宋宇康 ，邢志偉 ，周國(guó)平 ，張平 ，張李陽(yáng)

（南京曉莊學(xué)院，江蘇 南京 211171；2.南京龍?chǎng)a水產(chǎn)開發(fā)有限公司，江蘇 南京 211500；3.南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，江蘇 南京 210036）

龍池鯽魚因產(chǎn)于江蘇省南京市六合區(qū)城南龍池而得名，其味道鮮美，出肉率高，深受當(dāng)?shù)厥忻袂嗖A。近年來，龍池鯽魚混雜嚴(yán)重，加之過度捕撈，尋常百姓已難覓其蹤跡。該試驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry,FCM）來測(cè)定龍池中鯽魚的DNA含量來分析其倍性特征，使原有龍池中混雜的龍池鯽魚純化出來，并開展龍池鯽魚親本培育、苗種繁育以及成魚養(yǎng)殖，使龍池鯽魚實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化推廣并且加強(qiáng)其資源增殖，也為以后對(duì)龍池鯽魚的研究提供參考。

流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是利用熒光染料、激光技術(shù)、單抗技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)定量測(cè)定細(xì)胞DNA含量、細(xì)胞體積、蛋白質(zhì)含量、酶活性等許多重要參數(shù)，是一種準(zhǔn)確鑒定魚類倍性的理想方法。同時(shí)，該試驗(yàn)采取的T型標(biāo)技術(shù)為體內(nèi)標(biāo)記法，為最早使用的方法之一，此法簡(jiǎn)便又快，適用于各種魚類。加之對(duì)側(cè)線鱗數(shù)量的辨別也可作為區(qū)分二倍及三倍體魚的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚

試驗(yàn)用魚于2017年11月—2018年1月，從六合龍池閘段采捕1 000尾鯽魚，暫養(yǎng)于南京龍?chǎng)a水產(chǎn)開發(fā)有限公司養(yǎng)殖基地，暫養(yǎng)池為50 m×300 m，水深1.5 m。試驗(yàn)前拉網(wǎng)放置于2 m×2 m×2 m的網(wǎng)箱內(nèi)待測(cè)。雞紅細(xì)胞為國(guó)際上的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，其DNA含量按2.50 pg/N來計(jì)算。

1.2 T型標(biāo)標(biāo)記法

T型標(biāo)記標(biāo)記是用物理的方法，將帶有數(shù)字、文字、字母等信息的標(biāo)簽注入到動(dòng)物體表，肉眼可辨，方便識(shí)別，能在短時(shí)間內(nèi)標(biāo)記大量的個(gè)體動(dòng)物，廣泛應(yīng)用于魚類、甲殼類和貝類物種。該試驗(yàn)首先將其側(cè)線鱗進(jìn)行計(jì)數(shù)。在標(biāo)記時(shí)，先用75%酒精將槍頭消毒后再使用。標(biāo)記時(shí)應(yīng)選擇被標(biāo)記魚背鰭基部下方背部肌肉最厚的部位，所使用的槍頭不能穿透魚體，用手指輕按壓被標(biāo)記的部位迅速抽出標(biāo)記槍，標(biāo)記結(jié)束后務(wù)必對(duì)所標(biāo)記部位用酒精消毒，為避免傷口感染以及疾病的傳播。

1.3 樣品的制備

完成掛牌標(biāo)志后，將1 mL一次性注射器先用75%的酒精將針頭消毒，從龍池鯽魚的尾靜脈取血0.3～0.5 mL，注射在5 mL的紫色抗凝管中防止魚血凝固，然后再注入4 mL離心管中在1 000 r/min離心3 min，去除上清液。將處理好的魚血放在4℃冰盒保存送至實(shí)驗(yàn)室待測(cè)。雞血取自于翅膀靜脈，處理方法同上。

1.4 樣品染色

該試驗(yàn)測(cè)定DNA所用的試劑為瑞景特生物有限公司的PI試劑盒，該試劑分為A液和B液兩種對(duì)DNA進(jìn)行染色測(cè)定。首先將固定的紅細(xì)胞混勻，在4℃、1 200 r/min下用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，加入預(yù)冷的70%乙醇，于4℃固定30 min，再用300 g離心5分鐘收集細(xì)胞，去除上清液，再重懸于400μL PBS中。最后制備PI綜合液，取500μL A液和2μL B液混合均勻，在每份細(xì)胞懸液中加入100μL PI綜合液，避光孵育30分鐘。然后再用300目尼龍網(wǎng)過濾后，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 DNA含量測(cè)定

采用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特的FC500流式細(xì)胞儀，激發(fā)光源為20 mW氬離子激光器，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，分別進(jìn)行單參數(shù)檢測(cè)。使用機(jī)器前需要用標(biāo)準(zhǔn)微球調(diào)整儀器，要求CV＜5%，檢測(cè)前先做貝克曼公司質(zhì)控，質(zhì)控不合格則不可以檢測(cè)。以雞血細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)樣品采集的細(xì)胞總數(shù)為104個(gè)。使用CXP軟件收集數(shù)據(jù)（每秒收集100～300個(gè)細(xì)胞），Modfit2.0軟件進(jìn)行DNA細(xì)胞周期及倍性分析。

1.6 數(shù)據(jù)和圖形分析

測(cè)量的數(shù)據(jù)和圖均為計(jì)算機(jī)軟件分析所得，然后將對(duì)照樣品和待測(cè)樣品的處理資料按照統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析。

樣品魚的DNA絕對(duì)含量按下列公式計(jì)算：

式中：P1為檢測(cè)魚紅細(xì)胞的DNA絕對(duì)含量（pg/N），P2為標(biāo)準(zhǔn)雞紅細(xì)胞DNA絕對(duì)含量（2.5 pg/N）；E1為雞紅細(xì)胞的相對(duì)DNA含量，E2為檢測(cè)魚紅細(xì)胞的相對(duì)DNA含量。

2 結(jié)果

2.1 龍池鯽魚紅細(xì)胞DNA檢測(cè)直方圖

該試驗(yàn)采用雞血紅細(xì)胞做為參考標(biāo)準(zhǔn)，用流式細(xì)胞儀測(cè)定了1 000尾龍池鯽魚紅細(xì)胞的相對(duì)DNA含量。圖1為雞血紅細(xì)胞，圖2為雌性龍池鯽二倍體的流式細(xì)胞儀檢測(cè)直方圖的代表性結(jié)果，圖3為雄性龍池鯽二倍體的流式細(xì)胞儀檢測(cè)直方圖的代表性結(jié)果。

圖1 雞血的流式細(xì)胞儀檢測(cè)直方圖

直方圖中縱坐標(biāo)表示檢測(cè)的細(xì)胞核數(shù)，橫坐標(biāo)表示樣品細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值，即樣品細(xì)胞的DNA相對(duì)含量。圖1中主要出現(xiàn)一個(gè)峰為G0/G1期峰，其圖像清洗干凈，前后無雜峰出現(xiàn)，說明其DNA的相對(duì)含量最低，細(xì)胞頻率最高，是細(xì)胞周期中的G0/G1期細(xì)胞；其峰形尖銳，CV＜5%，說明對(duì)樣品處理和檢測(cè)方法較好，其峰值代表DNA含量相同的G0/G1期細(xì)胞。從圖1可以看出雞紅細(xì)胞的相對(duì)DNA含量接近190，從圖2和3中可以看出二倍體龍池鯽魚的DNA相對(duì)含量接近290。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的1 000尾龍池鯽魚中，120尾龍池鯽樣品的紅細(xì)胞核相對(duì)DNA含量接近290，占12%；880尾鯽魚接近330（為三倍體魚），占群體總數(shù)88%。

圖2 龍池鯽二倍體的流式細(xì)胞儀檢測(cè)直方圖（雌魚）

2.2 龍池鯽魚DNA含量與倍性

圖3 龍池鯽二倍體的流式細(xì)胞儀檢測(cè)直方圖（雄魚）

測(cè)定的龍池鯽魚的相對(duì)DNA含量和雞血的相對(duì)DNA含量結(jié)果見表1。從表1中可知，在所測(cè)的1 000尾龍池鯽魚群體當(dāng)中有120尾的DNA含量為3.82 pg/N，有880尾（為三倍體魚）的DNA含量為4.34 pg/N?？梢钥闯觯撛囼?yàn)所采集的魚群是由二倍體龍池鯽魚和三倍體龍池鯽魚組成的。

2.3 龍池鯽的形態(tài)學(xué)特征

該研究隨機(jī)抽取了龍池鯽魚和三倍體鯽魚共1 000條對(duì)其側(cè)線鱗進(jìn)行測(cè)數(shù)，并對(duì)其體質(zhì)量、體厚、體長(zhǎng)及體高用卷尺進(jìn)行測(cè)量，將二倍體龍池鯽魚和三倍體龍池鯽魚進(jìn)行比較分析。由表2可以看出，二倍體龍池鯽魚的側(cè)線鱗數(shù)量平均為28，三倍體鯽魚的側(cè)線鱗數(shù)量平均為30，二倍體龍池鯽魚明顯少于三倍體鯽魚的側(cè)線鱗數(shù)量，可見側(cè)線鱗數(shù)可以作為區(qū)分二倍體龍池鯽魚和三倍體鯽魚的重要指標(biāo)之一。

2.4 龍池鯽魚T型標(biāo)效果

被標(biāo)記過的龍池鯽魚經(jīng)過3周圈養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)其T型標(biāo)標(biāo)記后的成活率和脫牌率。經(jīng)過檢測(cè)后。龍池鯽魚的生理活動(dòng)較往常一樣，成活率100%，1 000尾龍池鯽魚脫標(biāo)12尾，脫標(biāo)率為1.2%。

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)龍池鯽魚的DNA含量

表2 二倍體與三倍體龍池鯽魚的形態(tài)特征

3 討論

3.1 龍池鯽魚紅細(xì)胞核DNA含量

該研究中三倍體鯽魚的DNA絕對(duì)含量為4.34（pg/N），二倍體龍池鯽魚的DNA絕對(duì)含量為3.82（pg/N）。說明三倍體龍池鯽魚的DNA絕對(duì)含量比二倍體龍池鯽魚要高。

3.2 龍池鯽魚群體的倍性

染色體數(shù)在290左右的核型分析認(rèn)為同源染色體一般是兩兩配對(duì)而成的，是屬于二倍體。

該研究運(yùn)用該方法測(cè)定的龍池鯽魚的DNA含量有290和330兩種數(shù)值。該研究證實(shí)了南京六合龍池的野生龍池鯽魚是由二倍體和三倍體所組成的一個(gè)混合的群體，原因可能是最初有三倍體的混入不斷的雜交繁殖所形成的，也可能是人工養(yǎng)殖的鯽魚混入，所造成的。

3.3 龍池鯽魚研究的意義

通過龍池位于南京市六合區(qū)西部，水質(zhì)肥沃，礦物質(zhì)豐富，浮游生物很多，生長(zhǎng)出的鯽魚以頭小、背寬、體厚，肉嫩、味鮮為主要特點(diǎn)。由此可見，所謂的龍池鯽魚就是在龍池的特定生態(tài)環(huán)境中生長(zhǎng)的地域性二倍體的野生鯽魚。流式細(xì)胞儀測(cè)得的DNA含量，將二倍體和三倍體分開，成功的將龍池鯽魚提純,主要目的是對(duì)野生龍池鯽魚的提純復(fù)壯，通過將其二倍體與三倍體分離，從而得到純種的龍池鯽魚，通過繁殖培育擴(kuò)大魚種，推廣龍池鯽魚，讓龍池鯽魚能夠被更多市民所消費(fèi)，也為后期研究龍池鯽魚的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供依據(jù)。