梁杰，鄧波，劉濤，汪秀妹，趙曉旭，汪少蕓

（1.莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建莆田351100；2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州350108）

紫菜是重要的海洋經(jīng)濟(jì)海藻，品種豐富，主要以壇紫菜、條斑紫菜最為常見[1]。早在二十世紀(jì)中葉，我國(guó)長(zhǎng)江以南就實(shí)現(xiàn)了壇紫菜的人工養(yǎng)殖[2]。壇紫菜是福建特有的栽培品種，以營(yíng)養(yǎng)豐富、滋味鮮美著稱，富含蛋白質(zhì)、多酚、多糖、礦物元素等，素有“營(yíng)養(yǎng)寶庫(kù)”的美稱[3]。壇紫菜可多次收割，4 次收割以后的殘次紫菜俗稱為末水紫菜，末水壇紫菜由于口感、色澤較差，常被作為農(nóng)產(chǎn)品下腳料隨意丟棄甚至腐爛在海水中，造成極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[4-5]。據(jù)報(bào)道，2016 年福建省紫菜年產(chǎn)量已達(dá)到6.6 萬噸[6]，末水紫菜可占10%以上，雖然末水壇紫菜食用價(jià)值低，但仍然還有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和藥用價(jià)值，如何從廢棄壇紫菜中提取有效成分以提升其經(jīng)濟(jì)附加值具有重要的經(jīng)濟(jì)意義[7-9]。

自由基（free radical）是化合物分子受到外界環(huán)境如光、熱、輻射等作用導(dǎo)致共價(jià)鍵發(fā)生均裂而形成的具有不成對(duì)電子的原子或基團(tuán)，是需氧型動(dòng)物機(jī)體內(nèi)正常生理代謝產(chǎn)生的如 O2-、OH-、NO 等基團(tuán)[10]，機(jī)體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡的自由基對(duì)人體有益，它們?cè)趲椭鷤鬟f維持生命活力的能量的同時(shí)被用來殺滅細(xì)菌和寄生蟲，承擔(dān)重要的生物學(xué)功能。當(dāng)機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除無法平衡時(shí)，自由基就會(huì)攻擊生物體細(xì)胞組織造成損傷，對(duì)核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、酶、生物膜及機(jī)體循環(huán)和免疫系統(tǒng)進(jìn)行破壞，干擾體內(nèi)新陳代謝，以致產(chǎn)生更多自由基，惡性循環(huán)，導(dǎo)致衰老、炎癥和各種疾病，如老年癡呆、癌癥等[11]，甚至造成死亡。

本文以末水壇紫菜為原料，以DPPH 自由基清除率和抗氧化肽得率為指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行酶解，篩選最適的酶制劑。以抗氧化能力和得率為指標(biāo)，借助超聲波技術(shù)輔助提取，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳酶解工藝，得到具有較強(qiáng)抗氧化能力的水解肽并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行分析，包括氨基酸含量和分子量分布組成，以期為末水壇紫菜高值化利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)原料

壇紫菜：福建莆田沃爾瑪超市。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶：南京都萊生物技術(shù)有限公司；其它化學(xué)試劑均為分析純。試驗(yàn)過程使用均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-10N 型冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份公司；UV2550 紫外/可見分光光度計(jì)：日本島津公司；DGG-9053A 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FW-100 高速萬能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；BCD-208K/A 型冰箱：中國(guó)海爾集團(tuán)；MDFU333 型超低溫冰箱：日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；STARTER-2100 型精密數(shù)顯酸度計(jì)：奧豪斯儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫菜活性肽制備方法

1.3.1.1 酶解工藝

干壇紫菜→剪碎用粉碎機(jī)打至細(xì)粉狀→加水?dāng)嚢柚镣耆芙狻罴衙附鈼l件，充分酶解→100 ℃下滅酶10 min→靜置冷卻后10 000 r/min 速率離心分離10 min，取上清液→酶解液，凍干備用

1.3.1.2 篩選最適酶制劑

選用5 種對(duì)壇紫菜酶解效率較高的酶制劑，以DPPH 自由基清除率和抗氧化肽得率為參考評(píng)價(jià)酶解效果，篩選最適蛋白酶。各酶的最適條件見表1。

表1 蛋白酶最適pH 值和溫度Table 1 Suitable hydrolysis pH value and temperature for proteases

反應(yīng)初始條件為：取0.25 g 紫菜粉末加入50 mL 的蒸餾水，分別在最適酶解條件水解紫菜粉末，酶用量為10 000 U/g，反應(yīng)10 h 后，滅酶活，酶解液凍干，測(cè)定。

以多肽的得率和酶解產(chǎn)物DPPH 自由基清除率為指標(biāo)，選擇最佳酶作為后續(xù)試驗(yàn)的工具酶。

1.3.2 DPPH 自由基清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12]的方法并加以改進(jìn)測(cè)定DPPH 自由基清除率。將濃度為0.002 g/mL 的2 mL 樣品溶液加入試管中，在試管中加入濃度為0.004 g/L 的2 mL DPPH·無水乙醇溶液，放置在黑暗環(huán)境下反應(yīng)30 min，取出來后在517 nm 的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，記為Ai；再取濃度為0.002 g/mL 的2 mL 樣品溶液與2 mL 無水乙醇溶液混合，操作同上，其吸光度記為Aj；再取2 mL無水乙醇溶液與濃度為0.004 g/L 的2 mL DPPH·無水乙醇溶液混合，操作同上，吸光度記為Ao；重復(fù)3 次。酶解產(chǎn)物的DPPH 自由基清除計(jì)算公式如下：

1.3.3 紫菜多肽得率的計(jì)算

準(zhǔn)確稱量酶解反應(yīng)前的紫菜樣品粉末重量，記為Ae；酶解上清液冷凍干燥，準(zhǔn)確稱量品重量并記錄，記為At，計(jì)算多肽得率的公式為：

1.3.4 單因素試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[13]并在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多肽得率和DPPH 自由基清除率為指標(biāo)，設(shè)置初始條件為：pH7.0、底物濃度5%、溫度50 ℃、酶用量10 000 U/g，分別考察酶解溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、酶解時(shí)間（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h）、酶用量（5 000、10 000、15 000、20 000、25 000、30 000 U/g）、底物濃度（3 %、4 %、5%、6%、7%、8%）等條件對(duì)酶解效果的影響，確定各因素的適宜水平范圍。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

通過分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取了酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）、酶用量（C）和底物濃度（D）這 4 種因素進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以上述4 個(gè)因素為自變量，以酶解得到抗氧化肽的DPPH 自由基清除率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 Box-Behnken 因素水平設(shè)計(jì)表Table 2 Factors and levels of the Box-Behnken experimental dsign

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel2013，Design Expert8.05 軟件繪圖，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳酶制劑篩選

選擇酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、纖維素酶、胰蛋白酶對(duì)紫菜進(jìn)行酶解，反應(yīng)初始條件設(shè)置為：底物濃度5%、酶用量10 000 U/g，酶解條件如表1所示為各蛋白酶的最適條件。以酶解產(chǎn)物的DPPH 自由基清除率和多肽得率為指標(biāo)篩選酶解壇紫菜的最佳工具酶，結(jié)果如圖1 所示。

當(dāng)各種蛋白酶分別處于各自最適溫度、pH 值，且底物濃度和加酶量一致的條件下，各種蛋白酶對(duì)紫菜蛋白的酶切位點(diǎn)和酶解產(chǎn)物性質(zhì)并不相同，酶解效果具有顯著的差異性[14]，各種酶解產(chǎn)物抗氧化能力強(qiáng)弱依次為：中性蛋白酶＞堿性蛋白酶＞酸性蛋白酶＞胰蛋白酶＞纖維素酶，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物DPPH 自由基清除能力最強(qiáng)為（43.25±0.14）%。雖然纖維素酶酶解產(chǎn)物多肽得率最高（70.42±0.12）%，但酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH 自由基清除率較低，不適合作為后續(xù)研究的工具酶。中性蛋白酶是一種非特異性內(nèi)切酶，對(duì)海洋生物的酶解效率高，酶解切割肽段小，酶解最徹底。綜上所述，選擇中性蛋白酶為最適工具酶進(jìn)行后續(xù)酶解工藝的研究，這與王小慧等對(duì)壇紫菜篩選最佳蛋白酶的研究結(jié)果一致[9，15-17]。

圖1 最佳工具酶的確定Fig.1 Fix the most suitable protease

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

各因素對(duì)酶解效果的影響見圖2。

圖2 各因素對(duì)酶解效果的影響Fig.2 Effects of different factors on eymohydrolysis

2.2.1 酶解溫度的確定

由圖2A 可知，酶解產(chǎn)物的DPPH 自由基清除率隨著溫度的升高先增大后降低，當(dāng)酶解溫度為40 ℃時(shí)，DPPH 自由基清除率和多肽得率到達(dá)最大值（65.06±0.32）%、（68.02±0.58）%，由于高溫會(huì)使蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，造成酶活降力降低，影響酶促反應(yīng)的進(jìn)行，酶解產(chǎn)物的活性成分降低[18]，選擇40 ℃為最佳酶解溫度。

2.2.2 酶解時(shí)間的確定

由圖2B 可知，多肽得率隨著時(shí)間的增大呈上升趨勢(shì)，酶解時(shí)間為4 h 時(shí)產(chǎn)物的DPPH 自由基清除能力最強(qiáng)為（72.67±0.27）%，此時(shí)繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間產(chǎn)物的抗氧化能力開始下降，酶解12 h 多肽得率最高。綜合考慮時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本的實(shí)際情況，選擇最佳酶解時(shí)間為4 h。

2.2.3 酶用量的確定

由圖2C 可知，在一定范圍內(nèi)多肽得率隨酶用量的增加而增加，當(dāng)酶用量達(dá)到30 000 U/g 時(shí)，多肽的得率達(dá)到最大值（80.84±0.45）%。隨著加酶量的增加，增加了中性蛋白酶與紫菜蛋白的有效結(jié)合，提高了酶解效率，當(dāng)加酶量過飽和時(shí)，酶解進(jìn)程減緩[19]。DPPH 自由基清除率在酶用量達(dá)到20 000 U/g 時(shí)達(dá)到最高值（74.44±0.32）%。綜合考慮，選擇酶用量 20 000 U/g 為最佳水平。

2.2.4 底物濃度的確定

由圖2D 可知，隨著底物濃度提高多肽得率和DPPH 自由基清除率都相應(yīng)提高，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，清除率到達(dá)最高值（68.55±0.64）%，此時(shí)多肽得率為（59.20±0.31）%已接近最大值，此后底物濃度繼續(xù)提高酶解產(chǎn)物的自由基清除率反而下降，這是由于底物濃度太高導(dǎo)致酶促反應(yīng)體系過于黏稠，不利于酶的與底物有效結(jié)合，影響蛋白酶活力的釋放[20]。綜上所述，選擇底物濃度4%為最佳水平。

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 響應(yīng)面結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取了酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）、酶用量（C）和底物濃度（D）這 4 個(gè)對(duì)酶解法關(guān)鍵的工藝參數(shù)為自變量，以酶解得到抗氧化肽的DPPH 自由基清除率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of response surface

2.3.2 響應(yīng)面方差分析

運(yùn)用Design Expert8.06 軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析并進(jìn)行多元回歸擬合，得到的方程為Y=85.4+0.33A-0.03B-0.51C-9.51D+1.36AB+1.29AC-2.61AD+2.09BC+2.22BD+8.3CD-1.17A2-6.79B2-5.7C2-6.88D2。方差分析見表4。

表4 方差分析表Table 4 Results of variance analysis

回歸方程的模型P＜0.000 1，F(xiàn)=24.46，說明模型差異性顯著，失擬項(xiàng)的誤差值P 為0.266 7＞0.05，失擬不顯著，回歸方程的擬合度高，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.960 3，調(diào)整系數(shù)R2adj=0.920 6，該模型可以解釋92.06%的響應(yīng)值變化，該模型的DPPH 自由基清除率的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值良好，可用來分析和預(yù)測(cè)酶解法制備壇紫菜抗氧化肽的DPPH 自由基清除率。

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析

響應(yīng)曲面坡度陡峭和等高線呈橢圓形表明兩因素交互作用影響顯著，若曲面坡度平緩且等高線呈圓形則表示酶解條件發(fā)生變化時(shí)對(duì)響應(yīng)值變化影響不顯著[21]。各因素之間的交互作用如圖3 所示，響應(yīng)曲面陡峭，等高線呈橢圓形，表明酶用量與底物濃度之間的交互作用影響顯著。

2.3.4 最佳酶解條件的確定和驗(yàn)證

采用DesignExpert8.05 分析，最佳酶解條件為：酶解時(shí)間3.59 h、酶解溫度47.33 ℃、加酶量16 362.13 U/g、底物濃度3.0%、pH7.0 時(shí)，DPPH 自由基清除率可以達(dá)到92.61%，結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件設(shè)定酶解工藝參數(shù)：酶解時(shí)間3.6 h、酶解溫度47 ℃、酶用量16 362 U/g、底物濃度3.0%、pH7.0。在該工藝下做3 組平行試驗(yàn)，測(cè)得壇紫菜抗氧化肽的DPPH 自由基清除率達(dá)到（91.83±0.80）%，與預(yù)測(cè)值相差0.84 %。表明該響應(yīng)面模型可靠。

圖3 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plots showing the effects of various factors

3 結(jié)論

結(jié)果表明中性蛋白酶為末水壇紫菜最佳水解酶制劑。采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化其最佳酶解條件為：酶解溫度47 ℃、酶解時(shí)間3.6 h、酶用量16 362 U/g、底物濃度3.0%、pH7.0。此條件下酶解末水壇紫菜制備的抗氧化肽DPPH 自由基清除率高達(dá)（91.83±0.81）%，較未優(yōu)化前的DPPH 自由基清除率提高52.90%，表明該優(yōu)化模型可靠，末水壇紫菜水解肽具有良好的抗氧化能力[22]。本研究為末水壇紫菜高值化利用提供了理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)，具有廣闊的經(jīng)濟(jì)效益和良好的環(huán)境效益。