李曉琳，劉永欣

在急性心肌梗死（AMI）病人發(fā)病過(guò)程中，炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要作用，冠狀動(dòng)脈斑塊纖維帽破裂后，壞死的組織會(huì)釋放炎性因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)，致使血小板聚集，導(dǎo)致血栓發(fā)生，最終引發(fā)AMI［1-2］。AMI 發(fā)生后，心肌細(xì)胞缺氧、壞死，導(dǎo)致心肌發(fā)生纖維化改變，進(jìn)而引發(fā)心肌重構(gòu)［3］。此外，AMI 發(fā)生后，冠狀動(dòng)脈處于阻塞狀態(tài)，心肌細(xì)胞缺氧、缺血而壞死，并釋放出細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生，引發(fā)心肌纖維化改變。心肌發(fā)生纖維化改變后，室壁張力增大，可加速心功能受損［4-5］。因此，對(duì)于AMI病人，臨床通常會(huì)予以抗炎癥反應(yīng)、心肌纖維化改變方面的干預(yù)，其中，他汀類藥物被廣泛應(yīng)用，以往研究多側(cè)重他汀類藥物對(duì)心肌炎癥的作用，關(guān)于他汀類藥物抗纖維化、抗炎纖維化方面機(jī)制的研究則相對(duì)較少。為進(jìn)一步探討阿托伐他汀對(duì)AMI 大鼠模型心肌炎癥、纖維化改變的影響及可能機(jī)制，本研究于2017年6月至2018年1月以大鼠為對(duì)象，分為三組展開(kāi)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 （1）大鼠。選取雄性大鼠70只，購(gòu)于北京維通利化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（京）2008—0003。級(jí)別為SPF級(jí)，體質(zhì)量范圍為（210.23±25.76）g，圈養(yǎng)，飼料、水定時(shí)添加，飼養(yǎng)室溫度控制為22～24 ℃，濕度控制為45%～55%。本研究符合一般動(dòng)物試驗(yàn)倫理學(xué)要求。

（2）試劑與設(shè)備。阿托伐他汀購(gòu)于輝瑞制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)為20160402。Masson 混合染色液：1.0 g 麗春紅，0.5 g 酸性復(fù)紅，150.0 mL 冰醋酸（0.25%），1.0 g 橙黃，混勻。甲苯胺藍(lán)染色液：0.2 g甲苯胺藍(lán)，于200.0 mL醋酸（0.2%）中溶入。蘇木精-伊紅（HE）染色：蘇木素，A 液，于10.0 mL 無(wú)水乙醇中溶入1.0 g 蘇木素；B 液，于200.0 mL 蒸餾水中溶入20.0 g硫酸鋁鉀；混合A液、B液，置入水浴鍋中加熱至沸騰，將0.5 g黃色氧化汞加入，混勻，可見(jiàn)溶液為深紫色后，迅速于冷水中置入，以紗布過(guò)濾，棄沉渣。使用前，于其中加入冰醋酸4.0 mL。伊紅：于100.0 mL乙醇（95%）中加入1.0 g伊紅，混勻，通過(guò)紗布過(guò)濾，棄沉渣。甲醛編號(hào)為100100008，甲醇編號(hào)1000141108，無(wú)水乙醇編號(hào)是10009218，均由上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。1%的鹽酸乙醇由100.0 mL乙醇（75%）中加入1.0 mL鹽酸制取。甲醛溶液購(gòu)于湖南爾康制藥股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)為1 326064；Notch1 單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)CST 公司，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)abcom公司。

1.2 研究方法

1.2.1 建模方法 實(shí)驗(yàn)前12 h，大鼠均禁食，麻醉后，于頸部、胸前進(jìn)行備皮，固定大鼠頭部、四肢，使其腹部朝上，消毒處理手術(shù)區(qū)域。通過(guò)鑷子將頸部正中的皮膚提起，剪開(kāi)，注意避開(kāi)甲狀腺，對(duì)頸部的肌肉展開(kāi)鈍性分離處理，牽拉使氣管暴露，牽拉大鼠舌頭使聲門暴露，行氣管插管予以輔助呼吸。對(duì)大鼠胸前手術(shù)區(qū)域?qū)嵤┫咎幚?，作一橫切口于左側(cè)胸部第3、4 肋間，分離肌肉層，撐開(kāi)胸腔，確定心臟位置，撕開(kāi)心包膜，暴露心臟，確定左冠狀動(dòng)脈前降支位置，經(jīng)左心耳下2～3 mm 處置入6-0 帶針線穿過(guò)前降支，對(duì)前降支進(jìn)行結(jié)扎，處理胸腔，縫合切口，將氣管插管拔出，等待大鼠結(jié)扎。本研究共對(duì)70只大鼠進(jìn)行建模，死亡4只，成功率為94.29%（66/70），最終選擇較為成功的60只進(jìn)行研究。

1.2.2 大鼠分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為三組。對(duì)照組：建模時(shí)僅為前降支進(jìn)行分離，未結(jié)扎；AMI組：對(duì)前降支進(jìn)行分離與結(jié)扎；治療組：對(duì)前降支進(jìn)行分離與結(jié)扎后，予以阿托伐他汀，10 mg/d［6］。

1.2.3 觀測(cè)指標(biāo) 觀測(cè)指標(biāo)為 （1）炎性因子：腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β），（2）超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果，（3）病理學(xué)診斷結(jié)果，（4）Notch1蛋白、TGF-β水平。方法分別為：

（1）炎性因子及Notch1蛋白、TGF-β水平。實(shí)驗(yàn)后5 d，于大鼠內(nèi)眥處采集血液1.0 mL，置入試管，通過(guò)離心機(jī)實(shí)施離心處理，4 000 r/min，吸取1.0 μL上層血清，保存于-80 ℃環(huán)境中。取250.0 μL 大鼠炎性因子標(biāo)準(zhǔn)品，加入等量稀釋液。將250.0 μL 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液加入EP管內(nèi)，通過(guò)高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)施1∶1 稀釋，15 min 內(nèi)，分別將50.0 μL 檢測(cè)緩沖液、樣本加入，并于每個(gè)樣本孔中加入50.0 μL的稀釋液，于室溫內(nèi)孵育2 h，并進(jìn)行6次洗滌。對(duì)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶親和素進(jìn)行稀釋后，分別加入至每個(gè)樣本孔內(nèi)，100.0 μL，于室溫下進(jìn)行45 min 孵育，洗滌6次。分別于每個(gè)樣本孔中加入100.0 μL顯色底物，于室溫下孵育30 min，依據(jù)顯色情況加入終止液，100.0 μL，30 min 內(nèi)，于450 nm 波長(zhǎng)上對(duì)吸光度（OD）值進(jìn)行檢測(cè)。

（2）超聲心動(dòng)圖檢查。通過(guò)Vevo2100超高分辨小動(dòng)物超聲影響系統(tǒng)實(shí)施檢查，主要觀察心臟形態(tài)，并測(cè)定左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸短縮率（LVFS）。

（3）病理學(xué)檢查。安樂(lè)死處理大鼠，取出其心臟組織，置入10%的甲醛溶液中，30 d，通過(guò)石蠟包埋處理。①HE 染色。取4 μm 的切片，通過(guò)二甲苯實(shí)施兩次脫蠟處理，每次5 min，以100%的乙醇進(jìn)行2 min 清洗，再分別以95%乙醇、80%乙醇清洗1 min，采用蒸餾水清洗2 min。通過(guò)蘇木素進(jìn)行5 min的染色處理，以自來(lái)水沖洗，于鹽酸乙醇中提插30 s，置入59 ℃溫水中，5 min 后取出，吸干水，置入伊紅液中，2 min，于95%乙醇中浸泡2 次，每次5 min，置入100%乙醇中，浸泡1 min，置入3∶1的二甲苯石碳酸中浸泡1 min，于二甲苯中浸泡2 次，每次1 min，取出，以中性樹(shù)脂進(jìn)行封固。②Masson 染色。取切片4 μm，分別以自來(lái)水、蒸餾水清洗，置入Masson復(fù)合染液中，15 min，采用0.2%的醋酸進(jìn)行1 min清洗，通過(guò)0.1%磷塢酸進(jìn)行4 min 分化處理，以0.2%冰醋酸清洗2 次，共1 min，浸入甲苯藍(lán)染染液中，10 s，取出以清水沖洗，以0.2%冰醋酸清洗2次，共1 min，分別以95%乙醇、無(wú)水乙醇沖洗，以二甲苯實(shí)施透明處理，采用中性的樹(shù)膠進(jìn)行封固。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所涉及數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS 20.0 軟件處理。以表示計(jì)量資料，多組間比較為單因素方差分析+多重比較LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組炎性因子及超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果比較整體分析（單因素方差分析）和多重比較（LSD-t 檢驗(yàn)）知：各指標(biāo)整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AMI組、治療組大鼠TNF-α、IL-1β水平高于對(duì)照組，治療組大鼠TNF-α、IL-1β 低于AMI 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AMI組、治療組大鼠LVEF、LVFS均低于對(duì)照組，且治療組高于AMI組。詳見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)后，AMI 組、治療組大鼠左室室壁均較對(duì)照組變薄、運(yùn)動(dòng)減弱，見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)比三組病理學(xué)檢查結(jié)果 （1）HE 染色。HE染色下，對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，可見(jiàn)清晰的閏盤結(jié)構(gòu)；AMI 組梗死區(qū)顯著較薄，心肌細(xì)胞減少，可見(jiàn)纖維細(xì)胞，細(xì)胞排列紊亂；治療組介于對(duì)照組、AMI組之間。見(jiàn)圖2。

表1 三組大鼠炎性因子及超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果比較/

表1 三組大鼠炎性因子及超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果比較/

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白細(xì)胞介素-1β，LVEF為左室射血分?jǐn)?shù)，LVFS為左室短軸短縮率。a、b分別為與對(duì)照組、AMI組相比，P＜0.05

（2）Masson 染色。對(duì)照組大鼠可見(jiàn)心肌組織正常，膠原纖維分布不明顯；AMI組梗死區(qū)可見(jiàn)大量膠原纖維組織，室壁較薄；治療組可見(jiàn)少量膠原纖維分布。見(jiàn)圖3。

2.3 對(duì)比三組Notch1蛋白、TGF-β水平 AMI組、治療組Notch1蛋白、TGF-β水平較對(duì)照組高，治療組Notch1蛋白、TGF-β水平低于AMI組，見(jiàn)圖4。

3 討論

既往臨床上多將AMI 歸類為代謝類疾病，甚少考慮炎癥病變，但在AMI病情發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過(guò)程中，心肌炎癥反應(yīng)均有參與［7］。正常情況下，心臟中有定居型、聚集型的巨噬細(xì)胞存在，AMI 發(fā)生后，定居型的巨噬細(xì)胞會(huì)增多，脾臟對(duì)聚集型巨噬細(xì)胞的釋放增多，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞于梗死區(qū)聚集，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致心肌損傷速度加快［8-9］。因此，對(duì)于AMI的干預(yù)，需注重抗炎、抗心肌纖維化等方面。研究指出，AMI發(fā)生48 h后，病人血液中單核細(xì)胞會(huì)大量分泌TNF-α、IL-1β，TNF-α、IL-1β由巨噬細(xì)胞合成，可對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，使其合成增多，致使大量炎癥細(xì)胞滲入心肌梗死部位，加重心肌損傷［10］。另有研究指出，TNF-α、IL-1β過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞毒性產(chǎn)生，導(dǎo)致心肌細(xì)胞重構(gòu)，致使大量膠原蛋白聚集于細(xì)胞外，即發(fā)生心肌纖維化改變，進(jìn)而導(dǎo)致心室變薄，心功能下降［11］。

本研究，AMI組、治療組大鼠TNF-α、IL-1β水平高于對(duì)照組。提示，急性AMI 伴有心肌炎癥反應(yīng)。本研究AMI組、治療組大鼠LVEF、LVFS均較對(duì)照組低。對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，心肌組織分布正常，AMI組大鼠心肌細(xì)胞減少、梗死區(qū)可見(jiàn)大量膠原纖維組織。本研究對(duì)大鼠進(jìn)行建模時(shí)，對(duì)AMI組、治療組大鼠前降支實(shí)施結(jié)扎處理，使前降支的血流被阻斷，導(dǎo)致前壁發(fā)生心肌梗死，因此行超聲心動(dòng)圖檢查時(shí)，可見(jiàn)AMI 組、治療組大鼠左心室的前壁變薄，心腔增大，心功能顯著下降。AMI發(fā)生后3～5 d即可發(fā)生心肌纖維化改變，其改變主要經(jīng)歷三個(gè)過(guò)程：其一，急性期，梗死的心肌區(qū)域內(nèi)大量中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞聚集，可清除壞死心肌細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬死亡的中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞分泌抗炎因子開(kāi)抑制炎癥；其二，增生階段，受損區(qū)域有大量成纖維、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，可形成瘢痕；其三，瘢痕形階段，細(xì)胞成分不斷凋亡，剩余的膠原基質(zhì)形成瘢痕［12-13］。因此，在病理學(xué)檢查中，AMI建模后大鼠梗死區(qū)顯著較薄，心肌細(xì)胞減少，可見(jiàn)纖維細(xì)胞，細(xì)胞排列紊亂，梗死區(qū)可見(jiàn)大量膠原纖維組織。進(jìn)一步提示，AMI發(fā)生后，大鼠心肌會(huì)發(fā)生纖維化改變，心功能下降。

本研究予以治療組大鼠阿托伐他汀后，治療組TNF-α、IL-1β 均低于AMI 組。提示，阿托伐他汀可對(duì)AMI大鼠心肌炎癥反應(yīng)、纖維化改變產(chǎn)生抑制作用。托伐他汀是一種臨床常用的他汀類藥物，而大量臨床研究表明，他汀類藥物不僅具有調(diào)脂、降血壓等作用，而且具有降低炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制左心室重構(gòu)等多方面的作用［14-15］。本研究，AMI組、治療組Notch1蛋白、TGF-β水平較對(duì)照組高，治療組Notch1蛋白、TGF-β水平低于AMI 組?？梢?jiàn)，AMI 發(fā)生后，大鼠Notch1 蛋白、TGF-β水平上升，經(jīng)予以阿托伐他汀干預(yù)后，Notch1蛋白、TGF-β水平下降，表明阿托伐他汀可降低水平Notch1蛋白、TGF-β水平。進(jìn)一步表明，在抑制AMI大鼠心肌炎癥反應(yīng)、心肌纖維化改變方面，阿托伐他汀可能通過(guò)以下兩個(gè)方面發(fā)揮機(jī)制：（1）阻斷Notch1信號(hào)通路。炎癥反應(yīng)的發(fā)生與notch1信號(hào)通路緊密相關(guān)，巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中，Notch1導(dǎo)致大量M1 型巨噬細(xì)胞分化，促使炎癥細(xì)胞因子釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)［16-17］。而阿托伐他汀可將Notch1信號(hào)通路阻斷，達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的效果，從而使心肌重構(gòu)減輕。（2）抑制TGF-β。TGF-β 在心肌重構(gòu)、心肌纖維化改變中有重要作用，可誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞遷移，激活促纖維化程序，阿托伐他汀可降低TGF-β水平，達(dá)到抑制心肌重構(gòu)反應(yīng)、纖維化改變的作用。在AMI大鼠中，通過(guò)上述兩方面的機(jī)制，阿托伐他汀可有效抑制炎癥，使纖維化改變減輕，進(jìn)而有效改善心功能。而阿托伐他汀抑制Notch1 信號(hào)通路、TGF-β的表達(dá)的機(jī)制可能為抑制Notch-1-TGF-β-smads 通路，使炎癥、纖維化指標(biāo)表達(dá)減少。

綜上，AMI伴有心肌炎癥反應(yīng)，且心肌會(huì)發(fā)生纖維化改變，而阿托伐他汀可對(duì)心肌炎癥反應(yīng)基纖維化改變產(chǎn)生抑制作用。但本研究所選大鼠樣本量不大，仍需進(jìn)一步增加樣本量展開(kāi)研究。

圖1 三組大鼠超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果：A為對(duì)照組；B為AMI組；C為治療組圖2 三組大鼠HE染色結(jié)果（×200）：A為對(duì)照組；B為AMI組；C為治療組圖3 三組大鼠Masson染色結(jié)果（×200）：A為對(duì)照組；B為AMI組；C為治療組圖4 三組Notch1蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）水平（蛋白質(zhì)印跡法）