尹璐，鄭磊貞，趙學(xué)軍

宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是宮頸癌前病變的主要疾病狀態(tài)，在正常宮頸上皮組織發(fā)展到宮頸癌的連續(xù)過(guò)程中，具有至關(guān)重要作用［1］。早期明確、診斷CIN 并準(zhǔn)確判斷其病情程度及預(yù)后轉(zhuǎn)歸情況對(duì)減少宮頸癌發(fā)生和發(fā)現(xiàn)早期宮頸癌意義重大。但相關(guān)研究表明，CIN 進(jìn)行組織學(xué)診斷時(shí)，極易與不成熟鱗狀上皮化生和萎縮及修復(fù)性/反應(yīng)性上皮改變產(chǎn)生混淆現(xiàn)象，導(dǎo)致診斷結(jié)果受到影響［2］。近年來(lái)，臨床為提高CIN診斷準(zhǔn)確性、減少診斷差異，逐漸于輔助診斷客觀指標(biāo)中引入生物學(xué)標(biāo)志物。其中，P16INK4A（可簡(jiǎn)稱為P16）在多種腫瘤組織中通過(guò)缺失表達(dá)降低或甲基化、突變加快腫瘤疾病發(fā)生與進(jìn)展［3］。Ki-67是一種非組蛋白抗原，屬于核增殖標(biāo)志基因，研究顯示Ki-67過(guò)度表達(dá)可對(duì)多種腫瘤惡性生物學(xué)行為產(chǎn)生密切影響［4］。因此，本研究選取液基細(xì)胞學(xué)（liquid-based cytology test，LCT）診斷為≥意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）女性病人作為研究對(duì)象，以探討P16INK4A、Ki-67共表達(dá)在CIN鑒別診斷中的臨床和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。具體總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取上海市長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院2016 年12 月至2018 年8 月收診的經(jīng)LCT 診斷為≥ASCUS女性病人431例，其中因細(xì)胞量不足、細(xì)胞學(xué)不滿意無(wú)法行P16/Ki-67雙染剔除21例，最終有效標(biāo)本數(shù)量為410 例，年齡（49.01±5.84）歲，范圍為21～70歲，病程（1.16±0.14）年，范圍為9個(gè)月至3年。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）均具有明確信息（如年齡、性別、病史等）；（2）年齡范圍為21～70 歲；（3）均經(jīng)LCT診斷為≥ASCUS；（4）宮頸完整，且未接受過(guò)宮頸手術(shù)或物理治療；（5）無(wú)臨床懷孕疑似癥狀；（6）病人及近親屬理解研究程序，自愿參與，且均簽訂知情承諾書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）樣本信息不全者；（2）既往罹患宮頸尖銳濕疣、宮頸息肉等宮頸疾病者；（3）伴有其他宮頸疾病者；（4）處于妊娠期、哺乳期女性；（5）不符合樣本制作要求；（6）同時(shí)參加其他臨床研究者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集方法 所有研究對(duì)象均由經(jīng)驗(yàn)豐富的婦科醫(yī)生對(duì)其進(jìn)行常規(guī)婦科檢查，同時(shí)采集標(biāo)本，具體采集步驟：采用BD SurePathTM細(xì)胞學(xué)采樣器（由廣州市寶迪科技有限公司提供）將宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本收集充足，于宮頸口對(duì)準(zhǔn)宮頸刷尖端，在施加合適壓力條件下同方向旋轉(zhuǎn)宮頸刷，持續(xù)5～8周，盡可能使宮頸刷于宮頸移行帶上刷取細(xì)胞，保障獲取充足細(xì)胞成分。取出后，將細(xì)胞標(biāo)本放置于富含保存液的細(xì)胞保存瓶?jī)?nèi)，填寫病理報(bào)告，于15～30 ℃條件下保存標(biāo)本，送至病理科檢測(cè)。

1.3.2 人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）檢測(cè)方法 選擇PCR 毛細(xì)管電泳法檢測(cè)HPV，采用由寧波海爾施基因科技有限公司提供的貝克曼GeXP 全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書完成，目的是檢查18種高危型HPV（16，18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82 型）和7 種低危型別（6，11，42，43，44，81，83）。高危型HPV結(jié)果只要有一項(xiàng)為陽(yáng)性則記為陽(yáng)性，結(jié)果均陰性記為陰性。

1.3.3 LCT 檢查方法 采用BD SurePathTM系統(tǒng)（由廣州市寶迪科技有限公司提供）制備細(xì)胞學(xué)玻片，具體操作步驟：對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理（消化液），以保障獲取足量細(xì)胞，保證制作質(zhì)量。于BD SurePathTM制片機(jī)中放置樣本存放瓶，進(jìn)行程序化制片，之后于乙醇（95%）固定玻片，實(shí)行巴氏染色，根據(jù)陰道細(xì)胞學(xué)診斷分類系統(tǒng)（the bethesda system，TBS）報(bào)告結(jié)果。具體分類：未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞和惡性病變細(xì)胞（No intraepithelial lesions/malignant，NILM）、不典型腺細(xì)胞（atypical glandular cell，AGC）、ASCUS、鱗狀上皮內(nèi)低度病變（low-squamous intraepithelial lesion，LSIL）、非典型鱗狀上皮細(xì)胞，不除外高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（atypical squamous cells not except high lesion，ASC-H）、鱗狀上皮內(nèi)高度病變（highsquamous intraepithelial lesion，HSIL）、鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC），將ASCUS及以上細(xì)胞學(xué)診斷定義為細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性。

1.3.4 P16/Ki-67 單染及雙染方法 P16、Ki67 單染采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行檢測(cè)，分別制片后加入鼠抗人P16 和兔抗人Ki67，具體詳細(xì)步驟均按照試劑盒說(shuō)明書操作。P16/Ki-67 雙染檢測(cè)采用由羅氏公司提供的全自動(dòng)免疫組化分析儀（型號(hào)為CINtec PLUS），將標(biāo)本經(jīng)BD SurePathTM制片后，固定于乙醇中（95%），對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染色，清洗（洗潔精），最后將其封固。由專業(yè)檢驗(yàn)醫(yī)師在顯微鏡條件下進(jìn)行觀察、分析，并將觀察畫面采用拍照形式記錄下來(lái)。P16INK4A結(jié)果判讀方法為細(xì)胞質(zhì)或（和）細(xì)胞核著棕黃色，則判定為P16INK4A呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。Ki-67結(jié)果判讀方法為陰性：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%或無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；其陽(yáng)性細(xì)胞通常見(jiàn)于細(xì)胞核，弱陽(yáng)性：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10%～25%；陽(yáng)性：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞25%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%，于上皮全層彌漫分布。P16/Ki-67 雙染結(jié)果判讀方法為將P16 細(xì)胞質(zhì)定義為染色棕色、Ki-67細(xì)胞核定義為染色紅色，在同一焦距條件下進(jìn)行觀察，若結(jié)果顯示出特定紅染細(xì)胞核、棕染細(xì)胞質(zhì)，則認(rèn)定為陽(yáng)性細(xì)胞，單個(gè)細(xì)胞雙染則判定為陽(yáng)性；同一細(xì)胞內(nèi)僅見(jiàn)1 種顏色或未見(jiàn)兩種顏色則判定為陰性。判讀標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立于形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果，任何強(qiáng)弱、任何水平表達(dá)均可。如圖1，2。

1.3.5 陰道鏡活檢 由經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)醫(yī)師進(jìn)行相關(guān)檢查操作，具體操作步驟：于宮頸依次涂抹醋酸（3%）、復(fù)方碘溶液（1%），組織標(biāo)本采集處選擇可疑部位，實(shí)行病理活檢。若陰道鏡圖像不滿意，則于宮頸管采取常規(guī)搔刮措施，采集后固定組織標(biāo)本（4%甲醛），實(shí)施病理檢查。病理診斷中CIN Ⅱ、CIN Ⅲ（相當(dāng)于HSIL）及浸潤(rùn)癌判定為陽(yáng)性；CIN Ⅰ（相當(dāng)于LSIL）及宮頸炎癥判定為陰性。

1.4 觀察指標(biāo) （1）P16INK4A、Ki-67與HPV感染關(guān)聯(lián)性。（2）陰道鏡活檢結(jié)果。（3）P16INK4A、Ki-67 單染及P16/Ki-67 雙染診斷結(jié)果。（4）診斷價(jià)值（診斷準(zhǔn)確性、敏感性、特異性）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 21.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P16INK4A、Ki-67與HPV感染關(guān)聯(lián)性 Spearman相關(guān)性分析，P16INK4A、Ki-67與HPV感染呈正相關(guān)（r1＝0.572，P1＝0.005；r2＝0.554，P2＝0.011）。

2.2 陰道鏡活檢結(jié)果 經(jīng)陰道鏡活檢，410 例LCT診斷為≥ASCUS 女性病人中，132 例為陽(yáng)性病人，占32.20%，其中CIN Ⅱ占34.09%（45/132），CIN Ⅲ占39.39%（52/132），浸潤(rùn)癌占26.52%（35/132）；陰性病人278 例，占67.80%，其中子宮炎癥占56.83%（158/278），CIN Ⅰ占43.17%（120/278）。

2.3 P16INK4A、Ki-67 單染及P16/Ki-67 雙染診斷結(jié)果 P16INK4A單染檢查，陽(yáng)性144 例，陰性266 例，其中漏診24 例，誤診36 例；Ki-67 單染檢查，陽(yáng)性143例，陰性267 例，其中漏診27 例，誤診38 例；P16/Ki-67 雙染檢查，陽(yáng)性168 例，陰性242 例，其中漏診2例，誤診38例。見(jiàn)表1。

表1 P16INK4A、Ki-67單染及P16/Ki-67雙染鑒別診斷宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變410例結(jié)果/例

2.4 診斷價(jià)值 P16/Ki-67 雙染診斷準(zhǔn)確性、敏感性高于P16INK4A、Ki-67 單染（P＜0.05）；P16/Ki-67 雙染診斷特異性與P16INK4A、Ki-67單染相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 P16INK4A、Ki-67單染及P16/Ki-67雙染鑒別診斷宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變410例診斷價(jià)值/%（n/N）

3 討論

近年來(lái)我國(guó)宮頸癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，發(fā)病人群呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，對(duì)女性生命安全造成嚴(yán)重威脅，防治形勢(shì)嚴(yán)峻［5］。宮頸癌通常是因高危型HPV感染而致，其發(fā)展過(guò)程通常認(rèn)為需經(jīng)過(guò)宮頸正常上皮組織—宮頸癌前病變—宮頸癌的演變過(guò)程，其中宮頸癌前病變CIN 具有至關(guān)重要作用［6-7］。臨床為降低宮頸癌發(fā)病率，需及早確診CIN，在明確病情程度基礎(chǔ)上采取有效措施治療，控制疾病進(jìn)展。研究表明，CIN 組織學(xué)診斷結(jié)果可直接關(guān)系到病人病情程度判斷及治療方案制定，對(duì)其預(yù)后情況具有間接影響［8-9］。

近年來(lái)，生物學(xué)標(biāo)志物成為臨床研究熱點(diǎn)。周文俊［10］研究中表明，在CIN、宮頸癌組織中，P16INK4A、Ki-67與HPV感染具有明顯正相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果也顯示，P16INK4A、Ki-67與HPV感染呈正相關(guān)（P＜0.05），表明P16INK4A、Ki-67可隨HPV 感染發(fā)生、進(jìn)展呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，在診斷CIN 及宮頸癌中具有一定輔助作用。P16INK4A屬于細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制物，半衰期較短，可作用于除G0 期外所有細(xì)胞周期階段，可將細(xì)胞G1 期至S 期進(jìn)展過(guò)程阻斷，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖作用，可達(dá)到抑制癌癥的目的，若出現(xiàn)甲基化、突變或缺失表達(dá)降低等現(xiàn)象，則可引發(fā)腫瘤疾?。?1-12］。臨床實(shí)踐證實(shí)，P16INK4A參與HPV感染而致的宮頸病變進(jìn)展過(guò)程，且具有重要作用［13］。Ki-67 則屬于細(xì)胞核內(nèi)蛋白，與細(xì)胞分裂增殖關(guān)系密切，可準(zhǔn)確反映細(xì)胞增殖活性［14］。相關(guān)研究表明，Ki-67可有效反映宮頸癌細(xì)胞增殖情況［15］。同時(shí)，研究顯示Ki-67 過(guò)度表達(dá)對(duì)多種腫瘤疾病預(yù)后產(chǎn)生不同程度影響［16-17］。近年來(lái)，P16/Ki-67雙染逐漸應(yīng)用于臨床腫瘤疾病診斷中，若同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)檢測(cè)出P16INK4A、Ki-67，則標(biāo)志著細(xì)胞周期失調(diào)，對(duì)檢出真正病變細(xì)胞具有明確輔助作用，且不依賴于形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果［18-19］。本研究結(jié)果顯示，P16/Ki-67雙染診斷準(zhǔn)確性、敏感性高于P16INK4A、Ki-67單染（P＜0.05），可見(jiàn)P16INK4A、Ki-67應(yīng)用于CIN鑒別診斷中，可顯著提高診斷準(zhǔn)確性、敏感性，有助于判斷CIN病情程度。

現(xiàn)階段，P16INK4A、Ki-67 在臨床腫瘤疾病診斷中的應(yīng)用具有一定局限性，主要是由于其檢測(cè)過(guò)程中所需BD SurePathTM系統(tǒng)、生化分析儀、抗體、試劑盒等一系列相關(guān)檢驗(yàn)設(shè)備經(jīng)濟(jì)費(fèi)用相對(duì)較高，加之操作過(guò)程相對(duì)繁瑣復(fù)雜，導(dǎo)致應(yīng)用受限。但本研究在P16INK4A、Ki-67與CIN分級(jí)之間具體關(guān)系方面未作詳細(xì)探究，需作進(jìn)一步分析與探討。

綜上可知，P16INK4A、Ki-67 應(yīng)用于CIN 鑒別診斷中，與HPV 感染具有正相關(guān)關(guān)系，可在不影響診斷特異性基礎(chǔ)上顯著提高診斷準(zhǔn)確性、敏感性，可為臨床判斷CIN 病情程度、制定治療方案等提供有力參考依據(jù)，但P16INK4A、Ki-67及P16/Ki-67雙染檢測(cè)經(jīng)濟(jì)費(fèi)用較高，臨床應(yīng)用受限。

圖1 典型P16/Ki-67雙染陽(yáng)性細(xì)胞（免疫組化雙染染色×400）圖2 典型P16/Ki-67雙染陽(yáng)性細(xì)胞簇（免疫組化雙染染色×400）