駱慶玲,周永健,唐文娟,首第文,黃紅麗,徐豪明,黃惠康,何 杰,杜艷蕾,阮煥梅,陳慧婷,曹創(chuàng)裕

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)被認(rèn)為是目前世界上最多的慢性肝臟疾病[1-3]。使用肥胖人糞菌移植可促進(jìn)小鼠肥胖[4],腸道微生態(tài)在NAFLD發(fā)病機(jī)制中的作用也得到重視。移植正常人糞菌是否能治療NAFLD患者,或者說(shuō)NAFLD患者糞菌是否為其致病因素,仍未得到證實(shí)【5-7】。本實(shí)驗(yàn)旨在探討使用正常人和NAFLD患者糞便細(xì)菌移植給高脂飲食導(dǎo)致的大鼠,觀察了動(dòng)物肝組織的變化,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物與試劑 雄性SD大鼠32只,購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。甲硝唑、萬(wàn)古霉素、氨芐青霉素、新霉素購(gòu)自合肥博美生物科技有限公司。戊巴比妥鈉購(gòu)于德國(guó)默克公司,福爾馬林溶液購(gòu)于北京雷根生物技術(shù)有限公司,Qiagen DNA Stool Mini Kit試劑盒購(gòu)于Qiagen公司。

1.2 藥物和糞菌準(zhǔn)備 抗生素混合液的制備：用無(wú)菌水配成含有濃度為0.4 g/L的氨芐青霉素,濃度為0.4 g/L的新霉素,濃度為0.4 g/L的甲硝唑和濃度為0.2 g/L的萬(wàn)古霉素水溶液。48 h內(nèi)使用;高脂飼料配方：普通級(jí)飼料82.5%,豬油10.0%,蔗糖5.0%,膽固醇 2.0%,膽鹽 0.3%,丙硫氧嘧啶0.2%。高脂飼料和普通基礎(chǔ)飼料由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心配制;糞便懸濁液的制備：收集3個(gè)健康人(符合糞菌移植供體篩選指標(biāo),且BMI為18～20 kg/㎡)的糞便,存于-80℃冰箱。每次取糞便20 g/人,室溫解凍,以60 g糞便加生理鹽水混勻,制成200 mL混合物,震蕩5 min,經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾,將濾液靜置5 min,吸取上清懸液50 mL,制成健康人糞便混懸液備用。收集3個(gè)NAFLD患者的糞便,存于-80℃冰箱,用同樣方法制作NAFLD患者糞便混懸液備用。所選NAFLD患者均符合2018年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)制定的《非酒精性脂肪性肝病防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 動(dòng)物模型的制備 將32只大鼠隨機(jī)分為4組,分別為對(duì)照組(A組)8只、模型組(B組)8只、NAFLD糞菌移植組(C組)8只和正常人糞菌移植組(D組)8只。第1周時(shí),給予A組正常飲水,在B組、C組和D組給予抗生素混合液替代正常飲用水,抑菌。在第2～6周,給予A組普通飲水和普通飼料喂養(yǎng),給予另三組普通飲水聯(lián)合高脂高糖飼料喂養(yǎng)。同時(shí),每周四和周日,給予B組大鼠生理鹽水3 mL灌胃,給予C組NAFLD患者糞便懸濁液3 mL灌胃,給予D組正常人糞便懸濁液3 mL灌胃。實(shí)驗(yàn)第5 w,各組大鼠禁食不禁水12 h,稱(chēng)質(zhì)量,給予0.5%戊巴比妥1 mL.kg-1腹腔注射麻醉。直視下經(jīng)心臟取血。取肝臟左葉組織,一塊組織用于常規(guī)病理學(xué)檢查,另一塊保存于-80℃冰箱備用。剪取全段結(jié)腸,沿縱軸剪開(kāi),生理鹽水沖洗后放置-80℃中保存。

1.4 大鼠腸道DNA提取與測(cè)序 取-80℃凍存的大鼠腸粘膜,室溫下解凍,約50 mg,使用 Qiagen DNA Tissue Mini Kit提取純化腸粘膜DNA(含腸粘膜內(nèi)菌群DNA),經(jīng)Nano Drop初步檢測(cè),將濃度和純度合格的DNA樣品置于-80℃冰箱保存,用干冰運(yùn)送至北京諾禾致源科技股份有限公司檢驗(yàn)DNA完整性,取合格樣品在Ill umina技術(shù)測(cè)序平臺(tái)行16 sDNA菌群測(cè)序分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝組織病理學(xué)改變的比較 B組為重度脂肪性肝炎改變,大泡性脂肪變,越遠(yuǎn)離中央靜脈,脂肪變?cè)絿?yán)重,可見(jiàn)玻璃樣變,小葉邊界有塊狀的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),可見(jiàn)部分片狀壞死;C組為重度脂肪性肝炎改變,大泡性和小泡性脂肪變,可見(jiàn)玻璃樣變,小葉邊界可見(jiàn)較多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),可見(jiàn)明顯片狀壞死;D組為重度脂肪性肝炎改變,中央靜脈周?chē)锌梢?jiàn)正常肝細(xì)胞和肝竇,小葉邊界可見(jiàn)明顯大泡性脂肪肝變,有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 各組腸粘膜下菌群16sDNA的比較 基于屬水平糞菌群OTUs分析,用脂肪肝患者糞菌處理過(guò)的大鼠腸道厚壁菌門(mén)高于用健康人糞菌處理組,表現(xiàn)在葡萄球菌屬(staphylococcus,P=0.048,Z=2.042)、瘤胃球菌屬(ruminococcus,P=0.028,Z=2.181)、產(chǎn)氣莢膜梭菌屬(clostridium perfringens,P=0.004,Z=2.746)增多;用脂肪肝患者糞菌處理過(guò)的大鼠變形菌門(mén)含量升高,表現(xiàn)在葡萄桿菌屬(gluconobacter)和大腸桿菌屬(Escherichia coli,P=0.016,Z=2.382和P=0.008,Z=2.548)增多;值得注意的是,模型組 clostridium-perfringers較對(duì)照組升高,而經(jīng)過(guò)NAFLD患者糞菌處理組該菌含量明顯升高(P=0.019,Z=2.362),而在正常人糞菌組該菌含量明顯下降(P=0.004,Z=0.746);在NAFLD患者糞菌組Escherichia coli異常降低,與對(duì)照組形成差異(P=0.031,Z=2.362),Rothia-nasimurium明顯高于模型組(P=0.029,Z=2.214,圖1)?；诜N水平糞菌群OTUs分析比較,NAFLD糞菌組變形菌門(mén)含量高于用正常人糞菌移植組,分別表現(xiàn)在脫磷孤菌種(Desulfovibrio,P=0.004,Z=2.717)、(Lautropia,P=0.048,Z=1.970)和某種未知的腸桿菌種(unidentified_Enterobacteriaceae,P=0.008,Z=2.548),其中NAFLD糞菌組Lautropia還較對(duì)照組和模型組升高(P=0.018,Z=2.349和P=0.043,Z=2.077)。NAFLD糞菌組變性菌門(mén)的Massilia較模型組和正常人組明顯升高(P=0.020,Z=2.262和P=0.048,Z=2.042)。模型組變形門(mén)中的Rodentibacter較對(duì)照組升高(P=0.052,Z=2.008),而在用NAFLD糞菌組升高更為明顯(P=0.019,Z=2.342)。NAFLD糞菌組厚壁菌門(mén)中的葡萄球菌種含量也相對(duì)模型組和正常人糞菌組升高(圖2)。事實(shí)上,用人糞菌處理過(guò)的大鼠糞菌群,與未用人糞菌處理的大鼠存在明顯的差異。在加入門(mén)水平物種組成的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)圖(圖3)中,用脂肪肝患者糞菌處理后的大鼠腸道菌群與健康人糞菌處理者差異性最大,而從未經(jīng)過(guò)人糞菌處理的大鼠之間腸道菌群差異性最小,用正常人糞菌處理的大鼠腸道菌群種類(lèi)與對(duì)照組最為接近,而用NAFLD患者糞菌處理組與模型組最為接近。

圖1 各組大鼠腸粘膜16sDNA測(cè)序分析 屬水平的OTUs比較

圖2 各組大鼠腸粘膜16sDNA測(cè)序分析 種水平的OTUs比較

圖3 門(mén)水平物種組成的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)使用飼料應(yīng)用了丙硫氧嘧啶,對(duì)加重肝細(xì)胞損壞,加速脂肪在肝細(xì)胞堆積起了作用[7-11],可能不是單純的糞菌移植能夠逆轉(zhuǎn)的,這也與NAFLD患者常見(jiàn)的慢性發(fā)病情況不符。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們推測(cè)如果減少丙硫氧嘧啶的用量,可能會(huì)導(dǎo)致脂肪肝造模時(shí)間延長(zhǎng),更符合普通人群NFALD的發(fā)病過(guò)程,也更能看到人類(lèi)糞菌移植對(duì)大鼠肝臟病變的影響。

在實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)程中,NAFLD糞菌移植組和正常人糞菌移植組與模型組動(dòng)物的進(jìn)食量無(wú)明顯差異,可考慮適當(dāng)增加進(jìn)食次數(shù)或者增加糞菌移植的次數(shù),可能能更好地改善肝臟脂肪病變程度。臨床上,采用的消化道噴灑、內(nèi)窺鏡下置管和口服菌群膠囊等方法,因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物體型較小,難以實(shí)行。故本實(shí)驗(yàn)采用灌胃方式,但胃酸可能會(huì)破壞一些菌群,而減少了菌群的作用。如果能進(jìn)一步改進(jìn)針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的糞菌移植方法,將更能看到糞菌移植對(duì)NAFLD大鼠的影響。

本實(shí)驗(yàn)將腸粘膜DNA用于分析大鼠菌群的變化,與用大鼠糞便DNA檢測(cè)比,能更好地體現(xiàn)大鼠腸道內(nèi)定植菌群情況[16]。在本實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)比較腸道不同界門(mén)綱目科種屬菌群情況,獲得對(duì)NAFLD發(fā)病和治療有意義的糞菌仍然很少。模型組腸道Rodentibacter種數(shù)升高,在移植NAFLD患者糞菌后該菌種樹(shù)升高更顯著,而在移植正常人糞菌后則大幅減少,說(shuō)明Rodentibacter可能是促進(jìn)NAFLD發(fā)生和發(fā)展的糞菌種。早先,已在小鼠認(rèn)識(shí)到Rodentibacter的作用,可以通過(guò)影響Th1和Th2細(xì)胞的免疫功能,進(jìn)而加重呼吸系統(tǒng)的炎癥反應(yīng),加重疾病對(duì)機(jī)體的損害甚至增加了病死率[17],且身體疾病也會(huì)進(jìn)一步增加Rodentibacter機(jī)會(huì)性感染的概率。NAFLD患者和NAFLD大鼠腸道Rodentibacter數(shù)量增加可能加重了肝臟病變,也可能是NAFLD發(fā)生增加了腸道Rodentibacter數(shù)量。Rodentibacter是否通過(guò)分泌相關(guān)毒素或者通過(guò)菌群移位的方式對(duì)肝臟造成影響,仍需要通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

雖然在基因水平上,SD大鼠已被證實(shí)與人類(lèi)腸道菌群有2.47%配對(duì)重疊率,高于小鼠1.19%[18]。但事實(shí)上,大鼠和人類(lèi)腸道菌群仍存在著比較大的差異。所以,用人類(lèi)的糞便菌移植給大鼠,其對(duì)肝臟疾病造成的影響是否能代表人類(lèi)肝臟疾病發(fā)展過(guò)程中菌群的作用,目前仍存在爭(zhēng)議[19]。就像此次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的情況,用人類(lèi)糞菌干預(yù)大鼠,大鼠腸道內(nèi)的定植菌出現(xiàn)的差異性明顯增大,出現(xiàn)了無(wú)論是用正常人還是用NAFLD患者的糞菌干預(yù),均出現(xiàn)了某些菌群升高或降低的現(xiàn)象。但因在人體觀察肝臟病理學(xué)變化仍然比較困難,肝臟穿刺是目前檢測(cè)人類(lèi)肝臟脂肪變性和纖維化的金標(biāo)準(zhǔn),在臨床實(shí)施過(guò)程中存在困難。所以,有關(guān)就腸道菌群相關(guān)的研究,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依然是不可或缺的方法。

本研究再次證明腸道菌群的變化與NAFLD的發(fā)展有著明顯的相關(guān)。我們還探討了不同人群腸道菌群對(duì)NAFLD進(jìn)展的促進(jìn)或妨礙作用,得出了初步結(jié)論,我們認(rèn)為NAFLD患者糞菌群可能是肝臟脂肪變性的一個(gè)危險(xiǎn)因素,而應(yīng)用健康人的糞便細(xì)菌干預(yù)可以改善高脂飲食大鼠肝脂肪變情況,降低血脂含量,減少肝臟內(nèi)脂肪含量,減輕肝臟負(fù)擔(dān)和損傷。這個(gè)結(jié)果對(duì)臨床在用糞菌移植治療脂肪肝的構(gòu)想具有指導(dǎo)意義,提示用健康人糞菌群替代NAFLD糞菌群移植可以治療NAFLD患者。當(dāng)然,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠腸道內(nèi)定植菌群對(duì)疾病有顯著影響者極少,而Rodentibacter可能是促進(jìn)NAFLD發(fā)生和發(fā)展的糞菌種,我們未能發(fā)現(xiàn)能夠逆轉(zhuǎn) NAFLD的有意義的菌群。