楊娟，郭麗娜，王單單，王瑞

流行病學(xué)研究證實(shí)，糖尿病病人高血壓的發(fā)病率顯著高于非糖尿病病人，40%～50%的2型糖尿病病人患有高血壓，而非糖尿病病人高血壓的發(fā)病率為20%，當(dāng)糖尿病合并廣泛腎損害時(shí)，幾乎100%患有高血壓［1］。經(jīng)典名方“三草降壓湯”即能降低糖尿病合并高血壓病人的血壓，也能有效改善血糖、血脂水平，達(dá)到滋養(yǎng)肝陰、平抑肝陽的療效［2］，主要有夏枯草、益母草和龍膽草組成。夏枯草是唇形科植物夏枯草（Prunella Vulgaris L.）的干燥果穗，主要含有黃酮類、酚酸類、三萜及其苷類、固醇及其苷類、揮發(fā)油等成分，具有降血糖、降血壓、抗菌、抗炎、抗病毒等生物活性［3］；益母草是唇形科植物益母草［Leonurusartemisia（Lour.）S.Y.Hu］的新鮮或干燥的地上部分，主要含有生物堿類、二萜類、環(huán)形多肽類、黃酮類等成分，具有溶栓、降血脂、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載等藥理作用［4］；龍膽草（Gentiana scabra Bunge.）是龍膽科龍膽屬多年生草本植物條葉龍膽等的根和莖，主要含有苷類、生物堿類、黃酮類等成分，具有利尿、抗菌、抗腫瘤的藥理活性。然而三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓的活性成分和分子作用機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，本研究于2019年3—5月從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的視角，采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊托盘柾犯患治鋈萁祲簻固悄虿『喜⒏哐獕簼撛诘姆肿訖C(jī)制，為三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓的進(jìn)一步探索提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 TCMSP 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（http：//ibts.Hkbu.Edu/.hk/ LSP/ tcmspsearch/），CTD毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org/），TTD藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/），DrugBank生物信息學(xué)和化學(xué)信息學(xué)數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/），PharmGKB 遺傳藥理數(shù)據(jù)庫（https：//www.pharmgkb.org/），DAVID 生物信息學(xué)資源數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），String 在線分析平臺（https：//string-db.org/），UniprotKB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），OmicShare在線作圖軟件（https：//www.omicshare.com/user/invite.php/），Cytoscape 3.7軟件，軟件均運(yùn)行于Windows操作系統(tǒng)平臺。使用的相關(guān)軟件均為免費(fèi)開源軟件。

1.2 方法

1.2.1 三草降壓湯活性成分及其靶點(diǎn)篩選 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺TCMSP 主要預(yù)測中藥及其復(fù)方化學(xué)成分的吸收、分布、代謝和排泄?；贑TD、TCMSP和中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫搜索三草降壓湯相關(guān)化學(xué)成分174個(gè)，夏枯草60個(gè)，益母草51個(gè)，龍膽草63個(gè)。結(jié)合PubMed、中國知網(wǎng)、萬方等數(shù)據(jù)庫報(bào)道，根據(jù)藥物代謝動力學(xué)相關(guān)參數(shù)把藥物口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和藥物相似性（Drug Similarity，DL）≥0.18 作為三草降壓湯活性成分篩選的條件，一般認(rèn)為生物利用度越大其生物利用度越好，DL≥0.18 的分子類藥性較好［5］。篩選三草降壓湯中出符合條件的化合物，分別采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫和Uniprot 數(shù)據(jù)庫獲得符合條件化合物的作用靶點(diǎn)和相關(guān)靶點(diǎn)人的基因名稱。

1.2.2 糖尿病合并高血壓相關(guān)靶點(diǎn)檢索 CTD、TTD、DrugBank 和PharmGKB 數(shù)據(jù)庫是公認(rèn)的疾病靶點(diǎn)在線數(shù)據(jù)庫，能夠提供基因和有關(guān)化合物相互作用的網(wǎng)絡(luò)模型，化學(xué)成分與基因的關(guān)系以及化學(xué)成分在體內(nèi)運(yùn)輸和積累的數(shù)據(jù)庫。打開每個(gè)數(shù)據(jù)庫，分別將“diabetic mellitus”“hypertension”作為檢索詞在數(shù)據(jù)庫檢索，獲得與糖尿病合并高血壓相關(guān)的作用靶點(diǎn)。

1.2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 分別將獲得的三草降壓湯的相關(guān)靶點(diǎn)和糖尿病合并高血壓的相關(guān)靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.7 軟件，依次生成“成分-靶點(diǎn)”和“疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，采用Cytoscape 3.7 軟件的Merge 插件合并“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖和“疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，刪除重復(fù)的靶點(diǎn)和邊，獲得“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，初步獲得三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓的潛在共同作用靶點(diǎn)。

1.2.4 共同作用靶點(diǎn)的相互作用研究 將三草降壓湯活性成分和糖尿病合并高血壓的共同作用靶點(diǎn)輸入String 在線分析平臺，選擇多倍蛋白，生成“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互作用關(guān)系（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。PPI是尋找靶點(diǎn)之間相互作用關(guān)系的重要途徑，能夠反應(yīng)蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。

1.2.5 GO 富集分析 DAVID 生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫主要基于WEB服務(wù)器進(jìn)行基因功能富集分析，是在線的功能注釋系統(tǒng)。其主要包括分析工具和生物學(xué)知識庫，可用于靶點(diǎn)功能、信息通路、疾病分析等。將共同作用靶點(diǎn)輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫中，以人的基因作為背景進(jìn)行GO富集分析。

1.2.6 KEGG通路富集分析 采用DAVID生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫中的京都基因和基因組百科全書通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway，KEGG）分析和輸入靶點(diǎn)有關(guān)的生物信息通路，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對靶點(diǎn)和相關(guān)生物信息通路進(jìn)行分析。可以根據(jù)P＜0.05且生物信息通路中靶點(diǎn)的數(shù)量為2個(gè)或2個(gè)以上為重要通路，進(jìn)而重點(diǎn)分析。因此通過DAVID生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫對三草降壓湯活性成分和糖尿病合并高血壓的72共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析。分析結(jié)果以P＜0.05 且生物信息通路中靶點(diǎn)數(shù)量≥2的為顯著的通路。

2 結(jié)果

2.1 三草降壓湯活性成分篩選 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫共獲得174 個(gè)三草降壓湯的已知成分，夏枯草成分有60 個(gè)，益母草成分有51 個(gè)，龍膽草成分有63個(gè)；其中OB≥30%的成分有61個(gè)，占總成分35.06%；DL≥0.18 的有113 個(gè)，占總成分64.94%。符合OB≥30%和DL≥0.18 條件化合物共有28 個(gè)，占總成分16.09%，這28個(gè)成分的口服生物利用度和類藥性良好，刪除4 個(gè)重復(fù)成分。此外龍膽酸和四乙酰龍膽苦苷沒有檢索到相關(guān)靶點(diǎn)。因此，本研究共納入三草降壓湯的22個(gè)成分作為候選化合物，見表1。

2.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)分析 基于CTD、TCMSP和中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫共篩選出三草降壓湯活性成分作用靶點(diǎn)247個(gè)。通過查找CTD在線數(shù)據(jù)庫，獲得糖尿病合并高血壓相關(guān)的作用靶點(diǎn)，刪除重復(fù)的靶點(diǎn)后，共獲得731個(gè)與糖尿病合并高血壓有關(guān)的靶點(diǎn)，此731個(gè)靶點(diǎn)是糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)和高血壓相關(guān)靶點(diǎn)之和。采用Cytoscape 3.7 軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，直觀的展現(xiàn)活性成分、靶點(diǎn)和疾病的相互作用關(guān)系，如圖1 所示。圖1 中圓形代表三草降壓湯的化學(xué)成分，正方形代表作用靶點(diǎn)，三角形代表疾病，節(jié)點(diǎn)代表活性成分或者作用靶點(diǎn)，邊代表活性成分和作用靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，節(jié)點(diǎn)的大小與對應(yīng)成分的重要程度成正相關(guān)，節(jié)點(diǎn)越大該成分的重要程度越顯著。分析“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)：槲皮素的作用靶點(diǎn)最多，為143 個(gè)；山柰酚、木樨草素、β-谷甾醇、花生四烯酸、半日花烷型二萜的潛在作用靶點(diǎn)數(shù)次之，分別為57、53、35、34、31個(gè)；7-豆甾-烯醇、豆甾醇葡萄糖苷、甜菜黃嘌呤Ⅰ的潛在作用靶點(diǎn)最少，均為2 個(gè)。三草降壓湯活性成分和糖尿病合并高血壓共同的作用靶點(diǎn)共有75個(gè)，如圖1 中間所示，包括白細(xì)胞介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、腫瘤壞死因子（TNF）等。說明了中藥一成分多靶點(diǎn)及一靶點(diǎn)多成分的復(fù)雜作用關(guān)系，驗(yàn)證了三草降壓湯多成分、多靶點(diǎn)整體協(xié)作發(fā)揮作用的特點(diǎn)。

2.3 靶點(diǎn)相互作用關(guān)系分析 通過String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建三草降壓湯活性成分作用靶點(diǎn)和糖尿病合并高血壓病共同作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。除了PDE3A（磷酸二酯酶3A）、TRPM5（味覺相關(guān)蛋白）和KCNU1（T 淋巴細(xì)胞分化蛋白）以外，IL-6、SOD1、TNF等72 個(gè)共同作用靶點(diǎn)關(guān)系緊密，因此PDE3A 不再納入研究。靶點(diǎn)之間相互作用關(guān)系見圖2。

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)GO 富集分析 采用DAVID 數(shù)據(jù)庫的GO 富集分析功能，對三草降壓湯和糖尿病合并高血壓的72 個(gè)共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析。分析結(jié)果如圖3，4 所示，共獲得到318 個(gè)GO 條目，其中包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝、免疫應(yīng)答、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)等243條生物過程（Biological Process，BP），細(xì)胞結(jié)合、受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、細(xì)胞因子活性、脂質(zhì)結(jié)合、蛋白結(jié)合等33 條分子功能（Molecular Function，MF），細(xì)胞間隙、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器膜等42 條細(xì)胞組成（Cell Component，CC）。說明72 個(gè)共同作用靶點(diǎn)參與細(xì)胞的組成并影響細(xì)胞的功能，調(diào)控其中一個(gè)或多個(gè)作用靶點(diǎn)就可以影響相應(yīng)疾病發(fā)生和發(fā)展。

表1 三草降壓湯主要活性成分

圖1 三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓“成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖析：A為生物過程，B為分子功能，C為細(xì)胞組成

圖2 三草降壓湯活性成分共同作用靶點(diǎn)相互作用分析

圖3 三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓共同作用靶點(diǎn)GO高集分析各組分所占比例

圖4 三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓共同作用靶點(diǎn)GO富集分

2.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析 采用DAVID在線數(shù)據(jù)庫對三草降壓湯和糖尿病合并高血壓的相同靶點(diǎn)進(jìn)行信號通路注釋，得到靶點(diǎn)參與的所有信號通路36條。信號通路以P＜0.05且通路中靶點(diǎn)的個(gè)數(shù)≥3 個(gè)的為顯著通路。共富集得到21 條顯著通路，主要包括癌癥信號通路、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子受體相互作用、脂肪因子信號通路、小細(xì)胞肺癌、T細(xì)胞受體信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路、Toll 樣受體信號通路等。癌癥信號通路中有23個(gè)作用靶點(diǎn)，基因在細(xì)胞因子受體相互作用有12個(gè)作用靶點(diǎn)，信號通路包含關(guān)鍵靶點(diǎn)個(gè)數(shù)如表2所示。一個(gè)基因參與多條信號通路，如圖5所示，八邊形代表信號通路，菱形代表參與信號通路的靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)的大小越大則該節(jié)點(diǎn)越重要，邊代表兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的聯(lián)系。表明這些通路之間相互影響，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，影響細(xì)胞的增殖、分化、代謝、凋亡等多種生物學(xué)功能。

圖5 三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓“信號通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為糖尿病屬于“消渴病”的范疇，飲食不節(jié)、過食辛辣厚味的食物均能夠?qū)е缕⑽笣駸醿?nèi)生、胃腸結(jié)熱、熱邪傷陰，最后演變成“消渴病”［6］。糖尿病的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，主要有血流動力學(xué)改變、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、多通路激活等多個(gè)方面，如長期高糖刺激下，糖基化終產(chǎn)物增多，從而激活蛋白激酶C（PKC）、核因子κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等一系列相關(guān)信號通路，進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等信號通路，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成［7］。研究報(bào)道，細(xì)胞核核內(nèi)荷爾蒙受體（PPARs）屬于核受體家族的亞族，通過與相應(yīng)配體結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在肥胖、胰島素抵抗、冠心病等代謝性疾病的發(fā)生及發(fā)展中具有重要作用。據(jù)流行病學(xué)研究報(bào)道，C 反應(yīng)蛋白（CRP）和高血壓等心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系，認(rèn)為他是一個(gè)被低估而未利用的心血管病的危險(xiǎn)因子［8］。糖尿病病人持續(xù)的高血糖將刺激IL-6分泌增加，從而導(dǎo)致大量的CRP產(chǎn)生。中醫(yī)藥在治療糖尿病及其并發(fā)癥等慢性疾病方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。三草降壓湯既能有效改善血糖又能調(diào)節(jié)血壓，對糖尿病合并高血壓具有較好的治療作用。發(fā)現(xiàn)三草降壓湯中化學(xué)成分顯著程度較顯著的有槲皮素、山柰酚、木樨草素、β-谷甾醇、花生四烯酸、半日花烷型二萜等。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素是一種具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降壓、保護(hù)心血管、清除自由基等多種生物活性的多羥基黃酮類化合物［9-10］；山柰酚是具有抗氧化、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性的黃酮醇類化合物［11］；木樨草素屬于四羥基黃酮類化合物，是天然黃酮類化合物的代表性成分，具有抗腫瘤、抗炎、降血壓、舒張血管、抗動脈粥樣硬化、抗菌抗病毒等多種藥理活性［12-13］；花生四烯酸是一種重要的人體必需脂肪酸，具有促進(jìn)腦生長發(fā)育、舒張血管、參與造血、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌等生物學(xué)功能［14-17］。

表2 三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓21條顯著信號通路

本研究獲得三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓的72 個(gè)靶點(diǎn)，其中腫瘤抑制蛋白（TP53）、細(xì)胞核因子κB p65蛋白（RELA）、表皮生長因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）、白細(xì)胞介素-1B（IL-1B）、糖原合成酶激酶（GSK3B）、TNF、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因（BCL2）在網(wǎng)絡(luò)圖中的顯著性比較大，預(yù)測可能是三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓的關(guān)鍵靶點(diǎn)。關(guān)鍵靶點(diǎn)參與2型糖尿病、小細(xì)胞肺癌、癌癥信號通路、脂肪細(xì)胞因子信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路等21條通路。其中2型糖尿病、脂肪細(xì)胞因子信號通路、癌癥信號通路在網(wǎng)絡(luò)圖中的顯著性較大，可能在三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓中發(fā)揮重要作用。網(wǎng)絡(luò)圖中靶點(diǎn)之間復(fù)雜的作用關(guān)系，表明靶點(diǎn)之間相互作用、相互影響，最終影響疾病的發(fā)生發(fā)展。通過共同作用靶點(diǎn)通路富集分析發(fā)現(xiàn)即富集了脂肪因子信號通路等與糖尿病有關(guān)的信號通路，又富集了小細(xì)胞肺癌、癌癥等多條信號通路。預(yù)示著疾病之間是相互作用、相互影響、相互關(guān)聯(lián)的。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)地探討了三草降壓湯糖尿病合并高血壓的復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，體現(xiàn)了三草降壓湯是通過“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的整體協(xié)同發(fā)揮療效。為深入研究三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓的分子機(jī)制提供依據(jù)，也為研究三草降壓湯抗糖尿病合并高血壓的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供借鑒。