鄧奔騰，楊振淮，邱芳華，楊澤填，李東曉

我國有關癌癥的健康問題日益凸顯，并成為實現中國醫(yī)療基本保障的重大負擔。據統(tǒng)計我國每年新增160 萬惡性腫瘤病人，因惡性腫瘤而死亡的病人近120萬人［1］。同多數國家一樣，乳腺癌亦是中國女性最常見的惡性腫瘤［年齡標化率（ASR）為21.6例/10 萬女性］，也是中國女性癌癥死亡的第六大原因（ASR 為5.7 例/10 萬女性）；我國乳腺癌女性病人的均齡為45～55 歲，且有年輕化的趨勢［2］。有鑒于此，乳腺癌早期篩查和診斷的臨床能力亟須提高。對于乳腺癌的早期篩查和診斷，不僅需要大眾媒體的健康保健宣傳，日常生活中還需增強女性病人有關乳腺自我查體的防范意識，但這靠“自摸”遠遠不夠。臨床上，早期乳腺癌的篩查缺乏腫瘤生化指標，常用的影像學檢查有乳腺鉬靶和高頻彩超，兩者各有其優(yōu)缺點，臨床上常常需聯合使用來避免漏診［3］。

在近年來對腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉移的相關研究中，許多潛在的新蛋白被發(fā)現與惡性腫瘤的形成及轉移有關。人源性多肽（DCD）為其中一種具有天然活性的多肽物質，由人類汗液中分離得到［4］。國外研究表明，在肝癌、結直腸癌、前列腺癌及其轉移等各種腫瘤中，發(fā)現DCD可能作為一種致癌基因蛋白［4-6］。本研究通過檢測DCD在乳腺癌及其癌周正常組織的表達，分析其表達情況與病例資料之間的關聯。初步討論DCD作為乳腺癌診斷生物學標志物的可能性，為乳腺癌的早期篩查及診斷提供新的方式。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選用2018 年6 月至2019 年1 月于廣州中醫(yī)藥大學附屬廣州中醫(yī)院乳腺外科行乳腺癌手術的切除標本48例，取各例癌組織及其癌周正常乳腺組織分為兩組：實驗組和對照組。同時收集和記錄病人的病例資料，如年齡、絕經、臨床分期、腫瘤長徑、淋巴結轉移、病理類型及分化程度等。本研究符合《世界醫(yī)學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.1.1 納入標準 （1）符合診斷：術中或術后病理學檢查確診為原發(fā)性乳腺癌且為初發(fā)者；（2）病人知情同意。

1.1.2 剔除標準 （1）乳腺癌合并其他癌癥者；（2）既往病史中曾行內分泌、激素治療或放化療者。

1.2 蛋白質印跡法（WB）檢測 收集48 例手術切除標本，含癌組織和正常組織標本。實驗步驟如下。

1.2.1 總蛋白的提取 剪取約0.1 g組織樣品，快速放進預冷過的勻漿器中，按1∶10比例加入含苯甲基磺酰氟（PMSF）的裂解液，低溫下勻漿直至組織消后將樣品抽到1.5 mL EP 管中，12 000×g相對離心力（RCF）、4 ℃離心10 min（冷凍高速離心機，珠海黑馬，型號TGL-16R），取上清即為所提總蛋白。

1.2.2 總蛋白的保存 將提取的總蛋白加入5×上樣緩沖液（2∶1），升至100 ℃持續(xù)5 min。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 WB 檢測蛋白的表達 （1）十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）制作：①將玻璃板與制膠架組裝好，挑選恰宜濃度的分離膠（參考DCD分子量），將四甲基乙二胺（TEMED）添至配置好的分離膠后馬上搖勻、灌膠（留約1.5 cm的高度做濃縮膠），加入400 μL蒸餾水使分離膠面平整成直線，當水與膠之間能夠看到一條很明顯的折線時表明已充分凝固，接著去除膠上層水分即可。②配5%的濃縮膠，添至TEMED 后馬上搖動均勻，在剩余空間內需要將濃縮膠鋪滿，并將梳子插入其中；濃縮膠凝固后，雙手豎直輕拔出梳子的兩邊，將其放入電泳槽中，放置電泳緩沖液（內槽液面需高于膠），用移液器輕輕吹打每個樣品孔，排出碎膠、雜物等。

（2）電泳：吸取10 μL 樣品緩緩添至樣品孔后，于80 V 下進行濃縮膠電泳，當指示劑跑到分離膠后，110 V恒壓下指示劑即將跑出時終止儀器，取下凝膠轉膜。

（3）轉膜：剪取大小適合的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜和4張濾紙，取前者浸于甲醇中5 min后，與濾紙、海綿共同泡在轉移緩沖液中；于近極端（黑色）轉移裝置上依次疊放海綿、兩層濾紙、膠、膜、兩層濾紙、海綿；350 mA 轉膜300 min（大分子樣品可適當延長時間）。

（4）孵育抗體：把膜浸在封閉液中，恒溫37 ℃持續(xù)1～2 h；將膜取出后直接放入一抗中，恒溫37 ℃孵育1 h；洗滌液（PBST）洗膜，5 min×4次；將膜轉入二抗中，恒溫37 ℃孵育40 min；PBST洗膜，5 min×5次；使用化學發(fā)光法將膜顯影即可。

經上述步驟后，利用Image J 軟件進行WB 條帶灰度分析，檢測樣品灰度值與內參比值。

1.3 免疫組織化學（IHC）染色 收集48 例手術切除標本，包括癌組織及癌周正常組織標本。經組織切片后脫蠟、抗原修復、3%過氧化氫室溫濕盒孵育、一抗4 ℃孵育過夜、二抗室溫濕盒30 min、DAB顯色、蘇木素復染、封片、顯微鏡觀察及拍照等。

結果判斷：DCD在癌細胞的胞質中表達，一般根據染色強度和廣度進行半定量評分。具體參考HSCORE評分［7］：即在雙盲下，由兩名病理專業(yè)的醫(yī)師分開對每張病理切片進行評定。對顯微鏡照片視野中的腫瘤細胞分類，分為棕褐色、棕黃色、淡黃色、藍色四種，分別對應強陽性、陽性、弱陽性及陰性。醫(yī)師需要人工掃描5 個高倍鏡視野（×200），由此計算每視野中各種染色強度的腫瘤細胞百分比，根據公式計算H-score＝∑Pi（i+1），i＝0、1、2、3。將在兩組的組織胞質中DCD 的表達評分值以中位數為界限，劃為低表達組（0～100），高表達組（≥100～300）。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0，計數資料用χ2檢驗，配對設計計量資料用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 WB 檢測 與正常組織DCD 表達（0.641±0.482）相比，WB 檢測發(fā)現癌組織中的DCD 表達（0.886±0.814）明顯上調（t＝5.330，P＜0.001），具體詳見圖1。

圖1 蛋白質印跡法（WB）檢測人源性多肽（DCD）在乳腺癌癌組織（T）與正常組織（N）中的比較

2.2 IHC檢測 DCD在乳腺癌組織，正常組織中有不同程度的表達；DCD 在癌組織中35 例高表達，13例低表達。而在對照組48 例正常組織中均為低表達，兩組差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝55.082，P＜0.001），見圖2。

2.3 DCD 的表達與臨床特征的關系 DCD在乳腺癌組織中的表達與其病例資料（年齡、絕經、臨床分期、腫瘤長徑、淋巴結轉移、病理類型、分化程度等）之間無明顯關聯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），如表1。

表1 人源性多肽（DCD）在48例乳腺癌組織中的表達與臨床病例特征之間的關系/例

3 討論

本實驗初衷在于使用WB 檢測、IHC 染色等方法，研究乳腺癌病人的癌組織及正常組織中DCD表達有無異同，分析其成為乳腺癌篩查及診斷的生物學標志物的可能性，為臨床提高早期乳腺癌篩查和診斷的能力。本實驗結果發(fā)現，與乳腺正常組織相比，在癌組織中通過WB檢查、IHC染色均能有效檢測出DCD的高表達，兩者差異有統(tǒng)計學意義。初步發(fā)現DCD 有望成為乳腺癌臨床診斷的生物學標志物。在前期本課題組成員邱芳華等［8］在原發(fā)性肝癌并腫瘤轉移的病人中發(fā)現血清中DCD 的表達高于未轉移組，而甲胎蛋白的表達水平與原發(fā)性肝癌是否出現轉移無明顯關聯，且與單獨使用血清甲胎蛋白檢測相比，對于原發(fā)性肝癌聯合檢測DCD及甲胎蛋白的臨床診斷效能更高，差異有統(tǒng)計學意義。因此我們提出猜想，腫瘤病人血清及癌組織中的DCD可能由癌細胞本身產生分泌，癌細胞轉移過程亦可能產生分泌，這不僅僅提示DCD可成為潛在的腫瘤生物學標志物，并有望通過血清學等臨床方法快速檢測，補充了乳腺癌早期篩查和診斷依賴影像學的不足，方便快捷的腫瘤生化檢測更有利于早期乳腺癌的篩查和診斷，值得臨床推廣使用。

近年來，DCD因其作為一種與腫瘤轉移相關的新蛋白，一直是國外研究的熱點。Brauer HA等［9］在乳腺癌病人中，發(fā)現DCD 表達水平上調；Bancovik J等［10］研究人員通過熒光原位雜交（FISH）檢測初步證明了乳腺癌組織中的DCD表達與乳腺癌HER2基因擴增相關，影響其組織分化程度的分級，并且通過動物造模實驗使DCD表達水平降低，減緩了癌細胞的繁殖，加快癌細胞的凋亡程序，使免疫缺陷的動物模型減少癌變的可能性，探討了在乳腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉移的過程中DCD可能作出影響的機制；Stewart GD等［11］在前列腺癌細胞中發(fā)現，在缺氧或應激等條件下DCD表達上調的比缺乏增生抑制因子（PIF）序列的癌細胞更具生存優(yōu)勢，說明了DCD 及PIF 的表達均可能有利于對癌細胞的生存及繁殖。

目前，國內各大研究所對于DCD 在癌癥發(fā)生、發(fā)展及轉移等過程中的研究較少。DCD及其功能、相關通路的機制，以及蛇葡萄素、華蟾素等祖國中草藥提取物影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉移等的研究為本課題組致力鉆研的方向。本課題組前期在肝癌發(fā)生轉移的實驗中，通過體內外研究發(fā)現DCD-銜接蛋白（Nck）與肝癌及其侵襲轉移的關系，明確了DCD-Nck-Wiskott-Aldrich 綜合征蛋白（WASP）-肌動蛋白相關蛋白2/3復合體（Arp2/3）信號通路的形成，篩選環(huán)狀RNA（circRNA）并明確其對DCD-Nck 信號通路的調控［8，12］。劉麗芳等［13］在研究蛇葡萄素對DCD-Nck信號通路的影響中發(fā)現，蛇葡萄素能有效抑制癌細胞侵襲活力，降低腫瘤基因表達，從而減緩腸癌、肝癌發(fā)生轉移。本課題組將在接下來的研究中，利用IHC 染色及WB 檢測等方法觀察DCD，Nck，神經Wiskott-Aldrich 綜合征蛋白（N-WASP），Arp2/3 這4個蛋白是否在乳腺癌組織中表達，試圖研究乳腺癌的發(fā)生，剖析其轉移的機制，并通過移植性人乳腺癌轉移裸鼠的體內外研究，嘗試解析華蟾素能否通過DCD信號通路減緩乳腺癌的發(fā)生及轉移，并進一步揭示華蟾素抗癌及減緩乳腺癌侵襲轉移的分子機制，為其成為有效的抗腫瘤藥物提供理論基礎。

綜上所述，DCD 在乳腺癌組織中表達上調，因此研究DCD的表達及其信號通路在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉移過程中發(fā)揮的作用，有助于我們明確乳腺癌發(fā)生及轉移的機制，提高早期乳腺癌篩查和診斷的臨床能力，提供乳腺癌治療的新關鍵靶點。

圖2 人源性多肽（DCD）在乳腺癌組織和正常組織中的表達情況（免疫組織化學染色×200）：A為正常組織；B為癌組織