曹 正 ，董 瑩，趙晟隆，王 晶，張春紅，陳 陸，劉京瑞，沈 敏，翟燕紅，劉曉巍

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100026；2.美康生物參考實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315104；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)部，北京 100026）

子癇前期是妊娠2 0 周后以高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕R床特征的妊娠期疾病，發(fā)病率為3%～5%，每年在全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致超過(guò)500 000例胎兒或新生兒以及70 000例孕產(chǎn)婦死亡[1-2]。子癇前期的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，胎盤(pán)缺血、子宮螺旋動(dòng)脈重鑄不足、可溶性FMS樣酪氨酸激酶-1（soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFlt-1）和可溶性內(nèi)皮素（soluble endoglin，sEng）釋放入血導(dǎo)致高血壓和蛋白尿的發(fā)生發(fā)展、氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、蛋白多糖和透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)改變介導(dǎo)母胎界面功能障礙以及全身炎癥反應(yīng)如胎盤(pán)、腎臟、白細(xì)胞過(guò)表達(dá)Toll樣受體4導(dǎo)致炎癥因子釋放和胎盤(pán)、腎臟功能障礙等機(jī)制可能與子癇前期的發(fā)生有關(guān)[1，3]。子癇前期唯一有效的治療方法是終止妊娠。低分子肝素、小劑量阿司匹林、維生素D及鈣補(bǔ)充對(duì)子癇前期的預(yù)防有一定的價(jià)值[4-6]。目前常用的一些實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目，如sFlt-1、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（placental growth factor，PLGF）、可溶性內(nèi)皮素、多普勒超聲等預(yù)測(cè)子癇前期的價(jià)值較低。有研究結(jié)果顯示，盡管sFlt-1/PLGF比值對(duì)子癇前期的陽(yáng)性預(yù)測(cè)率較低，但具有較高的陰性排除價(jià)值[7]。尋找準(zhǔn)確而可靠的預(yù)測(cè)子癇前期的生物標(biāo)志物已成為一個(gè)臨床亟待解決的問(wèn)題。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)后被提出的新興的組學(xué)技術(shù)。作為一種高通量的、基于小分子代謝物的組學(xué)技術(shù)，代謝組學(xué)已被廣泛用于疾病標(biāo)志物的研究。代謝產(chǎn)物處于DNA、信使RNA和蛋白質(zhì)的下游，主要包括核苷酸、醛類、酮類、脂肪酸、氨基酸等。由于代謝組學(xué)研究是對(duì)實(shí)際發(fā)生或發(fā)生過(guò)程的整體代謝狀態(tài)的反映，因此相較于蛋白組學(xué)、基因組學(xué)，代謝組學(xué)更有利于解釋疾病表型和相關(guān)臨床表現(xiàn)的原因，闡明疾病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。目前，基于代謝組學(xué)的、針對(duì)子癇前期預(yù)測(cè)標(biāo)志物的研究通常為回顧性研究。有研究結(jié)果顯示，子癇前期患者血清?；鈮A水平明顯升高，肉堿是將脂質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸至線粒體進(jìn)行能量代謝的載體，其水平升高可能是為了適應(yīng)大量脂質(zhì)的氧化代謝，提示子癇前期與脂質(zhì)代謝紊亂存在密切聯(lián)系[8-9]。本研究擬應(yīng)用非靶向脂質(zhì)組學(xué)尋找能早期預(yù)測(cè)子癇前期的生物標(biāo)志物，并通過(guò)通路分析和富集分析，闡述與子癇前期發(fā)病相關(guān)的代謝通路。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年8月—2018年2月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院門(mén)診的子癇前期高危孕婦66例，年齡25～45歲。排除已診斷為子癇前期或HELLP綜合征的患者以及在過(guò)去3個(gè)月中接受過(guò)子癇治療的患者。子癇前期定義為妊娠20周后新發(fā)的收縮壓≥18.62 kPa（140 mmHg）或舒張壓≥11.97 kPa（90 mmHg）（間隔4 h測(cè)量），合并出現(xiàn)蛋白尿、24 h尿蛋白定量＞300 mg或中段尿尿蛋白定性達(dá)“++”[10]。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有對(duì)象均知情同意。

1.2 子癇前期高危人群的判斷標(biāo)準(zhǔn)[7]

年齡≥18歲，單胎妊娠，孕周為20～36周，且滿足以下條件之一：（1）平靜時(shí)測(cè)量血壓，收縮壓＞15.96 kPa（120 mmHg）或舒張壓＞10.64 kPa（80 mmHg）；（2）尿蛋白陽(yáng)性；（3）上腹部不適；（4）水腫；（5）子宮動(dòng)脈切跡；（6）胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限；（7）體質(zhì)量增加＞1 kg/周；（8）頭痛；（9）視力障礙；（10）血小板降低；（11）丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高。

1.3 試劑和儀器

異丙醇（質(zhì)譜級(jí)）、乙腈（質(zhì)譜級(jí)）、甲酸氨（質(zhì)譜級(jí)）和甲酸（質(zhì)譜級(jí)）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；Waters 2777C UPLC儀，Water Xevo G2-XS QTOF質(zhì)譜儀及ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱均購(gòu)自美國(guó)Waters公司。

1.4 樣本采集和預(yù)處理

采用含惰性分離膠的促凝管采集所有對(duì)象肘靜脈血3 mL，離心分離血清，-80 ℃保存，統(tǒng)一檢測(cè)。對(duì)所有對(duì)象進(jìn)行隨訪，直至分娩，記錄是否發(fā)生子癇前期。根據(jù)后期是否發(fā)生子癇前期將前瞻性隊(duì)列分為子癇前期組和無(wú)子癇前期組（對(duì)照組）。由于代謝產(chǎn)物的個(gè)體差異較大，因此選取33例子癇前期患者[年齡（30.45±5.39）歲，采血孕周為（34.28±4.83）周]和33例無(wú)子癇前期孕婦[年齡（31.53±4.30）歲，采血孕周為（34.28±4.83）周]進(jìn)行檢測(cè)，2個(gè)組之間年齡和采血孕周差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。檢測(cè)前將血清樣本置于室溫下充分融解，取40 μL血清，加入120 μL冷異丙醇，震蕩混勻1 min，室溫下靜置10 min，于4 ℃2 000×g離心40 min，吸取25 μL上清液加入225 μL脂質(zhì)復(fù)溶液（異丙醇∶乙腈∶水=2∶1∶1），制備成待測(cè)樣本。從66份待測(cè)樣本中各取20 μL，充分混勻，制成1份質(zhì)控樣本。從66例待測(cè)樣本和1份質(zhì)控樣本中各取60 μL，分別加入96孔板后上機(jī)檢測(cè)。

1.5 樣本檢測(cè)

采用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）-飛行時(shí)間質(zhì)譜（time-of-flight，TOF）聯(lián)用技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行色譜分離和質(zhì)譜分析。

色譜條件：上樣體積為10 μL，色譜柱柱溫為55 ℃，流速為0.4 mL/min。流動(dòng)相A為乙腈（acetonitrile，ACN）∶水=60∶40，含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨（即在1 L流動(dòng)相A中吸去1 mL，加入1 mL純甲酸，充分混勻后再加入0.63 g甲酸銨固體至完全溶解）。流動(dòng)相B為異丙醇（iso-propyl alcohol，IPA）∶ACN=90∶10，含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨（即在1 L流動(dòng)相B中吸去1 mL，加入1 mL純甲酸，充分混勻后再加入0.63 g甲酸銨固體至完全溶解）。梯度洗脫（0～2 min，40%～43%流動(dòng)相B；2.1～7.0 min，50%～54%流動(dòng)相B；7.1～13.0 min，70%～99%流動(dòng)相B；13.1～15.0 min，40%流動(dòng)相B。

質(zhì)譜條件：分別采用正、負(fù)離子模式采集從色譜柱上洗脫下來(lái)的小分子。正離子模式下，毛細(xì)管電壓和錐孔電壓分別為3.0 kV和40.0 V；負(fù)離子模式下，毛細(xì)管電壓及錐孔電壓分別為2.0 kV和40.0 V。采用全信息串聯(lián)質(zhì)譜模式進(jìn)行centroid數(shù)據(jù)采集，正離子一級(jí)掃描范圍為100～2 000，負(fù)離子為50～2 000，掃描時(shí)間為0.2 s，對(duì)所有母離子按19～45 eV的能量進(jìn)行碎裂，采集所有碎片的信息，掃描時(shí)間為0.2 s。

每隔10份樣本檢測(cè)1次質(zhì)控樣本，用于評(píng)估樣本檢測(cè)過(guò)程中儀器狀態(tài)的穩(wěn)定性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將原始檢測(cè)數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Progenesis QI 2.2軟件（美國(guó)Waters公司）進(jìn)行峰對(duì)齊、峰提取和歸一化。對(duì)峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換。采用SIMCA-P13.0軟件（瑞典Umetrics公司）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pareto scaling縮放調(diào)整，隨后進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least square discriminant analysis，PLS-DA）。根據(jù)PLS-DA模型中的變量投影重要性值（variable importance in projection，VIP）對(duì)各代謝物變量進(jìn)行初篩，VIP≥1表示相應(yīng)的代謝物變量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間比較采用差異倍數(shù)和非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將同時(shí)滿足VIP≥1、P＜0.05和差異倍數(shù)≥1.2或≤0.833 3的代謝物作為潛在的生物標(biāo)志物，基于華大實(shí)驗(yàn)室自建數(shù)據(jù)庫(kù)和人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.hmdb.ca）對(duì)篩選出的生物標(biāo)志物進(jìn)行定性分析。采用SPSS 21.0軟件對(duì)VIP排名前5位的生物標(biāo)志物進(jìn)行受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析，評(píng)價(jià)代謝物對(duì)子癇前期的診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 生物標(biāo)志物的篩選

對(duì)子癇前期組和對(duì)照組的非靶向脂質(zhì)代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在負(fù)離子模式下，PCA圖無(wú)法區(qū)分子癇前期組與對(duì)照組；在正離子模式下，PCA圖顯示子癇前期組與對(duì)照組有一定的差異，但差異不明顯，見(jiàn)圖1。PCA圖中質(zhì)控點(diǎn)高度聚集，說(shuō)明整個(gè)分析過(guò)程處于穩(wěn)定狀態(tài)。

圖1 子癇前期組、對(duì)照組和質(zhì)控樣本血清非靶向脂質(zhì)組學(xué)PCA圖

無(wú)論在正離子模式還是負(fù)離子模式下，PLS-DA圖均能明顯區(qū)分子癇前期組和對(duì)照組，見(jiàn)圖2。根據(jù)篩選條件（同時(shí)滿足VIP≥1、P＜0.05和差異倍數(shù)≥1.2或≤0.833 3），正離子模式下篩選出差異性母離子273種，負(fù)離子模式下篩選出135種。根據(jù)保留時(shí)間和二級(jí)離子碎片信息，在正離子模式下篩選出生物標(biāo)志物139種，負(fù)離子模式下篩選出32種。通過(guò)代謝通路篩選確定其中42種生物標(biāo)志物。見(jiàn)表1。

圖2 子癇前期組和對(duì)照組血清非靶向脂質(zhì)組學(xué)PLS-DA圖和置換檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 生物標(biāo)志物的通路分析和富集

42種代謝物的通路分析和富集分析結(jié)果顯示，含2種以上生物標(biāo)志物的代謝通路分別為鞘脂類代謝途徑、甘油磷脂代謝途徑和初級(jí)膽汁酸生物合成途徑。見(jiàn)表2。

對(duì)通路的富集分析結(jié)果顯示，這42種生物標(biāo)志物主要參與α-亞麻酸和亞麻酸代謝、縮醛磷脂合成、長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的線粒體β氧化、鞘脂代謝及膽汁酸生物合成。見(jiàn)圖3。

表1 子癇前期組和對(duì)照組基于非靶向脂質(zhì)代謝組學(xué)的42種生物標(biāo)志物

表2 子癇前期組和對(duì)照組生物標(biāo)志物代謝通路分析

2.3 VIP值前5的生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)子癇前期發(fā)病能力比較

VIP值居前5位的生物標(biāo)志物分別為甘氨膽酸、二十二碳五烯酸、CE[22：4（7Z，10Z，13Z，16Z）]、DG[18：0/20：1（11Z）/0：0]和PI[16：1（9Z）/16：0]。與對(duì)照組比較，子癇前期組中甘氨膽酸、二十二碳五烯酸、PI[16：1（9Z）/16：0]水平升高，CE[22：4（7Z，10Z，13Z，16Z）]和DG[18：0/20：1（11Z）/0：0]水平降低。見(jiàn)圖4。

ROC曲線分析結(jié)果顯示，CE[22：4（7Z，10Z，13Z，16Z）]、DG[18：0/20：1（11Z）/0：0]、二十二碳五烯酸、PI[16：1（9Z）/16：0]及甘氨膽酸的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.723、0.715、0.678、0.669和0.660。見(jiàn)圖5、表3。

圖3 子癇前期組和對(duì)照組42種生物標(biāo)志物通路富集分析結(jié)果

圖4 子癇前期組和對(duì)照組中VIP居前5位的生物標(biāo)志物的相對(duì)峰面積

圖5 5種生物標(biāo)志物診斷子癇前期的ROC曲線

表3 5種生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)子癇前期發(fā)病的效能

3 討論

目前，代謝組學(xué)研究分為2種：代謝物靶標(biāo)分析和代謝物輪廓分析（也稱非靶向代謝組學(xué)），前者是對(duì)一種或幾種目標(biāo)代謝物進(jìn)行著重分析，后者是對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行盡可能多的小分子代謝物檢測(cè)。當(dāng)機(jī)體受毒性物質(zhì)、代謝障礙或生理因素影響時(shí)，細(xì)胞、組織，甚至整體水平會(huì)發(fā)生代謝的變化應(yīng)答，導(dǎo)致生物體液中的代謝物種類和濃度發(fā)生變化。非靶向代謝組學(xué)是基于生物體整體代謝狀態(tài)的分析方法。本研究采用非靶向脂質(zhì)組學(xué)對(duì)脂類進(jìn)行研究，結(jié)果顯示脂類和類脂代謝改變能區(qū)分子癇前期患者和對(duì)照者。通過(guò)VIP、P值及差異倍數(shù)篩選并定性的42種生物標(biāo)志物中，VIP居前5位的代謝物中有4種代謝物分別參與了初級(jí)膽汁酸生物合成通路、甘油磷脂代謝通路和鞘脂代謝通路，這4種代謝物分別為甘氨膽酸、磷脂酰乙醇胺（20：2/22：0）、磷脂酰膽堿（18：1/18：3）、鞘磷脂（18/18）。甘氨膽酸屬于結(jié)合型膽汁酸，由游離型膽酸的24位羧基與甘氨酸結(jié)合生成。子癇前期組甘氨膽酸水平明顯升高，差異倍數(shù)高達(dá)2.74，VIP高達(dá)3.208。膽汁中所含的膽汁酸以結(jié)合型為主，含量最豐富的甘氨膽酸和牛磺膽酸的比例是3∶1。LUNZER等[11]在1986年就發(fā)現(xiàn)孕15～40周的孕婦血清甘氨膽酸水平明顯升高，但每次檢測(cè)結(jié)果的中位數(shù)均在參考區(qū)間（0～1.5 μmol/L）內(nèi)。BRITES等[12]的研究結(jié)果顯示，甘氨膽酸＞2.0 μmol/L對(duì)妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積具有早期診斷價(jià)值。目前尚未發(fā)現(xiàn)有甘氨膽酸與子癇前期或高血壓疾病的相關(guān)報(bào)道。1999年，WU等[13]為了研究膽汁酸在調(diào)節(jié)人和大鼠血壓中所起的作用，對(duì)人和大鼠進(jìn)行了膽汁酸的檢測(cè)，結(jié)果顯示高血壓組血漿總膽汁酸水平明顯高于正常組，且在大鼠模型中，膽汁酸能誘發(fā)高血壓。磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿是細(xì)胞膜磷脂的重要組成部分。BAHADOSINGH等[2]和CHEN等[14]的研究結(jié)果顯示，子癇前期患者血清中有1種磷脂酰膽堿水平明顯高于健康對(duì)照者。而AUSTDAL等[15]的研究結(jié)果顯示，子癇前期患者和妊娠高血壓患者的血清磷脂酰膽堿水平明顯下降。本研究結(jié)果與AUSTDAL等[15]的研究結(jié)果一致。磷脂酰膽堿水平降低提示膽堿代謝發(fā)生改變。膽堿與減弱免疫炎癥和抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。有研究結(jié)果顯示，孕晚期母體攝入較高水平的膽堿可以降低胎盤(pán)和血液循環(huán)中抗血管生成因子FMS樣酪氨酸激酶-1的水平[16-17]。

脂肪酸是脂肪、膽固醇酯和磷脂的重要組成成分。本研究篩選出的42種生物標(biāo)志物中有8種代謝物能提供亞油酸〔18：2（9Z，12Z）〕、亞麻酸〔18：3（9Z，12Z，15Z）〕和花生四烯酸〔20：4（5Z，8Z，11Z，14Z）〕殘基側(cè)鏈，其中6種屬于DG、1種屬于磷膽酰膽堿、1種屬于三酰甘油。JAIN等[18]對(duì)子癇前期患者和正常妊娠婦女的胎盤(pán)進(jìn)行代謝組學(xué)研究，結(jié)果顯示脂肪酸含量升高，升高的脂肪酸以花生四烯酸為主。花生四烯酸是生成前列腺素、血栓烷及白三烯的前體，而亞油酸和亞麻酸可在人體合成花生四烯酸。2018年，DAS等[19]發(fā)現(xiàn)花生四烯酸及其代謝物脂氧素A4（lipoxin A4，LXA4）和氧化四烯酸（epoxyeicosatrienoic acid，EET）通過(guò)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞功能和增殖、電壓門(mén)控離子通道、細(xì)胞膜流動(dòng)性和細(xì)胞膜受體、G蛋白偶聯(lián)受體等參與血壓的調(diào)節(jié)和糖尿病的發(fā)生、發(fā)展?；ㄉ南┧嵬ㄟ^(guò)細(xì)胞色素P450環(huán)氧化物酶產(chǎn)生環(huán)氧基，轉(zhuǎn)化為5，6-EET、8，9-EET、11，12-EET和14，15-EET。有研究結(jié)果顯示，子癇前期患者的胎盤(pán)中EET水平明顯升高，提示α-亞麻酸與亞麻酸代謝通路與子癇前期的發(fā)病有關(guān)[20]。還有研究結(jié)果顯示，子癇前期患者的胎盤(pán)中細(xì)胞色素亞家族2J2上調(diào)，其代謝產(chǎn)物5，6-EET、14，15-EET及其相應(yīng)的雙羥基二十碳四烯酸水平升高[21]。EET可影響胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵子宮螺旋動(dòng)脈，導(dǎo)致螺旋小動(dòng)脈重鑄不足，使胎盤(pán)血流減少，最終導(dǎo)致胎盤(pán)缺血缺氧。此外，子癇前期患者血液中升高的5，6-EET可轉(zhuǎn)換成血栓烷類物質(zhì)，血栓烷類物質(zhì)可引起血小板聚集，促進(jìn)血管收縮。因此，花生四烯酸及其代謝物在子癇前期中的具體作用值得進(jìn)一步研究。線粒體β氧化是脂肪酸分解的核心過(guò)程，子癇前期患者脂肪動(dòng)員增加，因此脂質(zhì)代謝異常與子癇前期有密切聯(lián)系。

綜上所述，本研究通過(guò)非靶向脂質(zhì)組學(xué)方法，確定了子癇前期患者與非子癇前期孕婦代謝物的差異和可能的代謝通路差異。由于入組孕婦例數(shù)有限，且為半定量結(jié)果，因此還需要進(jìn)一步進(jìn)行大規(guī)模驗(yàn)證，才能為臨床預(yù)測(cè)子癇前期提供準(zhǔn)確、新型的代謝生物標(biāo)志物。