Marquardt 算法對(duì)新建BP 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行訓(xùn)練，設(shè)定網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練參數(shù)值，最大訓(xùn)練次數(shù)為1 000 次，并采用均方誤差（mean-square error，MSE）評(píng)估神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的預(yù)測(cè)性能，以所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練樣本進(jìn)行模擬與仿真。與此同時(shí)比較分析響應(yīng)面模型與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化結(jié)果。

1.4 金花茶花PPO提取量的測(cè)定

金花茶花PPO 提取量的測(cè)定參照李鵬[20]的方法。取pH 6 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液5 mL，加入0.5 mol/L 鄰苯二酚溶液1 mL，在室溫（20 ℃）條件下，將0.5 mL 粗酶液與上述溶液混合均勻后立即倒入5 cm 比色皿中，420 nm 處測(cè)定其吸光度，從酶液加入后開(kāi)始計(jì)時(shí)，每30 s 記錄一次吸光度，共4 min。以底物溶液為空白組，計(jì)算酶的提取量，以酶活力代表酶的量。一個(gè)酶活力單位（U）定義為：在測(cè)定條件下，單位時(shí)間內(nèi)引起吸光度改變0.001 所需的酶量，計(jì)算公式如下：

式中：ΔA420nm為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)OD 變化值；VT為提取粗酶液總體積，mL；M 為金花茶花鮮重，g；t 為反應(yīng)時(shí)間，min；VS為測(cè)定時(shí)取用酶液體積，mL。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用 Design-Expert 8.0.6 軟件和 Matlab（2016b）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、回歸分析及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立、訓(xùn)練。

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖液pH值對(duì)金花茶花PPO提取量的影響

稱(chēng)取1 g 左右金花茶鮮花，分別加入pH 5.8、6.0、6.4、6.8、7.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液 6 mL，（內(nèi)含 15 % PVP），研磨 10 min，在 4 ℃浸提30 min，9 000 r/min 冷凍離心15 min，收集上清液測(cè)定吸光值并計(jì)算金花茶花PPO 提取量。結(jié)果如圖1 所示。

由圖1 可知，金花茶花PPO 提取量隨緩沖液pH 值的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，緩沖液pH 值在6.0～6.4范圍內(nèi)，PPO 提取效果好，最大值為1 178.90 U/（g·min），當(dāng)緩沖液pH 6.4 時(shí)，PPO 提取量開(kāi)始明顯下降，所以選擇pH 6.4 作為緩沖液pH 值的最優(yōu)條件。

2.2 浸提時(shí)間對(duì)金花茶花PPO提取量的影響

圖1 緩沖液pH 值對(duì)金花茶花PPO 提取量的影響Fig.1 Effect of buffer pH on the extraction amount of PPO from Camellia nitidissima flowers

稱(chēng)取1 g 左右金花茶鮮花，分別加入pH 6.8 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液6 mL，（內(nèi)含15%PVP），研磨 10 min，在 4 ℃分別浸提 0、15、30、45、60 min，9 000 r/min 冷凍離心15 min，收集上清液，測(cè)定吸光值并計(jì)算金花茶花PPO 提取量。結(jié)果如圖2 所示。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)金花茶花PPO 提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction amount of PPO from Camellia nitidissima flowers

由圖2 可知，PPO 提取量隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)先緩慢下降又明顯升高，當(dāng)浸提時(shí)間為45 min 時(shí)，PPO提取量達(dá)到最大值為1 333.11 U/（g·min），此后，繼續(xù)延長(zhǎng)浸提時(shí)間，PPO 提取量開(kāi)始下降。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)隨著時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，利于酶蛋白的溶出，當(dāng)溶出量達(dá)到最高至平衡時(shí)，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，由于酶蛋白在液態(tài)中構(gòu)象極其不穩(wěn)定水解，導(dǎo)致酶的提取量下降。

2.3 PVP添加量對(duì)金花茶花PPO提取量的影響

PVP 是一種酚類(lèi)吸附劑，它與酚類(lèi)物質(zhì)形成復(fù)合物，從而抑制酚類(lèi)化合物與PPO 的聚合。稱(chēng)取1 g 左右金花茶鮮花，分別加入pH 6.8 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液6 mL，分別添加10%、15%、20%、25%、30%PVP，研磨 10 min，在 4 ℃浸提 30 min，9 000 r/min 冷凍離心15 min，收集上清液，測(cè)定吸光值并計(jì)算金花茶花PPO 提取量。結(jié)果如圖3 所示。

圖3 PVP 添加量對(duì)金花茶花PPO 提取量的影響Fig.3 Effect of PVP on the extraction amount of PPO from Camellia nitidissima flowers

如圖3 所示，PPO 提取量隨著PVP 量的增加先上升后下降，當(dāng)PVP 添加量達(dá)到20%時(shí)，PPO 提取量達(dá)到峰值1 115.31 U/（g·min）。因?yàn)檫m當(dāng)?shù)靥砑覲VP，能夠有效地抑制酚類(lèi)物質(zhì)與PPO 的聚合，利于PPO 的溶出，而PVP 添加量過(guò)高將導(dǎo)致溶液體系過(guò)于黏稠，對(duì)PPO 的提取會(huì)造成不利影響。

2.4 金花茶花PPO提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 BBD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果如表2 所示。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiment design and results

2.4.2 回歸方程擬合及方差分析

采用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)表2 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，回歸分析結(jié)果見(jiàn)表3。

金花茶花PPO 提取量對(duì)浸提時(shí)間（A）、緩沖液pH值（B）和PVP 添加量（C）的二次多項(xiàng)式回歸模型為：

表3 回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 3 Analysis of variance for the established regression model

Y=1 793.11-16.54A-159.42B-130.97C+5.29AB-41.77AC-12.4BC-212.79A2-276.28B2-250.37C2?；貧w模型的決定系數(shù)R2=0.992 2，說(shuō)明該模型與實(shí)際擬合良好，試驗(yàn)方法可靠，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），因此可用此模型來(lái)優(yōu)化金花茶花PPO 提取工藝。

2.4.3 模型雙因素交互作用效應(yīng)分析

根據(jù)Desig-Expert 得出各因素間的交互作用對(duì)金花茶花PPO 活力的影響，三維圖和等高線圖如圖4所示。

圖4 緩沖液pH 值、浸提時(shí)間與PVP 添加量交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plot of buffer pH，extraction time and PVP addition

由圖4b 可知，曲面較陡峭，說(shuō)明浸提時(shí)間和PVP添加量之間的交互作用顯著，原因是PVP 的性質(zhì)隨著浸提時(shí)間的變化而變化，導(dǎo)致PVP 對(duì)粗酶液中一些酚類(lèi)物質(zhì)的吸附作用發(fā)生改變，進(jìn)而影響PPO 的提取量。

通過(guò)對(duì)回歸方程求解，得最優(yōu)提取工藝為浸提時(shí)間 45 min、緩沖液 pH 6.29、PVP 添加量為 19 %，此條件下模型的預(yù)測(cè)值為1 847.26 U/（g·min）?？紤]實(shí)際操作，將試驗(yàn)條件定為浸提時(shí)間45 min、緩沖液pH 6.30、PVP 添加量為19%。

2.5 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練與仿真

將所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)作為網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練樣本進(jìn)行訓(xùn)練和仿真。在級(jí)聯(lián)BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練的過(guò)程中會(huì)將用來(lái)訓(xùn)練的訓(xùn)練樣本按照默認(rèn)比例隨機(jī)劃分為3 組樣本：訓(xùn)練樣本（train set）、驗(yàn)證樣本（validation set）和預(yù)測(cè)樣本（test set）。在Matlab 軟件下進(jìn)行編程并實(shí)現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練過(guò)程，結(jié)果見(jiàn)圖5～圖6。

圖5 BP 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練過(guò)程Fig.5 Training process of BP artificial neural network

圖6 回歸坐標(biāo)圖Fig.6 Regression coordinates

由圖5 可知，在迭代次數(shù)為8 時(shí)，最佳驗(yàn)證性能0.003 807。經(jīng)過(guò)8 次訓(xùn)練后網(wǎng)絡(luò)的驗(yàn)證誤差小于0.01，已達(dá)到平衡狀態(tài)（圖中圓點(diǎn)處），之后訓(xùn)練誤差以及驗(yàn)證誤差一直保持穩(wěn)定，驗(yàn)證誤差經(jīng)過(guò)連續(xù)6 次迭代訓(xùn)練后不再減少，繼續(xù)訓(xùn)練會(huì)造成過(guò)度擬合。因此該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在訓(xùn)練了14 次迭代后性能已達(dá)到訓(xùn)練要求，說(shuō)明該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有好的收斂性。

由圖6 可知，3 類(lèi)樣本數(shù)據(jù)回歸直線的相關(guān)系數(shù)分別為 0.957 07，0.991 7，0.970 71，所有訓(xùn)練樣本回歸直線的R=0.967 6，說(shuō)明經(jīng)過(guò)訓(xùn)練后的級(jí)聯(lián)BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值具有良好的相關(guān)性。訓(xùn)練成熟的模型運(yùn)行后得到最終優(yōu)化的結(jié)果：浸提時(shí)間為45.06 min，緩沖液 pH 6.35，PVP 添加量為 22%，此條件下的模型預(yù)測(cè)值為1 825.7 U/（g·min），考慮試驗(yàn)操作得可行性，試驗(yàn)條件定為浸提時(shí)間為45 min，緩沖液pH 6.35，PVP 添加量為 22%。

2.6 優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證與比較

為了驗(yàn)證兩種模型對(duì)金花茶花PPO 提取工藝優(yōu)化的有效性，在最佳工藝條件下進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)并取平均值，結(jié)果如表4 所示。

表4 優(yōu)化結(jié)果比較Table 4 Comparision of optimizing results

由表4 可知，通過(guò)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)化的實(shí)際值高、相對(duì)誤差小，但R2略小于響應(yīng)面模型，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化法可能出現(xiàn)了過(guò)度擬合的現(xiàn)象。因此神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的準(zhǔn)確性更高，可信度更強(qiáng)。

3 結(jié)論

采用RSM 優(yōu)化金花茶花PPO 提取工藝，優(yōu)化的最佳條件為浸提時(shí)間45 min、緩沖液pH 6.29、PVP 添加量為19%，模型的預(yù)測(cè)值為1 847.26 U/（g·min）。驗(yàn)證模型結(jié)果的偏差率為2.49%，滿足預(yù)期結(jié)果。ANN優(yōu)化金花茶花PPO 提取工藝的最佳條件為浸提時(shí)間45 min、緩沖液 pH 6.35、PVP 添加量為 22%，模型的預(yù)測(cè)值為1 825.70 U/（g·min），驗(yàn)證模型結(jié)果的偏差為1.14%，ANN 模型的相對(duì)誤差小于RSM，所以ANN 模型的精度更高，準(zhǔn)確性更強(qiáng)。