張 旭 田召輝 郭 琳 婁永利

膠質瘤是顱內最常見的一種原發(fā)性惡性腫瘤， 呈彌漫性無限增殖，即使采用手術聯(lián)合放、化療等治療，預后仍不理想[1，2]。土木香內酯具有抗炎、抗氧自由基等藥理活性[3]。研究發(fā)現(xiàn)，土木香內酯通過消耗癌細胞內谷胱甘肽是促進活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，活化肝癌細胞內蛋白酶水解酶，進而誘導癌細胞凋亡[4]。抑制癌細胞增殖是抗癌的重要手段之一。癌細胞增殖涉及多種因子的調控，如周期素D1（cyclin D1）、c-Myc、周期素依賴激酶4（cyclin dependent kinase 4，CDK4）等[5]。另外，磷酸肌醇依賴激酶-1（phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）通路在細胞增殖中發(fā)揮重要作用[6～8]。本文探討土木香內酯對人膠質瘤U251細胞增殖、調亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及分組 人膠質瘤U251細胞（上海中國科學院）置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（上海經(jīng)科化學科技有限公司）中，在恒溫保養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對數(shù)期的U251細胞制成濃度為1×105/ml的混懸液，每孔100μl接種于96孔板中，培養(yǎng)至細胞完全貼壁后，以1:10將母液稀釋，制成100 μmol/L濃度，分別加入濃度為2.5、5、10μmol/L的土木香內酯（純度＞98%，20 mg/支，南京道斯夫生物科技有限公司）。同時設空白對照組。

1.2 U251細胞增殖抑制率的檢測 土木香內酯作用24 h后，每孔各加入20μl MTT溶液，4 h后停止培養(yǎng)，去上清。每孔加入二甲基亞砜溶液，使用搖床低速充分振蕩。測量吸光度（optic Density，OD）。細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%[9]。

1.3 U251細胞凋亡率的檢測 土木香內酯作用48 h后，離心5 min，去上清，制作單細胞懸液。在Annexin V-PI染色液中避光染色，采用流式細胞儀（Thermo公司）檢測細胞凋亡率。

1.4 U251 細胞 PDK1、Akt、GSK3β蛋白表達的檢測使用免疫印跡法檢測。加入緩沖液，加熱5 min，低溫離心5 min，裂解細胞，取上清液。使用BCA法測定蛋白濃度，使用濕轉法將目標蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，室溫下用脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗，4°C孵育過夜，使用PBST洗膜，加入二抗，室溫下孵育2 h后，ECL發(fā)光試劑顯影。對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參β-actin條帶灰度值[2]。

1.5 U251細胞c-Myc、CyclinD1 mRNA表達的檢測使用RT-PCR法進行檢測。在-80°C下研磨提取總RNA，將RNA反轉錄生成cDNA后，進行RT-PCR。用2-△△CT法計算c-Myc、CylinD1 mRNA的表達量[2]。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件處理，計量資料用x±s表示，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；P＜0.05認為具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 土木香內酯對U251細胞增殖抑制率的影響 隨土木香內酯濃度增加，OD值均明顯降低（P＜0.05），而細胞增殖抑制率明顯增高（P＜0.05）。見表1。

2.2 土木香內酯對U251細胞凋亡率的影響 隨土木香內酯濃度增加，細胞調亡率明顯增高（P＜0.05）。見圖1。

2.3 土木香內酯對U251細胞PDK1、Akt、GSK3β蛋白表達的影響 與空白對照組相比，木香內酯組U251細胞PDK1、Akt和GSK3β蛋白表達水平均無明顯差異（P＞0.05），但PDK1、Akt和GSK3β蛋白的磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

2.4 土木香內酯對U251細胞c-Myc、CyclinD1 mRNA表達的影響 隨著土木香內酯濃度的增加，c-Myc、CyclinD1 mRNA的表達水平明顯降低（P＜0.05）。見表2、圖3。

3 討論

膠質瘤具有高侵襲性、高異型性、對現(xiàn)有的化療藥物敏感性差等特點，術后極易復發(fā)，生存期短[10，11]。因此，尋找新的、有效的、副作用小的治療藥物，對抑制膠質瘤的疾病進展具有重要的臨床意義。

土木香內酯具有多種生物活性，對體外培養(yǎng)的肺癌細胞系和乳腺癌細胞，既能抑制細胞增殖，又誘細胞凋亡[12]。本文發(fā)現(xiàn)土木香內酯能有效抑制U251細胞的增殖，促進其凋亡。

PDK1/Akt/GSK3β信號通路在細胞增殖與凋亡中發(fā)揮著關鍵作用[8]。PDK1是PDK1/Akt/GSK3β信號通路中的關鍵分子[13～15]。研究表明，Akt信號通路參與誘導鱗癌細胞上皮間質轉化的發(fā)生，促進腫瘤細胞侵襲、轉移[6]。本文結果顯示，與空白對照組相比，土木香內酯組U251細胞PDK1、Akt和GSK3β蛋白的表達水平無差異（P＞0.05），但蛋白磷酸化水平均較明顯降低（P＜0.05）。可見，土木香內酯對U251細胞增殖、凋亡的調控可能與PDK1/Akt/GSK3β信號通路有關。

表1 各組人膠質瘤細胞U251吸光度值和增殖抑制率比較

表2 土木香內酯對人膠質瘤U251細胞c-Myc、CyclinD1 mRNA的表達影響

細胞增殖涉及多種因子，如c-Myc、CyclinD1、mTOR等[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，土木香內酯通過抑制CyclinD1的表達，阻滯細胞周期G1/S的轉換，進而抑制HS-5細胞及多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖[16]。本文結果表明，土木香內酯干預后，U251細胞c-Myc、CyclinD1 mRNA的表達水平均明顯降低（P＜0.05），且呈濃度依賴性（P＜0.05）。

綜上所述，土木香內酯抑制人膠質瘤U251細胞的增殖并促進其凋亡，其作用機制可能是通過調節(jié)PDK1/Akt/GSK3β信號通路及細胞周期因子的表達有關，且在一定范圍內呈濃度依賴性。