楊春會(huì)，段紹琴，崔婷婷，林云碧，宋春艷，雷慶齡，桑寶華，呂瑜，馮俊，田新

急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是B系或T系淋巴細(xì)胞在骨髓內(nèi)異常增生的惡性腫瘤性疾病。在第八版兒科學(xué)中指出，ALL在我國(guó)小兒惡性腫瘤中是最常見(jiàn)的，不到10歲的小兒白血病的發(fā)生率為3/10 萬(wàn)～4/10 萬(wàn)，發(fā)病高峰期是2～5 歲，且男性發(fā)病率高于女性［1］。ALL 兒童在出生時(shí)的免疫功能是不同的，對(duì)感染的反應(yīng)也是異常的［2］。ALL 的治愈率越來(lái)越高，但是大約有15%～25%的病人痊愈后會(huì)復(fù)發(fā)［3］，這也是復(fù)發(fā)兒童死亡的原因之一。另外，由于化療或藥物耐藥性，部分ALL病人在治療的過(guò)程中出現(xiàn)毒性反應(yīng)，導(dǎo)致不良后果［4］。

ALL 維持治療階段，運(yùn)用最多的核酸酶類(lèi)似物藥物為巰基嘌呤（6-MP）［5］。6-MP已被用于治療多種兒童自身免疫性疾病，如炎癥性腸?。?］和某些白血?。?］。中斷6-MP 的維持治療會(huì)導(dǎo)致復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的增加［8］，適當(dāng)劑量的6-MP可顯著提高ALL病人的生存率，但是劑量大的6-MP會(huì)引發(fā)骨髓抑制現(xiàn)象［9］。因此，臨床上合理的調(diào)整6-MP用藥劑量很重要。有人提出運(yùn)用磁性分子印跡納米顆粒聚合物來(lái)提取和測(cè)定人血漿中6-MP及其活性代謝產(chǎn)物的濃度，這對(duì)6-MP治療ALL的臨床使用劑量有很好的指導(dǎo)作用［10］。

NUDT15等位基因的變異與ALL的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。NUDT15基因的遺傳變異影響藥物的水解作用，因此增加了對(duì)藥物毒性的敏感性［11］。在日本7歲以下具有NUDT15等位基因變異的ALL病人中，6-MP的平均給藥劑量低于野生型純合等位基因的病人。Cheng等［12］提出，低劑量的6-MP維持治療可引起NUDT15純合突變體（TT基因型）ALL病人的造血毒性。NUDT15 rs116855232（c.415C＞T）變異是白細(xì)胞減少癥的預(yù)測(cè)因子，也是中國(guó)ALL兒童6-MP耐受的最佳預(yù)測(cè)因子［9］。但是，NUDT15變異與云南省彝族ALL兒童是否有關(guān)聯(lián)仍是未知，因此，本研究的主要目的是確定云南省彝族ALL 兒童病人中NUDT15變異的頻率，并確認(rèn)其關(guān)聯(lián)性。此外，確定NUDT15變異與6-MP敏感性和毒性的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 TIANquick Midi Purification KiT（北京TIANGEN 生產(chǎn)，貨號(hào)：DP204-02），DNeasy Blood＆Tissue KiT（德國(guó)QIAGEN生產(chǎn)，貨號(hào)：69504），2×Taq PCR MasterMix 2%（北京TIANGEN 生產(chǎn)，貨號(hào)：MT201-01），5×TBE Buffer（北京TIANGEN生產(chǎn)，貨號(hào)：RT205），電泳相關(guān)試劑（北京TIANGEN生產(chǎn)）。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 主要的實(shí)驗(yàn)儀器有PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)BIO-RAD公司，型號(hào)：T100），基因測(cè)序儀（美國(guó)ABI 公司，型號(hào)：ABI-3130xl），凝膠成像系統(tǒng)EC3（美國(guó)UVP 公司，型號(hào)：EC3 Imaging System），紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman公司）。

1.2 樣本采集及儲(chǔ)存 本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。選取標(biāo)準(zhǔn)：（1）參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組制定的兒童ALL 診療建議確診［13］；（2）監(jiān)護(hù)人自愿參與此次研究。健康兒童以3代以上無(wú)血緣關(guān)系的在昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院體檢健康兒童作為研究對(duì)象，ALL 病兒來(lái)自昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院200例病兒。所有參與此次研究的健康體檢者及200 例病兒均于2017年1月至2018年9月期間收錄在昆明醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，并記錄了研究對(duì)象的性別、年齡，民族、身份證信息。此次研究從健康體檢者組及病兒組各按抽簽法隨機(jī)選取50例漢族健康兒童、彝族健康兒童和彝族初發(fā)的ALL 病兒（1～16 歲）的外周靜脈全血樣本。每個(gè)研究對(duì)象抽取3 mL外周血，然后輕輕搖動(dòng)真空采血管，使血樣本與管內(nèi)的抗凝劑充分混勻，編號(hào)后置于－80 ℃超低溫冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA 提取 提取過(guò)程按照DNeasy? Blood＆Tissue KiT使用說(shuō)明書(shū)操作，然后將提取得到的基因組DNA收集于離心管中，置于－20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA樣本的檢測(cè) 取出凍存的DNA樣本于碎冰中解凍，然后通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣本純度，DNA 純度＝OD260/OD280（OD 為被檢測(cè)物吸收掉的光密度，即吸光度；OD260/OD280比值指260 nm和280 nm下吸光度比值），當(dāng)OD260/OD280結(jié)果顯示大于2.0，表示樣本中可能有DNA降解為RNA；當(dāng)OD260/OD280 結(jié)果顯示小于1.8 時(shí)，表示樣本中蛋白質(zhì)含量較高；當(dāng)OD260/OD280結(jié)果顯示介于1.8～2.0，表示DNA較純，其純度合格，可用于測(cè)序。

1.5 NUDT15 基因1-3 號(hào)外顯子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增運(yùn)用Primer5 在線軟件設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物，NUDT15外顯子（Exon）1 的引物序列：正向?yàn)?′-CAAAGCACAACTGTAAGCGACT -3′，反向?yàn)?5′ -GAAAGACCCAGCTAGCAAAGAC-3’；Exon3 的引物序列：正向?yàn)?′-AAGCAAATGCAAAGCATCAC-3′，反 向 為5′ -GGCTGAAAGAGTGGGGGATA -3′ 。NUDT15 Exon1 PCR 反應(yīng)體系為25 μL，包含2×GC Buffer 12.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，LA Taq 酶0.25 μL，正向引物（20 μmol/L）0.5 μL，反向引物（20 μmol/L）0.5 μL，DEPC水6.25 μL，DNA模板1 μL（約100 ng），擴(kuò)增條件是94 ℃3 min；94 ℃30 s，64 ℃30 s，72 ℃1 min，循環(huán)36次；再延伸72 ℃5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送往上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。NUDT15 Exon3 PCR 反應(yīng)體系為25 μL，包含10×Buffer 12.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，rTaq 酶0.125 μL，正向引物（20 μmol/L）0.5 μL，反向引物（20 μmol/L）0.5 μL，DEPC 水18.375 μL，DNA 模板1 μL（約100 ng），擴(kuò)增條件是98 ℃1 min；98 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，循環(huán)36次；再延伸72 ℃5 min。

1.6 PCR 產(chǎn)物提純 取5 μL PCR 產(chǎn)物于八連管中，加入1 U 蝦堿酶（SAP）及6 U 核酸外切酶I（Exo I），混勻；37 ℃孵化15 min；80 ℃孵化15 min；置于25 ℃（室溫）；吸取10 μL PCR 產(chǎn)物，加入2 μL 的溴酚藍(lán)，徹底混合后添加1.2%的瓊脂糖凝膠至加樣孔中，進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為40～50 min，電壓為恒壓100 V，電泳結(jié)束后取出膠板，運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果的觀察。

1.7 DNA測(cè)序 測(cè)序引物序列［14］：Exon1的引物序列為5′-CAAAGCACAACTGTAAGCGACT-3′，Exon3的引物序列為5′-AAGCAAATGCAAAGCATCAC-3′?；旌戏磻?yīng)液：2 μL Big Dye3.1混合物，2 μL 0.4 μM的測(cè)序引物，1～2 μL純化的PCR產(chǎn)物。反應(yīng)條件：96 ℃1 min；96 ℃10 s，50 ℃5 s，循環(huán)28次；60 ℃4 min。

1.8 臨床記錄 初發(fā)ALL 病人，采用CCLG-ALL 2008方案（China Children Leukemia Group ALL 2008方案）或CCCG-ALL 2015 方案（China Children Cancer Group ALL 2015 方案），在早期強(qiáng)化、鞏固、延遲強(qiáng)化、維持治療過(guò)程中，均需應(yīng)用6-MP 進(jìn)行治療。在治療的過(guò)程中出現(xiàn)的發(fā)熱、中性粒細(xì)胞減少、白細(xì)胞降低、血小板減少、感染性休克等判斷骨髓抑制，記錄發(fā)生的時(shí)間及程度。

1.9 數(shù)據(jù)整理與分析 記錄漢族健康兒童、彝族健康兒童及彝族ALL病人的基因測(cè)序結(jié)果，然后在基因測(cè)序儀上對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并運(yùn)用Polyphred軟件進(jìn)行SNP（單核苷酸的多態(tài)性）和突變分析。

2 結(jié)果

2.1 150例研究對(duì)象的NUDT15基因1-3號(hào)外顯子基因的Exon2 均未檢測(cè)到 我們對(duì)病人計(jì)劃進(jìn)行每天50 mg/m2的6-MP 治療：當(dāng)白細(xì)胞1.5×109/L～3.0×109/L，中性粒細(xì)胞1.0×109/L～1.5×109/L時(shí)，按正常劑量；當(dāng)白細(xì)胞1.0×109/L～1.5×109/L，中性粒細(xì)胞0.5×109/L～1.0×109/L時(shí)，6-MP的劑量減半；當(dāng)白細(xì)胞＜1×109/L，中性粒細(xì)胞＜0.5×109/L，血小板＜50×109/L 時(shí)，停止6-MP 的治療。我們對(duì)病人采集的外周血進(jìn)行NUDT15基因1-3號(hào)外顯子基因的測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這150 例研究對(duì)象的NUDT15 基因1-3 號(hào)外顯子基因的Exon2均未檢測(cè)到。

2.2 150 例兒童的NUDT15 Exon1 均有2 種變異體 入選的150例來(lái)自云南省兒童年齡均介于1～16歲，對(duì)NUDT15 Exon1 進(jìn)行測(cè)序后發(fā)現(xiàn)所有兒童都有2 種變異體，分別為rs186364861（c.416G＞A，編碼p.Arg139His），rs554405994（c.36_37insGGAGTC編碼p.Val18_Val19insGlyVal）（見(jiàn)表1）。其中云南省彝族的健康兒童：男孩有32 例，女孩有18 例，rs186364861 有1 例（男孩），占2%，rs554405994 有11例（7例男孩，4例女孩），占22%，正常無(wú)突變的野生型有38 例，占76.0%。云南省漢族的健康兒童：男孩33 例，女孩17 例，rs186364861 有1 例（男孩），占2%，rs554405994 有6 例（4 例男孩，2 例女孩），占12%，正常無(wú)突變的野生型有43 例，占86%。云南省彝族ALL兒童：rs554405994有8例（3例男孩，5例女孩），占16%，rs186364861 有1 例（女孩），占2%，正常無(wú)突變的野生型有41例，占82%。

表1 云南省兒童150例NUDT15 Exon1測(cè)序結(jié)果/例

2.3 NUDT15 各基因型所占比例差異性大 入選的150例兒童的NUDT15 rs116855232等位基因?yàn)門(mén)/C，各基因型所占比例CC＞TC＞TT，具體的病人數(shù)見(jiàn)表2。云南彝族健康兒童的純合子突變TT 基因型只有1例男孩，其占2%；雜合子突變TC基因型一共有7 例，其中女孩是3 例，男孩4 例，占14%；野生型CC 基因型共有42 例，占84%。云南漢族健康兒童的純合子突變TT基因型共0例，占0%，雜合子突變TC基因型共11（女孩4例，男孩7例）例，占22%，野生型CC 基因型39 例，占78%。云南彝族ALL 兒童的純合子突變TT基因型的是1例女孩，占2%；雜合子突變TC 基因型共有9 例：女孩3 例，男孩6 例，占18%；野生型CC基因型共有40例，占80%。

表2 云南省兒童150例NUDT15 rs116855232等位基因突變率/例

2.4 ALL病人在6-MP治療階段，出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng) 不良反應(yīng)有發(fā)熱、白細(xì)胞降低、中性粒細(xì)胞減少、血小板減少、感染性休克等骨髓抑制現(xiàn)象。結(jié)合臨床癥狀，我們發(fā)現(xiàn)：ALL 病人在接受6-MP 常規(guī)劑量治療后，存在NUDT15 基因純合突變TT 病人的骨髓抑制現(xiàn)象是最嚴(yán)重的，雜合突變CT病人有中度至重度的骨髓抑制現(xiàn)象，而NUDT15 基因野生型CC病人的骨髓抑制現(xiàn)象是最輕的。

3 討論

NUDT15編碼一種Nudix水解酶超家族的酶，是硫嘌呤活化和毒性的負(fù)調(diào)控因子。NUDT15突變會(huì)影響嘌呤類(lèi)似藥物的反應(yīng)［15］，導(dǎo)致硫嘌呤代謝不良，并與硫嘌呤誘導(dǎo)的早期白細(xì)胞減少有關(guān)。6-MP與甲氨蝶呤（MTX）的結(jié)合是兒童ALL 維持治療的重要組成部分［16］。但是，治療劑量不合適時(shí)會(huì)引起不良反應(yīng)，如骨髓抑制、肝毒性、嘔吐和食欲不振，也會(huì)增加患白血病的風(fēng)險(xiǎn)［17］。在本研究中，病人出現(xiàn)的不良反應(yīng)，主要有發(fā)熱、白細(xì)胞降低、中性粒細(xì)胞減少、血小板減少、感染性休克等骨髓抑制現(xiàn)象。為了減少6-MP的不良反應(yīng)，對(duì)不同等位基因型的病兒進(jìn)行了劑量的調(diào)整。

6-MP的毒性與NUDT15遺傳多態(tài)性有關(guān)［17］，具有特定等位基因突變的病人需調(diào)整劑量，特別是純合突變基因型的病人。在ALL 治療中，NUDT15 與6-MP聯(lián)合使用會(huì)避免6-MP誘導(dǎo)的白細(xì)胞減少有關(guān)的炎癥性腸病的發(fā)生，這與NUDT15種系變異（如錯(cuò)義SNP：rs116855232，誘導(dǎo)R139C）有關(guān)。這些變異表現(xiàn)出種族特異性，例如，rs116855232 的變異等位基因在東亞和西班牙人中較高，但在高加索和非洲人中較低［18］，因此，可通過(guò)整個(gè)基因篩選來(lái)確定硫嘌呤的初始劑量。在本研究中，我們觀察了6-MP的毒性并評(píng)估了云南省彝族兒童6-MP 耐受性與NUDT15 變異之間的依賴關(guān)系。研究對(duì)象均根據(jù)CCLG-ALL 2008 方案或CCCG-ALL 2015 方案進(jìn)行治療。在維持期間，根據(jù)血象調(diào)整6-MP劑量。維持治療階段，6-MP 計(jì)劃每天50 mg/m2，白細(xì)胞為1.5×109/L～3.0×109/L，中性粒細(xì)胞為0.5×109/L～1.5×109/L。服用6-MP 后白細(xì)胞減少，6-MP 劑量調(diào)整：CC（野生型）下調(diào)65%～95%；TC（雜合型）下調(diào)60%～80%；TT（純合型）下調(diào)25%～40%，以維持白細(xì)胞數(shù)為1.5×109/L～3.0×109/L，中性粒細(xì)胞數(shù)為0.5×109/L～1.5×109/L左右。

NUDT15 是亞洲人群中潛在的6-MP 敏感性的主要因素之一，NUDT15 rs116855232純合突變會(huì)增加早期病人白細(xì)胞嚴(yán)重減少的發(fā)生率［19-20］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)50例ALL病兒中，有1例是純合的，9例是TC 雜合子突變。有人提出基因NUDT15 突變是ALL兒童中6-MP骨髓毒性的重要影響因素［21］，進(jìn)行NUDT15基因檢測(cè)對(duì)ALL個(gè)性化治療具有重要的臨床意義，結(jié)合本研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)接受6-MP常規(guī)劑量治療的ALL病人中存在NUDT15基因純合突變TT 的病人，其骨髓抑制現(xiàn)象是最嚴(yán)重的，雜合突變CT 病人則出現(xiàn)中度至重度骨髓抑制現(xiàn)象，而NUDT15基因野生型CC的病人出現(xiàn)的骨髓抑制現(xiàn)象最輕。但是，在50例云南省彝族兒童ALL病人中，純合子突變TT基因型僅1例（女孩），占2%，雜合子突變TC基因型共9（女孩3例，男孩6例）例，占18.0%，而在彝族健康兒童中，純合子突變TT基因型1例（男孩），占2%，雜合子突變TC基因型共有7例，分別是女孩3例和男孩4例，占14.0%，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，在云南省彝族兒童ALL病人中NUDT15基因突變的敏感性低，NUDT15基因不適合云南省彝族兒童作為6-MP不良反應(yīng)的相關(guān)檢測(cè)基因。