許澤君,孫芳,景霞
嗎替麥考酚酯在1995 年被美國食品和藥品管理局批準應(yīng)用于腎臟和心臟移植,并取得了良好的效果[1]。后來作為新型免疫抑制劑在臨床應(yīng)用廣泛[2]。由于它的腎毒性較?。?-5],常用于兒童腎病綜合征等免疫缺陷疾病的治療。嗎替麥考酚酯進入體內(nèi)之后,迅速水解成霉酚酸,發(fā)揮免疫作用。在病兒服藥后,由于個體差異,在相同劑量下,霉酚酸的血藥濃度相差較大[4],因此,需要定期監(jiān)測并及時調(diào)整服藥劑量,提高臨床療效。目前霉酚酸的血藥濃度測定方法主要包括免疫法、高效液相色譜法及液相-質(zhì)譜聯(lián)用法等[6-11]。其中高效液相色譜法較為經(jīng)濟、便捷,檢測結(jié)果不受代謝物的影響。本研究建立了高效液相色譜法測定兒童血漿中霉酚酸的濃度,并以此監(jiān)測腎病綜合征病兒的血藥濃度。雖然此法已有若干報道[12-15],但這些報道均存在一些不足,有的方法使用緩沖鹽溶液作為流動相,可能對儀器或色譜柱造成損傷;有的方法未選擇內(nèi)標或者內(nèi)標存在著被其他藥物干擾的可能;還有部分方法的血樣處理過程相對復(fù)雜。本研究于2017 年11月至2018年4月建立的方法對這些問題加以改善,使高效液相色譜測定兒童血漿中霉酚酸的濃度更加簡潔、方便。
1.1 藥品與試劑 霉酚酸標準品(純度大于98%,Lot.086M4010V,SIGMA);萘啶酸標準品(純度99.0%,Lot107089,Dr.Ehrenstorfer)。甲醇、乙腈為色譜純;純化水由南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院自制??瞻籽獫{由南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院提供。
1.2 儀器 Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀(G1312B二元泵,G1316A柱溫箱,G4212B二極管陣列檢測器),十萬分之一分析天平(瑞士Mettler Toledo,MS205DU),Vortex-5 渦旋振蕩器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司),abbott 離心機(德國hettich公司)。
2.1 檢測條件 色譜柱Agilent Eclipse Plus-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流動相為0.1%三乙胺溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)PH 為3.5±0.1)-乙腈=60∶40;流速為1.0 mL/min;柱溫為25oC;檢測波長為215 nm,進樣量為40 μL。
2.2 溶液的配制 對照品溶液:精密稱取霉酚酸標準品12.5 mg,到25 mL 容量瓶加甲醇到刻度,然后超聲震蕩2 min。置于-30oC 冰箱內(nèi)保存。內(nèi)標溶液:精密稱取萘啶酸標準品3.6 mg,到100 mL 容量瓶加甲醇到刻度,然后超聲震蕩2 min。置于-30oC冰箱內(nèi)保存。
2.3 樣品處理 精密吸取血漿樣品200 μL 置于1.5 mL 離心管中,加入20 μL 內(nèi)標,加入甲醇400 μL,渦旋震蕩5 min 后,10 800 r/min 離心8 min,取全部上清液,加入5 μL 5%的磷酸水溶液,渦旋震蕩1 min 后,10 800 r/min 離心8 min。吸取上清進樣。
2.4 方法專屬性試驗 將空白血漿(不含內(nèi)標),病兒服藥后的血漿(含內(nèi)標)按“2.3”處理后,在“2.1”色譜條件下,進樣,得色譜圖(圖1)??梢娧獫{內(nèi)源性物質(zhì)的保留時間在3 min 左右,內(nèi)標萘啶酸的保留時間在8.1 min 左右,主峰霉酚酸的保留時間在12.8 min左右,無雜質(zhì)峰干擾,各個峰分離度及峰形良好,空白血樣在霉酚酸和萘啶酸色譜峰位置無吸收。
圖1 空白血漿(A)和病兒血漿(B)高效液相色譜圖
2.5 標準曲線 取對照品溶液適量,用空白血漿等比稀釋,配制成濃度為0.20,0.39,0.78,1.56,3.13,6.25,12.50,25.00,50.00 μg/mL 的系列血漿樣品,按照“2.3”項下方法處理后進行測定。以對照品與內(nèi)標的峰面積比(Y)和對照品濃度(X)作線性回歸,得回歸方程Y=0.340 3X-0.003 6,r=0.999 6。
2.6 方法回收率和精密度 配制0.39,25.00,50.00 μg/mL 高、中、低3種濃度的血漿樣品,每一濃度1 d內(nèi)按“2.3”項下方法平行操作5次;連續(xù)測定3 d。根據(jù)標準曲線,考察對照品的方法回收率及日內(nèi)、日間精密度(表1)。
表1 回收率及精密度(n=5)
2.7 生物樣品的穩(wěn)定性 考察霉酚酸0.39,25.00,50.00 μg/mL高、中、低3 種濃度的血漿樣品在凍融1次,反復(fù)凍融3 次,室溫放置12 h,4oC 冰箱內(nèi)放置12 h,等不同溫度條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果在各個條件下基本穩(wěn)定(表2)。
2.8 病兒樣本測定結(jié)果 根據(jù)已報道的有限采樣法[16],測定南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院病兒體內(nèi)霉酚酸暴露量。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求,病兒近親屬對研究方案簽署知情同意書。病兒在服用嗎替麥考酚酯分散片(賽可平)2周達穩(wěn)態(tài)后,于清晨服藥前(0 h),服藥后0.5 h和2 h 3個時間點取靜脈血1~2 mL于EDTA抗凝管,立即送實驗室離心,取上清,按照上述的方法檢測濃度。按0~12 h 藥-時曲線下面積(AUC0~12h)=7.75+6.49×C0+0.76×C0.5+2.43×C2計算。從2017年11月至2018 年4 月,6 個月內(nèi)共檢測177 例次。其中63 例12 h 內(nèi)霉酚酸暴露量小于30 mg·L-1·h-1,占35.6%,102例在30~60 mg·L-1·h-1,占57.6%,12例大于60 mg·L-1·h-1,占6.8%。
3.1 試驗方法 本研究處理血樣時,采用了二倍體積的甲醇直接蛋白沉淀法,和其他常用的固相萃取法和液-液萃取法相比,該方法成本低,操作簡便,花費時間較短,靈敏度也能滿足臨床樣本測試的需求。然而,處理后發(fā)現(xiàn)上清有些許渾濁,對照品峰形較差,后優(yōu)化方法,經(jīng)磷酸酸化,離心后進樣,可得到較澄清的上清液和較好的峰形。在流動相方面,我們沒有使用緩沖鹽體系,這樣可以延長色譜柱壽命,簡化流動相配制。選擇萘啶酸作為內(nèi)標的原因是它在當(dāng)前的流動相條件下出峰時間適宜,不受其他雜質(zhì)峰干擾。并且對兒童一般不會使用喹諾酮類藥物,不會造成干擾。
3.2 檢測結(jié)果 由于肝腸循環(huán)的存在,霉酚酸的谷濃度一般被認為不能很好地反映其在體內(nèi)的暴露水平。但在一個用藥間隔內(nèi)多點采血會給病人,特別是兒童病人造成很大痛苦。因此,有限采樣法[17]監(jiān)測霉酚酸暴露量的方法被較多地采用。由于兒童病人的特殊性,本研究想在一個用藥間隔內(nèi)多點采血以建立有限采樣法的估算公式較為困難,所以對住院病兒采用了上述三點采血法和相應(yīng)的估算公式,預(yù)估他們體內(nèi)的暴露藥量。霉酚酸暴露量在腎病綜合征中起最佳作用的范圍尚無定論,按其在移植病人中能起最佳的免疫抑制作用[18]的范圍30~60 mg·L-1·h-1來看,這些病兒有1/3 未能達標,另有6%超過上限,可能增加了不良反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險。
表2 血漿中霉酚酸穩(wěn)定性分析(n=5)
由于門診清晨時需要采血的病人眾多,門診病人如果采3個血樣,可能會造成采血時刻不準確,進而影響預(yù)估值的準確性。在統(tǒng)計已測樣本的谷濃度和預(yù)估的霉酚酸暴露量之后(表3),我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)谷濃度在>1.0~3.5 μg/mL[19]之間時,病人霉酚酸暴露量是(42.1±11.4)mg·L-1·h-1,在靶范圍30~60 mg·L-1·h-1之間占比為84%(77/92)。因此,為方便在門診定期監(jiān)測血藥濃度的病人,可以選擇監(jiān)測谷濃度是否在>1.0~3.5 μg/mL之間。如果谷濃度不在這個范圍內(nèi),或者病人發(fā)生劑量調(diào)整時,我們會建議該病兒按有限采樣法,估算更精確的霉酚酸暴露量。
表3 177例次樣本谷濃度和預(yù)估的霉酚酸暴露量的統(tǒng)計分析
3.3 試驗總結(jié) 本試驗建立了霉酚酸血藥濃度高效液相色譜測定方法。在本色譜條件下,霉酚酸的理論塔板數(shù)大于8 000,整個檢測在15 min 左右完成,相關(guān)物質(zhì)保留時間適當(dāng)。該方法線性關(guān)系良好,重現(xiàn)性高,可用于醫(yī)院病兒霉酚酸血藥濃度的檢測,為臨床提供可靠的參考,保障合理和安全用藥。但由于項目開展時間較短,經(jīng)驗不足和兒童群體的特殊性,還需進一步改進病兒霉酚酸暴露量的估算方法,并結(jié)合臨床,探索霉酚酸暴露量在不同病種時更合理的范圍。