李 俊 李 亮 李夏瑩 宋貴文 沈 平 張 麗 翟杉杉 柳方方 吳 剛 張秀杰,* 武玉花,*

轉(zhuǎn)基因玉米MIR604基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制

李 俊1李 亮2李夏瑩3宋貴文3沈 平3張 麗1翟杉杉1柳方方2吳 剛1張秀杰3,*武玉花1,*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430062;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081;3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心, 北京 100025

轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的保障, 而轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因監(jiān)管檢測的物質(zhì)基礎(chǔ), 缺少標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)就難以保證檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性和可比性。轉(zhuǎn)基因玉米MIR604是我國批準(zhǔn)進(jìn)口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因品種, 對其安全監(jiān)管亟須制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本項(xiàng)目通過對轉(zhuǎn)基因玉米MIR604種子進(jìn)行原材料鑒定、研磨、過篩、含水量測定等步驟, 制備出轉(zhuǎn)基因玉米MIR604純品基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果表明, 本批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在瓶內(nèi)和瓶間均具有良好的均勻性, 可在常溫下運(yùn)輸1個(gè)月, 長期穩(wěn)定性達(dá)到6個(gè)月, 量值穩(wěn)定。本批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值為轉(zhuǎn)基因DNA與總DNA的拷貝數(shù)比值, 由9家實(shí)驗(yàn)室采用MIR604/二重?cái)?shù)字PCR聯(lián)合定值, 量值為0.50。充分評(píng)估了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的各個(gè)不確定度分量, 合成擴(kuò)展不確定度為0.06 (copy/copy)。本批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)規(guī)格為1 g 瓶–1, 使用時(shí)最小取樣量為100 mg, 可用于轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的安全監(jiān)管和定量標(biāo)識(shí)、以及實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制等領(lǐng)域。

轉(zhuǎn)基因玉米MIR604; 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì); 數(shù)字PCR; 實(shí)時(shí)熒光PCR; 聯(lián)合定值

隨著生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展, 對轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管工作, 政府越來越重視, 民眾越來越關(guān)注。2007年至今, “中央一號(hào)文件”已有８次明確提及轉(zhuǎn)基因, 強(qiáng)調(diào)“加強(qiáng)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)和監(jiān)管, 在確保安全的基礎(chǔ)上慎重推廣”[1]。實(shí)施轉(zhuǎn)基因生物安全管理和標(biāo)識(shí), 一方面要建立轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)方法, 另一方面要研制轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一種或多種足夠均勻和很好地確定了的特性(轉(zhuǎn)基因成分和含量), 在轉(zhuǎn)基因檢測中用以校正測量裝置、評(píng)價(jià)測量方法或給材料賦值的一種材料和物質(zhì)[2-3]。近年來, 我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化工作進(jìn)展迅速, 建立了完善的轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)方法體系, 涵蓋國家標(biāo)準(zhǔn)、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的具國家標(biāo)準(zhǔn)效力的公告以及進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等。相對于標(biāo)準(zhǔn)方法, 我國轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制工作嚴(yán)重滯后于轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管工作的實(shí)際需求。而轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是保障檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、可比、有效和可溯源的物質(zhì)基礎(chǔ), 轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的缺乏將嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全評(píng)價(jià)、身份驗(yàn)證、國內(nèi)監(jiān)管、進(jìn)出口檢驗(yàn)、企業(yè)自控和國際貿(mào)易互認(rèn)等工作[4-5]。

為了對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行有效的監(jiān)管和實(shí)施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)法規(guī), 原則上, 每種批準(zhǔn)商業(yè)化的轉(zhuǎn)化體都必須研制對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 歐盟、美國、日本等從2000年前后就開始大力研制轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 于2004年公開發(fā)售研制成功的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)品。研制轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最多的研發(fā)機(jī)構(gòu)主要有歐盟聯(lián)合研究中心下屬的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM)和美國石油化學(xué)家學(xué)會(huì)(American Oil Che-mists’ Society, AOCS)[6]。到2017年, 歐盟IRMM針對在歐盟商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)研發(fā)127種轉(zhuǎn)基因檢測基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 涵蓋了六大作物的30個(gè)轉(zhuǎn)基因品種, 如轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、轉(zhuǎn)基因玉米 MON863、轉(zhuǎn)基因油菜73496等, 每個(gè)品種有2~6個(gè)濃度梯度; IRMM還研發(fā)了4種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 包括轉(zhuǎn)基因玉米MON810、98140、NK603和轉(zhuǎn)基因大豆356043[5]。美國的AOCS生產(chǎn)了35種基體粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和19種純品基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 涉及的轉(zhuǎn)化體幾乎覆蓋目前已在國際市場上商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物[7]。

為了滿足不斷增長的食用油和飼料需求, 我國從2003年開始大量進(jìn)口轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品用作加工原料, 批準(zhǔn)進(jìn)口的品種包括19個(gè)玉米、14個(gè)大豆、9個(gè)棉花、8個(gè)油菜和1個(gè)甜菜。在轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管工作中, 我國一直從國外購買轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 周期長、價(jià)格昂貴。為了消除對國外標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的嚴(yán)重依賴, 從2008年開始我國自主研發(fā)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。轉(zhuǎn)基因玉米MIR604是先正達(dá)公司(Syngenta)研發(fā)的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米, 2008年我國批準(zhǔn)其進(jìn)口用作加工原料, 是我國進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的重要對象。轉(zhuǎn)基因玉米MIR604采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將修飾的抗蟲基因表達(dá)盒(pMTL-mcry3A-Tnos)和磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因表達(dá)盒(pZmUbiInt-pmi-Tnos)轉(zhuǎn)化到玉米中, 在受體基因組中外源基因?yàn)閱慰截惒迦? 插入位點(diǎn)的旁側(cè)基因組序列已經(jīng)闡釋清楚, 5′端旁側(cè)基因組序列長1312 bp, 3′端旁側(cè)基因組序列長1570 bp[8]。

本研究的目的是研制轉(zhuǎn)基因玉米MIR604基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 用于對轉(zhuǎn)基因玉米MIR604及其加工產(chǎn)品的定性和定量檢測, 為我國轉(zhuǎn)基因生物安全管理和標(biāo)識(shí)制度的實(shí)施提供有效的技術(shù)支撐。通過轉(zhuǎn)基因玉米MIR604基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制, 建立起轉(zhuǎn)基因玉米檢測基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備、檢測、質(zhì)量控制、定值和量值溯源的技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因玉米MIR604種子由先正達(dá)公司提供。

1.2 原材料研磨及過篩

采用冷凍研磨系統(tǒng)Spex6870研磨轉(zhuǎn)基因玉米MIR604種子。先在儀器中注入液氮, 令儀器充分冷卻。待其充分冷卻后, 將種子和撞子裝入樣品瓶, 浸入液氮, 以電磁為動(dòng)力, 帶動(dòng)鋼制撞子粉碎研磨。樣品瓶在破碎過程中處于全封閉狀態(tài), 可避免樣品間的交叉污染以及外界污染。優(yōu)化后的冷凍研磨程序?yàn)轭A(yù)冷10 min, 運(yùn)行3 min, 停止2 min, 5個(gè)循環(huán)。

研磨后的玉米粉末, 用振動(dòng)分篩機(jī)(8411-A, 湖南湘潭)以40、80、120和160目標(biāo)準(zhǔn)篩分篩, 120目以上顆粒需第2次研磨, 研磨后, 干燥、過篩, 與第1次篩分的120目以下顆粒混合在一起, 用粉末混勻機(jī)進(jìn)行(YG-1KG, 進(jìn)杰機(jī)械)正反轉(zhuǎn)混勻?；靹虺绦?yàn)?0轉(zhuǎn) min–1, 攪拌3 h, 停止1 h, 4個(gè)循環(huán)?；靹蚝笱b入干燥密封瓶中備用。

1.3 DNA提取及質(zhì)量評(píng)價(jià)

取研磨的玉米粉末100 mg, 用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit試劑盒按說明書提取其基因組DNA, 將提取的DNA溶解到90 μL 0.1×TE緩沖液中, 基因組DNA完全溶解后, 在Nanodrob 1000儀器上采用紫外分光光度法測定DNA溶液的OD230、OD260、OD280, 考察DNA的純度和濃度。然后制備1%的瓊脂糖凝膠, 取 1 μL DNA溶液進(jìn)行凝膠電泳分析, 評(píng)估DNA的完整性。

1.4 PCR

1.4.1 普通PCR 在PCR儀C1000 (伯樂, Hercules, CA, USA)上進(jìn)行普通PCR, 25 μL反應(yīng)體系含1 μL DNA模板, 1× PCR buffer [含10 mmol L–1Tris HCl (pH 8.3), KCl 50 mmol L–1], 200 μmol L–1dNTPs, 2.5 mmol L–1MgCl2, 250 nmol L–1的正向引物和反向引物, 1 UDNA聚合酶。反應(yīng)程序?yàn)?4°C 2 min預(yù)變性; 94°C 15 s, 60°C 30 s, 72°C 30 s, 35次循環(huán); 72°C 保溫2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離, EB染色后鑒定是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光PCR 在CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR儀(伯樂, Hercules, CA, USA)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增, 玉米轉(zhuǎn)化體MIR604、MON810、T25、MON863、NK603、TC1507和玉米內(nèi)標(biāo)基因的PCR體系均含基因組DNA 2.0 μL, 1×Man Universal PCR Master Mix, 400 nmol L–1primer, 200 nmol L–1probe, 1 UDNA 聚合酶, 加ddH2O至總反應(yīng)體積為20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5oC變性10 min; 95oC變性15 s, 60oC退火延伸1 min, 50個(gè)循環(huán)。

1.4.3 數(shù)字PCR 在微滴數(shù)字PCR平臺(tái)QX200上進(jìn)行MIR604/二重?cái)?shù)字PCR, 優(yōu)化后的反應(yīng)體系為20 μL, 包含10 μL 2×ddPCR Master Mix, 10 μmol L–1正向引物和反向引物各0.8 μL、探針0.4 μL, DNA模板2 μL。將20 μL PCR體系和70 μL微滴生成油(droplet generation oil)加入微滴生成卡, 覆蓋專用膠墊后置微滴生成儀生成微滴。將生成的微滴轉(zhuǎn)移至PCR管, 置普通PCR儀C1000進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)?5oC 變性10 min; 95oC變性15 s, 57.7oC退火延伸1 min, 50個(gè)循環(huán); 98oC酶變性10 min; 4oC保存。擴(kuò)增后, 將96孔板置微滴讀取儀中讀取信號(hào), 并使用軟件QuantaSoft V1.3.2.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值

參加定值的實(shí)驗(yàn)室需配備數(shù)字PCR系統(tǒng), 并有一定的技術(shù)權(quán)威性[9]。首先, 由組織單位制定詳細(xì)的定值實(shí)施方案, 詳細(xì)規(guī)定樣品的發(fā)送、保存、操作步驟、反應(yīng)體系、程序及操作注意事項(xiàng)等。然后將經(jīng)過質(zhì)量驗(yàn)證的引物/探針和制備的粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分發(fā)給9家實(shí)驗(yàn)室, 嚴(yán)格根據(jù)定值實(shí)施方案操作, 測定后將軟件QuantaSoft V1.3.2.0導(dǎo)出的數(shù)據(jù)反饋給組織單位, 匯總并處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原材料鑒定

2.1.1 典型性鑒定 首先對轉(zhuǎn)基因玉米種子進(jìn)行轉(zhuǎn)化體特異性及“排他性”檢測, 以驗(yàn)證原材料是否是預(yù)期的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604, 以及轉(zhuǎn)基因玉米MIR604是否被其他玉米轉(zhuǎn)化體污染。根據(jù)“基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物鑒定方法”(農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告- 19-2010), 取至少3000粒種子研磨成粉末, 用1 g粉末提取基因組DNA。以提取的基因組DNA作為實(shí)時(shí)熒光PCR模板, 用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和6種轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體特異性引物/探針(MIR604、MON863、MON810、NK603、T25、TC1507)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 引物/探針信息見表1。擴(kuò)增結(jié)果顯示, 只有MIR604轉(zhuǎn)化體特異性引物有典型擴(kuò)增曲線, 對其他轉(zhuǎn)化體的引物均沒有擴(kuò)增曲線。僅內(nèi)標(biāo)基因和MIR604引物/探針序列有典型擴(kuò)增曲線, 其他轉(zhuǎn)化體均無擴(kuò)增曲線, 表明轉(zhuǎn)基因原材料確為轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的種子, 且沒被其他的玉米轉(zhuǎn)化體污染。

2.1.2 純度鑒定 采用四分法抽取玉米MIR604種子240粒, 用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取單粒基因組DNA, 用MIR604轉(zhuǎn)化體特異性引物探針MIR604F/R/P進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。檢測結(jié)果顯示240粒種子均為陽性。根據(jù)泊松分布原理, 在95%的置信度下, 其純度≥98.76%。

2.1.3 基因型鑒定 轉(zhuǎn)基因玉米種子的基因型與其轉(zhuǎn)基因含量密切相關(guān), 根據(jù)MIR604轉(zhuǎn)化體的分子特征, 在插入位點(diǎn)的兩側(cè)基因組序列上分別設(shè)計(jì)1條引物(MIR604GF/MIR604GR), 在插入位點(diǎn)處設(shè)計(jì)1條探針(MIR604GP)(圖1), 序列見表1。將插入位點(diǎn)特異性引物探針組合MIR604GF/R/P與MIR604轉(zhuǎn)化體特異性引物探針MIR604F/R/P組合使用, 鑒定轉(zhuǎn)基因玉米MIR604種子的基因型。對于純合種子, 2條染色體上均含有外源插入序列, 只有引物探針組合MIR604F/R/P有典型擴(kuò)增曲線, 而引物探針組合MIR604GF/R/P無擴(kuò)增曲線; 對于雜合種子, 一條染色體上有插入序列, 另一條染色體上沒有, 2個(gè)引物探針組合均有典型擴(kuò)增曲線。對于陰性植株, 因不含有外源插入序列, 只有引物探針組合MIR604GF/R/P有典型擴(kuò)增曲線(圖1)。將單粒提取的基因組DNA作為PCR的模板, 用MIR604轉(zhuǎn)化體、插入位點(diǎn)和內(nèi)標(biāo)基因3個(gè)引物/探針組合同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果顯示, 240粒種子的單粒DNA中3個(gè)引物/探針組合均有典型擴(kuò)增曲線(圖2), 表明原材料MIR604種子均為雜合種子。

表1 引物探針信息表

圖1 鑒定轉(zhuǎn)基因種子基因型的原理示意圖

灰白矩形表示受體基因組DNA, 帶白斑點(diǎn)的黑色矩形表示外源插入序列, 箭頭表示引物位置, 加粗黑線表示探針位置。

The grey rectangles indicate the recipient genomic DNA, the black rectangles with white spots indicate the insert DNA, the arrows indicate the position of the primers, and the bold black lines indicate the position of the probes.

圖2 雜合種子的擴(kuò)增曲線圖

2.2 粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

2.2.1 種子研磨 將種子清洗、烘干后, 在冷凍研磨系統(tǒng)Spex6870中研磨。研磨完后, 過篩, 120目以上的顆粒經(jīng)第2次研磨, 研磨好的粉末裝入干燥密封瓶中。稱取10 g粉末利用振動(dòng)分篩機(jī)進(jìn)行顆粒大小測定, 重復(fù)3次。轉(zhuǎn)基因原材料粉末約有50%的顆粒介于120~200 μm之間, 而顆粒度小于200 μm的顆粒均占80%以上, 與歐盟制備的粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的粒度大小相近。

2.2.2 含水量測定 粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含水量與其穩(wěn)定性密切相關(guān), 稱取6份MIR604玉米粉末, 每份2 g, 用卡爾費(fèi)休滴定法測試含水量, 測試6個(gè)重復(fù)。粉末含水量(4.30±0.03)%, 低于農(nóng)業(yè)部1782號(hào)公告- 8-2012規(guī)定的10%[16]。

2.2.3 均勻性初檢 將轉(zhuǎn)基因玉米MIR604種子粉末在混勻機(jī)中混勻?；靹蜻^程中每隔3 h取樣一次, 共取樣4次。每次選不同的部位取樣, 取9份, 每份100 mg。提取樣品的基因組DNA, 采用表1中MIR604轉(zhuǎn)化體和玉米內(nèi)標(biāo)基因特異性引物探針進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。以基因型鑒定的純品MIR604基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的轉(zhuǎn)基因含量(轉(zhuǎn)基因和內(nèi)標(biāo)基因拷貝數(shù)比值)。采用方差分析法檢驗(yàn)數(shù)據(jù), 檢驗(yàn)結(jié)果表明, 從不同位置抽取的樣品其量值均在0.45~0.55的區(qū)間內(nèi)波動(dòng), 沒有明顯差異(圖3), 均勻性良好, 且不隨混勻時(shí)間的長短發(fā)生變化, 表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

圖3 均勻性初檢樣品的量值測定結(jié)果

2.2.4 分裝和保存 將轉(zhuǎn)基因玉米MIR604種子粉末分裝, 稱取約1.00 g (0.98~1.02 g)的粉末置玻璃瓶中, 調(diào)節(jié)高壓氮?dú)獾牡蛪罕須鈮旱?.5~0.8 MPa之間, 將調(diào)節(jié)好氣流量的氮?dú)庀鹉z管對準(zhǔn)玻璃瓶口充氣, 約2~3 s, 移除氮?dú)夤? 同時(shí)將橡膠塞蓋緊, 將加好塞的玻璃瓶在自動(dòng)軋蓋機(jī)上軋蓋。分裝完成后粘貼標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)初級(jí)標(biāo)簽。分裝好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)規(guī)格約為每瓶1.00 g (0.98~1.02 g), 分裝400瓶。?20℃保存。

2.3 均勻性檢驗(yàn)

從制備的400瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取15瓶, 分別標(biāo)記1~15, 從每瓶上中下3個(gè)位置取3個(gè)子樣, 每份取樣量為100 mg, 共取樣45份。在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)條件下測定抽取的樣品, 從而使樣品間的差異完全反映樣品間的不均勻性。提取樣品DNA, 采用熒光定量PCR擴(kuò)增MIR604轉(zhuǎn)化體和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因, 用

基因型鑒定的純品基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品中MIR604特異性序列和內(nèi)標(biāo)基因的拷貝數(shù)比值, 15瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因含量水平在0.5左右波動(dòng)(圖4)。方差分析法是通過組間(瓶間)方差和組內(nèi)(瓶內(nèi))方差的比較來判斷各組測量值之間有無系統(tǒng)性差異, 如果二者的比值小于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的臨界值, 則認(rèn)為樣品是均勻的[17]。采用單因素方差分析法(檢驗(yàn)法)對拷貝數(shù)比值進(jìn)行均勻性檢驗(yàn), 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明<0.05(14,30)(表 2), 分裝后的種子粉末在瓶內(nèi)和瓶間均勻性無顯著性差異, 因此判定種子粉末具有良好的均勻性。

圖4 均勻性檢驗(yàn)樣品的測試結(jié)果

表2 均勻性檢測測試數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果

式中,bb為瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差,bb為不確定度,12為組間方差,22為組內(nèi)方差,為組內(nèi)測量次數(shù)。

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

據(jù)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測DNA提取和純化》(農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告-4- 2010)[18]以及試劑盒的操作說明, 通常推薦以100 mg的粉末樣品作為原料提取基因組DNA。本研究中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn), 抽取的子樣也是100 mg, 顯示標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在瓶內(nèi)和瓶間均具有良好的均勻性。因此, 建議本批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的最少取樣量為100 mg。

2.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

將短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)樣品分別存儲(chǔ)在4℃、25℃、37℃、60℃, 分別在第0周、第1周、第2周、第4周后取樣并儲(chǔ)存于?70℃, 每次每個(gè)貯存溫度隨機(jī)選取3瓶, 每瓶重復(fù)取樣3次(= 3,= 3), 取樣后統(tǒng)一檢測。提取DNA后進(jìn)行熒光定量PCR檢測, 梯度稀釋經(jīng)基因型鑒定的純品MIR604基因組DNA, 配置標(biāo)準(zhǔn)品, 進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增, 繪制MIR604轉(zhuǎn)化體特異性序列和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計(jì)算樣品中轉(zhuǎn)化體特異性基因和內(nèi)標(biāo)基因拷貝數(shù), 進(jìn)而計(jì)算其轉(zhuǎn)基因含量(表3)。對數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)顯示, 儲(chǔ)存4周后, 在4℃、25℃、37℃和60℃下粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因含量未發(fā)生顯著變化, 表現(xiàn)出良好的短期穩(wěn)定性。因此, 本批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以在常溫下穩(wěn)定儲(chǔ)存和運(yùn)輸4周, 特性量值不會(huì)發(fā)生顯著變化。

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)拷貝數(shù)比值的短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

表4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)拷貝數(shù)比值長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

2.5 定值

為確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值, 組織9家實(shí)驗(yàn)室利用MIR604/二重?cái)?shù)字PCR進(jìn)行聯(lián)合定值。定值結(jié)果如表5所示。根據(jù) “標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理(JJF1343-2012)”[17], 對各家實(shí)驗(yàn)室返回的數(shù)據(jù)先后進(jìn)行如下檢驗(yàn)。(1)用狄克遜法和格拉布斯法進(jìn)行9家實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可疑值檢驗(yàn), 未在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)發(fā)現(xiàn)可疑數(shù)據(jù); (2)采用達(dá)戈斯提諾法對所有聯(lián)合定值的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn), 測定數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布; (3)用狄克遜法對9組定值數(shù)據(jù)平均值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)組可疑值檢驗(yàn), 判定無界外值; (4)用科克倫法檢驗(yàn)9組數(shù)據(jù)是否等精度, 結(jié)果9組數(shù)據(jù)的方差無顯著差異, 實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)組等精度。由于9家實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布, 且實(shí)驗(yàn)室間等精度, 計(jì)算總平均值和總標(biāo)準(zhǔn)差(表5), 將總平均值0.5027作為轉(zhuǎn)基因和內(nèi)標(biāo)基因比值的標(biāo)準(zhǔn)值, 將總標(biāo)準(zhǔn)差0.001作為聯(lián)合定值引入的不確定度。

表5 轉(zhuǎn)基因MIR604玉米種子粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)轉(zhuǎn)基因和內(nèi)標(biāo)基因比值聯(lián)合定值數(shù)據(jù)

2.6 不確定度評(píng)估

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的合成不確定度由3個(gè)部分組成。第1部分是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過程帶來的A類和B類不確定度的合成不確定度c; 第2部分是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不均勻性所引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度bb; 第3部分是物質(zhì)在有效期內(nèi)的不穩(wěn)定性所引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度s, 包括短期不穩(wěn)定性(ss)和長期不穩(wěn)定性(ls)引入的不確定度[9,17]。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性不確定度和穩(wěn)定性不確定度已在均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性檢驗(yàn)時(shí)分別評(píng)估, 評(píng)估結(jié)果匯總在表6中。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值帶來的A類不確定度是統(tǒng)計(jì)測量數(shù)據(jù)、測量次數(shù)及所要求的置信水平計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)偏差, 統(tǒng)計(jì)分析聯(lián)合定值數(shù)據(jù), 其不確定度為0.001, 相對不確定度為0.002 (表5)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值引入的B類不確定度主要來源于錯(cuò)誤識(shí)別陽性微滴和陰性微滴產(chǎn)生的不確定度和數(shù)字PCR微反應(yīng)體積不一致產(chǎn)生的不確定度[19-20]。在進(jìn)行定值前, 充分優(yōu)化了二重?cái)?shù)字PCR方法, 采用特別設(shè)計(jì)的自動(dòng)識(shí)別軟件, 不產(chǎn)生難以識(shí)別的微滴, 其不確定度忽略不計(jì)。因此B類不確定度主要統(tǒng)計(jì)數(shù)字PCR微滴體積不一致產(chǎn)生的不確定度。本項(xiàng)目采用8通道微滴生成儀(DG8)生成微滴, 斯洛文尼亞的國家生物研究所(the National Institute of Biology, NIB)在實(shí)驗(yàn)室間組織了8通道微滴生成儀生產(chǎn)的微滴體積的聯(lián)合測量, 平均體積0.715 nL, 擴(kuò)展不確定度0.014 nL[21]。本項(xiàng)目選取NIB的測量不確定度作為微滴體積不一致引入的不確定度, 則其相對不確定度:

MIR604/二重?cái)?shù)字PCR微滴體積不一致引入的不確定度合成為:

vr

各不確定度分量見表6, 合成本批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對不確定度為:

擴(kuò)展不確定度為0.06 (= 2, 95%置信度)。本批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值表示為0.50 ± 0.06。

表6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度分量及合成

3 討論

本批轉(zhuǎn)基因玉米MIR604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是以雜合種子為原料制備的純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 與歐盟IRMM研制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比, 制備工藝相對簡單, 省去了陽性粉末和陰性粉末的稱量混勻過程。鑒于純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn), 美國的AOCS長期致力于生產(chǎn)純品粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和純品DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), IRMM在后來生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中也增加了純品類型, 如轉(zhuǎn)基因玉米DP-004114-39 (ERM-BF439)[22]。AOCS生產(chǎn)了13個(gè)純品玉米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 包括2個(gè)非轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和11個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[23]。11個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為以雜合種子為原料生產(chǎn)的純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 其特性值均表述為“Pure, heterozygous”[24]。對于純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 原材料的鑒定環(huán)節(jié)非常關(guān)鍵, 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因含量與原材料的純度和基因型密切相關(guān)。AOCS僅用轉(zhuǎn)化體特異性實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定原材料的身份, 沒有采用單粒法鑒定原材料的純度和基因型, 導(dǎo)致生產(chǎn)的標(biāo)物存在著轉(zhuǎn)基因含量不確定的風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)室采用數(shù)字PCR測定AOCS生產(chǎn)的玉米標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GA21, 0407-B; MIR604, 0607-A2; MIR162, 1208-A; MON88017, 0406-D)的轉(zhuǎn)基因含量, 測量值在34.03%~59.91%之間波動(dòng)[7]。

本項(xiàng)目中制備本批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的原材料通過隨機(jī)抽樣240粒種子, 對單粒種子一一鑒定, 考察原材料的純度和基因型。所有籽粒的檢測結(jié)果均為陽性且均為雜合種子, 根據(jù)泊松分布, 計(jì)算出在95%的置信度下原材料的純度大于98.5%。因?yàn)樵牧系膯瘟CR檢測是一種破壞性檢測, 檢測后不能再用作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的原材料, 因此導(dǎo)致我們不能對所有的原材料一一檢測。為了獲得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的準(zhǔn)確量值, 本研究在原材料鑒定的基礎(chǔ)上, 采用二重微滴數(shù)字PCR方法聯(lián)合定值, 標(biāo)準(zhǔn)值為轉(zhuǎn)基因含量(轉(zhuǎn)基因和內(nèi)標(biāo)基因比值)。數(shù)字PCR是一種不依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的核酸絕對定量方法, 目前已被美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院(National Institute of Standards and Technology, NIST)用于核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值測定, 也被應(yīng)用于歐盟IRMM轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的定值中。如歐盟IRMM研制的白血病診斷質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(ERM-AD263a–ERM-AD263f)和美國發(fā)布的乳腺癌診斷基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(SRM2373)均采用數(shù)字PCR方法定值[25-26]。在聯(lián)合定值前, 本實(shí)驗(yàn)室建立了MIR604/二重?cái)?shù)字PCR方法, 消除了單重PCR中取樣誤差對定值結(jié)果的影響。而且對數(shù)字PCR的引物/探針濃度、退火溫度進(jìn)行了充分優(yōu)化; 考察了數(shù)字PCR的定量極限、檢測極限、動(dòng)力學(xué)范圍和重復(fù)性等參數(shù), 保證定值過程中陽性微滴和陰性微滴的準(zhǔn)確識(shí)別。轉(zhuǎn)基因含量由9家實(shí)驗(yàn)室采用數(shù)字PCR儀通過不依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的數(shù)字PCR方法測量而確定。另外, 熒光定量PCR儀、移液器等設(shè)備在投入使用前都進(jìn)行了校準(zhǔn), 確保定值結(jié)果的準(zhǔn)確、有效和可溯源。研制的本批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有準(zhǔn)確的量值, 全面評(píng)估了其定值不確定度, 克服了AOCS生產(chǎn)的純品粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的缺陷。

4 結(jié)論

本批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值為轉(zhuǎn)基因DNA與總DNA拷貝數(shù)比值, 由9家實(shí)驗(yàn)室采用二重?cái)?shù)字PCR聯(lián)合測定。轉(zhuǎn)基因玉米MIR604粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中轉(zhuǎn)基因DNA與總DNA拷貝數(shù)比值為0.50, 擴(kuò)展不確定度為0.06。通過熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性, 結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性良好, 在4℃和?20℃條件下可以穩(wěn)定保存。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已通過全國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會(huì)組織的國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)委員會(huì)專家的評(píng)審, 獲得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書[編號(hào)GBW(E)100505]。轉(zhuǎn)基因玉米種子粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的成功研制為我們互相開展標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供了技術(shù)基礎(chǔ), MIR604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用將有效地解決我國實(shí)驗(yàn)室間轉(zhuǎn)基因檢測結(jié)果不可比的問題, 為我國的玉米及其加工產(chǎn)品的檢測、監(jiān)測提供技術(shù)保障。

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Development of genetically modified maize MIR604 matrix reference materials

LI Jun1, LI Liang2, LI Xia-Ying3, SONG Gui-Wen3, SHEN Ping3, ZHANG Li1, ZHAI Shan-Shan1, LIU Fang-Fang2, WU Gang1, ZHANG Xiu-Jie3,*, and WU Yu-Hua1,*

1Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, Hubei, China;2Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3Development Center of Science and Technology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100025, China

The safety supervision of genetically modified organisms (GMO) is the guarantee for the healthy development of the biotechnology, and the reference materials (RM) are the material basis for GMOs detection. The lack of RMs makes it difficult to ensure the accuracy, reliability and comparability of the test data. GM maize MIR604 is approved for import as a raw material in China. The safety supervision of GM maize MIR604 urgently requires to prepare RMs. The pure GM maize MIR604 matrix RMs were prepared through the steps of raw material identification, grinding, sieving and water content determination. The results of homogeneity test and stability test showed that the RMs in this batch had good homogeneity within the bottle and between the bottles, the property value of the RMs was stable, allowing them to be transported at room temperature for one month, as even for six months verified by the long-term stability test. The copy number ratio of the transgenic DNA to the total DNA was collaboratively characterized by nine laboratories using the duplex digital PCR of MIR604/. The certified value was 0.50. The various uncertainty components of the RM characterization results were fully evaluated, and the expanded uncertainty was combined to be 0.06 (copy/copy). The specification of RMs of this batch is 1 g bottle–1and the minimum sample size is 100 mg. This batch of RMs can be used in the fields of safety supervision and labelling of MIR604, and laboratory quality control.

GM maize MIR604; matrix reference material; digital PCR; Real-time PCR; collaborative characterization

2019-08-28;

2019-12-26;

2020-01-15.

10.3724/SP.J.1006.2020.93047

張秀杰, E-mail: zhxj7410@sina.com, Tel: 010-59198153; 武玉花, E-mail: wuyuhua@oilcrops.cn, Tel: 027-86711573

E-mail: lijuner@163.com, Tel:027-86711573

本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2016ZX08012003)和國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31601581)資助。

This study was supported bythe National Major Project for Developing New GM Crops (2016ZX08012003) and the National Natural Science Foundation of China (31601581).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200115.1122.014.html