蔡小利，付麗云，郭蔚冰，陳志強(qiáng) *

(內(nèi)蒙古華天制藥有限公司 內(nèi)蒙古赤峰 024000)

在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中，隨著抗生素的大量使用，越來(lái)越多的細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，要想預(yù)防和治療動(dòng)物疾病，抗生素的使用劑量不斷加大，抗生素產(chǎn)生的耐藥性以及藥物殘留等相關(guān)問(wèn)題也會(huì)越來(lái)越突出。在所有的細(xì)菌中，大腸桿菌產(chǎn)生的耐藥性是非?？斓?，對(duì)很多的抗生素都具有耐藥性，在有些養(yǎng)殖場(chǎng)已經(jīng)到了不知選擇何種抗生素來(lái)應(yīng)對(duì)動(dòng)物大腸桿菌性疾病。隨著限抗令的頒布和實(shí)施，養(yǎng)殖業(yè)需要無(wú)抗低毒的抗生素替代品顯得愈加迫切。中藥在我國(guó)已經(jīng)應(yīng)用了幾千年，積累了大量的臨床資料，國(guó)內(nèi)的很多學(xué)者或者企業(yè)越來(lái)越重視如何從中藥中篩選出抗菌藥物[1]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，五倍子含有鞣質(zhì)、黃酮、蒽醌、沒食子酸等物質(zhì)，有效成分十分復(fù)雜，具有斂肺降火、止汗止血、抗菌解毒等多種生物學(xué)功能[2]。本實(shí)驗(yàn)選取五倍子水提取物進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)大腸桿菌抑菌效果和最低抑菌濃度的測(cè)定，篩選出應(yīng)用于臨床治療的中藥濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 五倍子購(gòu)自內(nèi)蒙古通遼某中藥店。

1.1.2 受試菌種由內(nèi)蒙古通遼市某腹瀉犢牛糞便分離鑒定，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)科院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自青島海博。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中藥水提取物的制備 分別稱取一定量的中藥原藥材，用中藥粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40 目篩，稱取20 g，加蒸餾水200 mL，用中藥煎藥器煎煮1h，倒出上清，再重新加水200mL繼續(xù)煎煮1h，取上清液和第一次合并，離心過(guò)濾補(bǔ)足蒸餾水最終為200mL，成原液濃度1 g/mL，用無(wú)菌濾器過(guò)濾藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的準(zhǔn)備 將大腸桿菌接種于5mL LB 液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，取0.1 mL 于普通瓊脂平板上培養(yǎng)12 h，用滅菌生理鹽水洗下菌落并稀釋，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板估測(cè)活菌數(shù)后稀釋至1.0×109cfu/mL，即為實(shí)驗(yàn)菌液。

1.2.3 中藥提取物抑菌作用的測(cè)定實(shí)驗(yàn)采用平皿打孔法[3]，吸取0.1mL 實(shí)驗(yàn)菌懸液，涂布于瓊脂平板表面，用6mm 打孔器在平板上均勻打孔，在孔內(nèi)滴加0.1mL 五倍子提取物，置37℃培養(yǎng)24 h 后測(cè)定抑菌直徑。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.2.4 最小抑菌濃度MIC 的測(cè)定采用微量細(xì)胞培養(yǎng)板倍比稀釋法，取無(wú)菌的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，從左至右依次標(biāo)記為1-12 號(hào)，于每孔加入肉湯培養(yǎng)液0.1mL，1 號(hào)孔加入上述制備的藥物0.1mL，2～10 號(hào)孔10 級(jí)倍比稀釋，11 號(hào)孔不加菌液，其余各孔加上述制備的菌懸液2.0μ L，使各孔的藥物最終濃度為：500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 和0.98 mg/mL 共10 個(gè)濃度梯度，12 號(hào)孔加不含藥物的基質(zhì)培養(yǎng)液作陰性對(duì)照，充分震蕩混勻后37℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，判斷無(wú)渾濁試管的最小濃度即判定為MIC。每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)平行孔。

2 結(jié)果

2.1 中藥提取物體外抑菌圈直徑的測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果顯示五倍子抑菌圈直徑為12.6mm，五倍子水提取物有顯著地抑菌效果。（判斷標(biāo)準(zhǔn)［4］：大于10 mm 為強(qiáng)抑制，8～10 mm 為抑制，小于8 mm 以下弱抑制）

2.2 中藥提取物最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果

采用倍比稀釋法對(duì)中藥水提取物進(jìn)行MIC 的測(cè)定。結(jié)果表明五倍子水提取物的MIC 為15.625 mg/mL，結(jié)果見表1。

表1 五倍子水提取物對(duì)大腸桿菌的MIC測(cè)定

3 討論

中藥在我國(guó)種類非常多，各種藥物合理配伍，不良反應(yīng)很少，對(duì)人和動(dòng)物的副作用比較小，價(jià)格表較便宜，不會(huì)產(chǎn)生耐藥性的問(wèn)題，不會(huì)產(chǎn)生藥物殘留，對(duì)環(huán)境不會(huì)形成污染，在目前減抗令頒布實(shí)施后成為臨床用藥的首選，得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視。中藥的抗菌作用主要是通過(guò)調(diào)理患者的功能狀態(tài)，而西藥則側(cè)重于藥物與微生物之間的相互作用得以實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)選用水煎煮方法對(duì)五倍子進(jìn)行提取分析，選用臨床致病分離的大腸桿菌作為研究對(duì)象，結(jié)果表明，五倍子水提物有顯著的抑菌效果，其最低抑菌濃度為15.625 mg/mL。中藥水提法臨床使用方便，不需要特殊的儀器設(shè)備，更便于基層推廣使用。

本實(shí)驗(yàn)選擇了臨床分離的致病菌，將致病菌與藥物直接接觸，沒有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因此不能證實(shí)藥物在體內(nèi)的功效，所以選擇中藥時(shí)既要考慮藥物的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還要綜合考慮中藥在體內(nèi)的效果，這樣才能使中藥發(fā)揮真正的功效。