劉暢，吳雪輝，陳嘉慧

（華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642）

金花茶（Camellia nitidissima Chi）為山茶科，山茶屬，金花茶組植物，是中國的珍貴茶種，擁有“茶族皇后”、“植物界大熊貓”等美譽[1-2]。金花茶的主產(chǎn)地在我國廣西，目前云南、廣東、貴州等地區(qū)也有分布。許多研究表明，金花茶的花、莖、葉都有充分利用的價值，金花茶是唯一帶有金黃色花瓣的茶花品種，花瓣呈蠟質(zhì)，富含可溶性糖、多酚、黃酮等多種生物活性成分以及微量元素，擁有降血糖、降血壓、抗腫瘤和提高機體免疫力等多種功效作用，具有極高的觀賞價值、經(jīng)濟價值和極大的市場開發(fā)潛力，受到了廣泛地關(guān)注[1-8]。

國內(nèi)外對金花茶的研究主要集中于金花茶的遺傳多樣性、功能活性成分的分離純化、結(jié)構(gòu)分析以及新產(chǎn)品的開發(fā)利用。目前已上市的金花茶產(chǎn)品主要分為3 類包括茶飲料、保健品以及化妝品，其中茶飲料以金花茶葉為主，而金花茶花的產(chǎn)品較為稀少[9-14]。金花茶花的產(chǎn)品主要是花朵茶和花蕾茶，需要進行一定的加工、干燥而成，在加工過程中如何保持花的顏色和形態(tài)尤為關(guān)鍵[4]。

研究表明，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是造成果蔬和植物褐變的主要酶類，PPO 活性與褐變程度一般呈顯著相關(guān)性[15-18]。前期試驗結(jié)果表明，以PPO 為主的酶促褐變是金花茶花加工過程中顏色變化的主要原因。為深入探究金花茶花PPO 活性與褐變的相關(guān)性、尋求抑制褐變的方法，對金花茶花PPO 提取工藝條件進行優(yōu)化研究，這也為金花茶花PPO 的性質(zhì)進一步研究以及金花茶花的開發(fā)利用提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金花茶鮮花：廣東省佛山市林業(yè)科學研究所金花茶示范林，品種為普通金花茶。

聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、磷酸氫二鈉、檸檬酸、鄰苯二酚（均為分析純）：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

722 可見分光光度計、PHS-3C 型精密 PH 計：上海佑科儀器儀表有限公司；TGL-16M 高速冷凍離心機：湖南湘儀試驗室儀器開發(fā)有限公司；HZK-FA110電子天平：福州華志科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金花茶花PPO 粗酶液的提取

參照周燕燕方法[19]，稍作修改。挑選金花茶鮮花1 g 左右，加入pH 6.4 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液6 mL，（內(nèi)含 15%PVP），研磨 10 min，在 4 ℃浸提 30 min，9 000 r/min 冷凍離心15 min，收集上清液即為粗酶液。

1.3.2 單因素試驗

采用1.3.1 的方法提取金花茶花PPO，考察不同pH 值、浸提時間、PVP 添加量對金花茶花PPO 提取量的影響。

1.3.3 Box-Behnken 中心組合試驗設計

在單因素試驗結(jié)果的基礎上，采用Box-Behnken響應面法試驗設計模型，以緩沖液pH 值、浸提時間以及PVP 添加量為自變量，以PPO 提取量為響應值，進行響應面分析，因素水平如表1 所示。

表1 試驗因素與水平設計Table 1 Experimental factors and horizontal design

1.3.4 建立神經(jīng)網(wǎng)絡模型

本試驗運用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡進行建模，模型包含3層拓撲結(jié)構(gòu)，輸入層、隱含層以及輸出層，其中將自變量3 個因素作為網(wǎng)絡的輸入，因變量作為網(wǎng)絡的輸出，構(gòu)建一個3-6-1 結(jié)構(gòu)的級聯(lián)BP 神經(jīng)網(wǎng)絡。模型建立后，采用Matlab（2016b）軟件進行編程，選擇雙曲正切傳遞函數(shù)（tansig）作為隱含層傳遞函數(shù)，線性傳遞函數(shù)（purelin）作為輸出層傳遞函數(shù)，設置隱含層1 個，內(nèi)含神經(jīng)元6 個，通過Levenberg-Marquardt 算法對新建BP 網(wǎng)絡進行訓練，設定網(wǎng)絡訓練參數(shù)值，最大訓練次數(shù)為1 000 次，并采用均方誤差（mean-square error，MSE）評估神經(jīng)網(wǎng)絡模型的預測性能，以所有的試驗數(shù)據(jù)作為神經(jīng)網(wǎng)絡的訓練樣本進行模擬與仿真。與此同時比較分析響應面模型與人工神經(jīng)網(wǎng)絡的優(yōu)化結(jié)果。

1.4 金花茶花PPO提取量的測定

金花茶花PPO 提取量的測定參照李鵬[20]的方法。取pH 6 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液5 mL，加入0.5 mol/L 鄰苯二酚溶液1 mL，在室溫（20 ℃）條件下，將0.5 mL 粗酶液與上述溶液混合均勻后立即倒入5 cm 比色皿中，420 nm 處測定其吸光度，從酶液加入后開始計時，每30 s 記錄一次吸光度，共4 min。以底物溶液為空白組，計算酶的提取量，以酶活力代表酶的量。一個酶活力單位（U）定義為：在測定條件下，單位時間內(nèi)引起吸光度改變0.001 所需的酶量，計算公式如下：

式中：ΔA420nm為反應時間內(nèi)OD 變化值；VT為提取粗酶液總體積，mL；M 為金花茶花鮮重，g；t 為反應時間，min；VS為測定時取用酶液體積，mL。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用 Design-Expert 8.0.6 軟件和 Matlab（2016b）軟件進行數(shù)據(jù)處理、回歸分析及神經(jīng)網(wǎng)絡的建立、訓練。

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖液pH值對金花茶花PPO提取量的影響

稱取1 g 左右金花茶鮮花，分別加入pH 5.8、6.0、6.4、6.8、7.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液 6 mL，（內(nèi)含 15 % PVP），研磨 10 min，在 4 ℃浸提30 min，9 000 r/min 冷凍離心15 min，收集上清液測定吸光值并計算金花茶花PPO 提取量。結(jié)果如圖1 所示。

由圖1 可知，金花茶花PPO 提取量隨緩沖液pH 值的增加呈先升高后降低的趨勢，緩沖液pH 值在6.0～6.4范圍內(nèi)，PPO 提取效果好，最大值為1 178.90 U/（g·min），當緩沖液pH 6.4 時，PPO 提取量開始明顯下降，所以選擇pH 6.4 作為緩沖液pH 值的最優(yōu)條件。

2.2 浸提時間對金花茶花PPO提取量的影響

圖1 緩沖液pH 值對金花茶花PPO 提取量的影響Fig.1 Effect of buffer pH on the extraction amount of PPO from Camellia nitidissima flowers

稱取1 g 左右金花茶鮮花，分別加入pH 6.8 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液6 mL，（內(nèi)含15%PVP），研磨 10 min，在 4 ℃分別浸提 0、15、30、45、60 min，9 000 r/min 冷凍離心15 min，收集上清液，測定吸光值并計算金花茶花PPO 提取量。結(jié)果如圖2 所示。

圖2 浸提時間對金花茶花PPO 提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction amount of PPO from Camellia nitidissima flowers

由圖2 可知，PPO 提取量隨著浸提時間的延長先緩慢下降又明顯升高，當浸提時間為45 min 時，PPO提取量達到最大值為1 333.11 U/（g·min），此后，繼續(xù)延長浸提時間，PPO 提取量開始下降。這是因為在一定范圍內(nèi)隨著時間的不斷延長，利于酶蛋白的溶出，當溶出量達到最高至平衡時，繼續(xù)延長時間，由于酶蛋白在液態(tài)中構(gòu)象極其不穩(wěn)定水解，導致酶的提取量下降。

2.3 PVP添加量對金花茶花PPO提取量的影響

PVP 是一種酚類吸附劑，它與酚類物質(zhì)形成復合物，從而抑制酚類化合物與PPO 的聚合。稱取1 g 左右金花茶鮮花，分別加入pH 6.8 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液6 mL，分別添加10%、15%、20%、25%、30%PVP，研磨 10 min，在 4 ℃浸提 30 min，9 000 r/min 冷凍離心15 min，收集上清液，測定吸光值并計算金花茶花PPO 提取量。結(jié)果如圖3 所示。

圖3 PVP 添加量對金花茶花PPO 提取量的影響Fig.3 Effect of PVP on the extraction amount of PPO from Camellia nitidissima flowers

如圖3 所示，PPO 提取量隨著PVP 量的增加先上升后下降，當PVP 添加量達到20%時，PPO 提取量達到峰值1 115.31 U/（g·min）。因為適當?shù)靥砑覲VP，能夠有效地抑制酚類物質(zhì)與PPO 的聚合，利于PPO 的溶出，而PVP 添加量過高將導致溶液體系過于黏稠，對PPO 的提取會造成不利影響。

2.4 金花茶花PPO提取工藝的響應面優(yōu)化

2.4.1 BBD 試驗設計方案與結(jié)果

在單因素基礎上進行響應面優(yōu)化試驗，結(jié)果如表2 所示。

表2 Box-Behnken 試驗設計方案與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiment design and results

2.4.2 回歸方程擬合及方差分析

采用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計分析軟件對表2 試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，回歸分析結(jié)果見表3。

金花茶花PPO 提取量對浸提時間（A）、緩沖液pH值（B）和PVP 添加量（C）的二次多項式回歸模型為：

表3 回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗Table 3 Analysis of variance for the established regression model

Y=1 793.11-16.54A-159.42B-130.97C+5.29AB-41.77AC-12.4BC-212.79A2-276.28B2-250.37C2?；貧w模型的決定系數(shù)R2=0.992 2，說明該模型與實際擬合良好，試驗方法可靠，失擬項不顯著（P＞0.05），因此可用此模型來優(yōu)化金花茶花PPO 提取工藝。

2.4.3 模型雙因素交互作用效應分析

根據(jù)Desig-Expert 得出各因素間的交互作用對金花茶花PPO 活力的影響，三維圖和等高線圖如圖4所示。

圖4 緩沖液pH 值、浸提時間與PVP 添加量交互作用的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plot of buffer pH，extraction time and PVP addition

由圖4b 可知，曲面較陡峭，說明浸提時間和PVP添加量之間的交互作用顯著，原因是PVP 的性質(zhì)隨著浸提時間的變化而變化，導致PVP 對粗酶液中一些酚類物質(zhì)的吸附作用發(fā)生改變，進而影響PPO 的提取量。

通過對回歸方程求解，得最優(yōu)提取工藝為浸提時間 45 min、緩沖液 pH 6.29、PVP 添加量為 19 %，此條件下模型的預測值為1 847.26 U/（g·min）?？紤]實際操作，將試驗條件定為浸提時間45 min、緩沖液pH 6.30、PVP 添加量為19%。

2.5 神經(jīng)網(wǎng)絡的訓練與仿真

將所有的試驗數(shù)據(jù)作為網(wǎng)絡的訓練樣本進行訓練和仿真。在級聯(lián)BP 神經(jīng)網(wǎng)絡訓練的過程中會將用來訓練的訓練樣本按照默認比例隨機劃分為3 組樣本：訓練樣本（train set）、驗證樣本（validation set）和預測樣本（test set）。在Matlab 軟件下進行編程并實現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡訓練過程，結(jié)果見圖5～圖6。

圖5 BP 人工神經(jīng)網(wǎng)絡的訓練過程Fig.5 Training process of BP artificial neural network

圖6 回歸坐標圖Fig.6 Regression coordinates

由圖5 可知，在迭代次數(shù)為8 時，最佳驗證性能0.003 807。經(jīng)過8 次訓練后網(wǎng)絡的驗證誤差小于0.01，已達到平衡狀態(tài)（圖中圓點處），之后訓練誤差以及驗證誤差一直保持穩(wěn)定，驗證誤差經(jīng)過連續(xù)6 次迭代訓練后不再減少，繼續(xù)訓練會造成過度擬合。因此該神經(jīng)網(wǎng)絡在訓練了14 次迭代后性能已達到訓練要求，說明該神經(jīng)網(wǎng)絡具有好的收斂性。

由圖6 可知，3 類樣本數(shù)據(jù)回歸直線的相關(guān)系數(shù)分別為 0.957 07，0.991 7，0.970 71，所有訓練樣本回歸直線的R=0.967 6，說明經(jīng)過訓練后的級聯(lián)BP 神經(jīng)網(wǎng)絡的預測值與實測值具有良好的相關(guān)性。訓練成熟的模型運行后得到最終優(yōu)化的結(jié)果：浸提時間為45.06 min，緩沖液 pH 6.35，PVP 添加量為 22%，此條件下的模型預測值為1 825.7 U/（g·min），考慮試驗操作得可行性，試驗條件定為浸提時間為45 min，緩沖液pH 6.35，PVP 添加量為 22%。

2.6 優(yōu)化結(jié)果的驗證與比較

為了驗證兩種模型對金花茶花PPO 提取工藝優(yōu)化的有效性，在最佳工藝條件下進行3 次重復試驗并取平均值，結(jié)果如表4 所示。

表4 優(yōu)化結(jié)果比較Table 4 Comparision of optimizing results

由表4 可知，通過神經(jīng)網(wǎng)絡模型優(yōu)化的實際值高、相對誤差小，但R2略小于響應面模型，說明響應面優(yōu)化法可能出現(xiàn)了過度擬合的現(xiàn)象。因此神經(jīng)網(wǎng)絡模型的準確性更高，可信度更強。

3 結(jié)論

采用RSM 優(yōu)化金花茶花PPO 提取工藝，優(yōu)化的最佳條件為浸提時間45 min、緩沖液pH 6.29、PVP 添加量為19%，模型的預測值為1 847.26 U/（g·min）。驗證模型結(jié)果的偏差率為2.49%，滿足預期結(jié)果。ANN優(yōu)化金花茶花PPO 提取工藝的最佳條件為浸提時間45 min、緩沖液 pH 6.35、PVP 添加量為 22%，模型的預測值為1 825.70 U/（g·min），驗證模型結(jié)果的偏差為1.14%，ANN 模型的相對誤差小于RSM，所以ANN 模型的精度更高，準確性更強。