付尚松　王莉爽　楊學輝　蔣選利

摘要：【目的】分析貴州辣椒主產(chǎn)區(qū)黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）分離物的分子變異情況，為抗病毒辣椒品種選育及辣椒病毒病的防控提供科學依據(jù)。【方法】以來自貴州省8個縣（榕江、大方、石阡、安龍、綏陽、德江、關(guān)嶺和惠水）的16個辣椒CMV分離物為材料，采用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應（RT-PCR）擴增辣椒CMV分離物的CP基因序列，利用DNAMAN和BioEdit對CMV分離物的CP基因序列進行比對分析，用MAGE 7.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，分析貴州辣椒CMV分離物的遺傳多樣性?！窘Y(jié)果】將16個貴州辣椒CMV分離物的CP基因核苷酸序列及編碼蛋白氨基酸序列與CMV亞組代表株系進行一致性比對，結(jié)果表明，貴州辣椒CMV分離物與CMV亞組分離物的CP基因核苷酸序列一致性為89.7%～100.0%、CP蛋白氨基酸序列一致性為96.8%～100.0%。系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，CMV-DF、CMV-RJ、CMV-SQ、CMV-SY、CMV-DJ與CMV I代表株系聚為一個亞支，但更趨近于CMV亞組IB株系，CMV-HS、CMV-GL、CMV-AL與CMV亞組Ⅱ株系聚為另一個亞支，說明侵染貴州辣椒的CMV株系有兩大組群，其中大方、榕江、綏陽、石阡和德江CMV分離物歸屬于CMV亞組IB株系，惠水、關(guān)嶺和安龍CMV分離物歸屬于CMV亞組Ⅱ株系。【結(jié)論】不同地域的貴州辣椒CMV株系發(fā)生了變異。

關(guān)鍵詞： 黃瓜花葉病毒;辣椒;CP基因;貴州

中圖分類號：? S436.421.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）01-0108-07

Abstract： 【Objective】The molecular variation of Cucumber mosaic virus（CMV） pepper isolates in the main produ-cing areas of pepper in Guizhou was analyzed to provide theoretical basis for the breeding of? antiviral pepper varieties and preventive measures of CMV infection. 【Method】Taking 16 pepper CMV isolates from 8 counties （Rongjiang， Dafang， Shiqian， Anlong， Suiyang， Dejiang， Guanling and Huishui） of Guizhou Province as materials， reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） amplification， cloning， sequencing and other methods were used to obtain the full length CP gene of CMV isolates from pepper. The DNAMAN and BioEdit were used to analyze and compare the CP gene sequence of CMV isolates. The adjacency algorithm of MAGE 7.0（Neighbor-joining， NJ） constructed a phylogene-tic tree and analyzed the genetic diversity of Guizhou pepper CMV isolates. 【Result】The CP nucleotide sequences and the amino acid sequences encoding the protein of 16 CMV isolates from Guizhou pepper were compared with the representative strains of CMV subgroup. The results showed that the nucleotides of CMV isolate and CMV subgroup isolate sequence identity was 89.7%-100.0%， amino acid identity was 96.8%-100.0%. Phylogenetic analysis showed that the CMV-DF， CMV-RJ， CMV-SQ， CMV-SY， CMV-DJ and CMV I representative lines were clustered into one subbranch， but closer to the CMV subgroup IB line; CMV- HS， CMV-GL， CMV-AL and CMV subgroup Ⅱ strains were clustered into another subbranch. These results showed that there were two major groups of CMV strains infected with pepper in Guizhou，? Dafang， Rongjiang， Suiyang， Shiqian and Dejiang CMV isolates belonged to CMV subgroup IB strain， Huishui， Guanling and Anlong CMV isolates belonged to CMV subgroup Ⅱ strain. 【conclusion】Variation happens on CMV Guizhou pepper isolates in different geographical origins.

Key words： Cucumber mosaic virus; pepper; CP gene; Guizhou

Foundation item： Guizhou Agricultural key Project（Qiankehezhicheng〔2016〕2567）

0 引言

【研究意義】黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的代表成員（丁超，2017）。貴州是辣椒種植大省，目前CMV已成為危害貴州辣椒的主要病毒種類之一，對貴州辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴重影響。CMV基因組序列的重排重組會影響CMV的株系分化，并影響CMV的傳播蔓延，因此，明確CMV辣椒分離物的亞組歸屬有利于揭示病毒的基因組分子變異、基因結(jié)構(gòu)與功能及系統(tǒng)進化關(guān)系，對研究CMV的分子變異、致病機理及貴州辣椒黃瓜花葉病毒病防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】采用抗原直接包被酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）（吳畏等，2014）、反轉(zhuǎn)錄—環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）（湯亞飛等，2016）、逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應（RT-PCR）（劉湘寧，2016）和高通量測序（馮耿等，2017）等均能檢測鑒定出病毒病的種類。周彤等（2012）采用RT-LAMP快速檢測到水稻黑條矮縮病毒（RBSDV）;王芳等（2015）利用siRNA高通量測序技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)安徽東至、宣城和亳州煙草上存在馬鈴薯Y病毒（PVY）、黃瓜花葉病毒（CMV）、煙草花葉病毒（TMV）、煙草脈帶花葉病毒（TVMBV）、蕓薹黃化病毒（BrYV）、蕪菁黃化病毒（TuYV）、甜菜西方黃化病毒（BWYV）及一種與Mint virus 1部分同源的新病毒;裴凡（2016）采用RT-PCR對廣東省多個地區(qū)125份辣椒樣品進行檢測，共檢測到18種病毒;陳靈芝等（2017）采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測出甘肅省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所辣椒含有煙草花葉病毒（TMV）、馬鈴薯V病毒（PVV）和馬鈴薯S病毒（PVS）;王少立（2018）采用RT-PCR檢測山東地區(qū)542份疑似病毒的辣椒樣品，共檢測到甜菜西方黃化病毒（BWYV）、南瓜蚜傳黃化病毒（CABYV）、辣椒脈黃化病毒（PeVYV）、辣椒潛隱病毒1（PCV-1）和辣椒潛隱病毒2（PCV-2）等5種病毒。其中，RT-PCR是一種應用廣泛的研究基因組序列多樣性的技術(shù)手段，該技術(shù)操作簡單、靈敏性強、檢測耗時短。黎微等（2008）應用RT-PCR、Msp I和EcoR I雙酶切及克隆測序等分子生物學手段對云南主要地區(qū)辣椒CMV分離物進行亞組鑒定，發(fā)現(xiàn)侵染云南辣椒的CMV主要為亞組Ⅰ。陳玉珍等（2016）采用RT-PCR檢測湖南永州辣椒CMV并進行序列分析，結(jié)果表明CMV-N7 CP及2b基因的核酸序列屬于CMV亞組IB。周東等（2017）利用RT-PCR克隆了新疆辣椒LJ-10 CMV的RNA1、RNA2和RNA3全基因組片段，其序列分析及系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，該分離物屬于CMV亞組IB?！颈狙芯壳腥朦c】前期對貴州CMV的報道主要是采用ELISA進行病毒種類檢測（王莉爽等，2015b），而采用RT-PCR能擴增出目的片段克隆測序，可用于分析比較貴州辣椒分離物與其他地區(qū)分離物的差異、進化及變異規(guī)律。目前，有關(guān)侵染貴州辣椒的CMV株系研究未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】運用RT-PCR擴增貴州不同辣椒主產(chǎn)區(qū)不同辣椒品種上CMV分離物的CP基因序列并進行測序分析，利用DNAMAN、BioEdit和MEGA 7.0分析貴州辣椒CMV分離物的遺傳多樣性，為抗病毒辣椒品種選育及辣椒病毒病的防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試16個辣椒病毒病樣品來自貴州省榕江、大方、石阡、安龍、綏陽、德江、關(guān)嶺和惠水8個縣表現(xiàn)花葉、斑駁的辣椒葉片，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩悠沸畔⒁姳?。

1. 2 葉片總RNA提取

采用RNAprep Pure Plant Kit（DP432）植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取辣椒葉片總RNA，具體步驟參照試劑盒說明進行操作。

1. 3 cDNA合成、PCR擴增及測序

以提取的辣椒葉片總RNA為模板，使用GoScriptTM Reverse Transcription System（Promega，A5001）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體方法參考試劑盒說明書。用2×Easy Taq[?] PCR SuperMix（Transgen biotech，AS111）進行基因擴增。特異性引物：CMV-F：5'-TCTCATGGATGCTTCTCCGCG-3'和CMV-R：5'-CCGTAAGCTGGATGGACAACC-3'。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共進行32個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段。目的片段與pEASY-T5 Zero Cloning Kit （Transgen biotech，CT501）進行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選，PCR鑒定陽性菌落。陽性克隆送至重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

1. 4 CP基因序列分析

利用DNAMAN和BioEdit對CMV各亞組代表株系ⅠA（Fny D10538）、ⅠB（Am JQ362394）、Ⅱ（lily DQ885291）和貴州不同地區(qū)CMV分離物的CP基因核苷酸序列和CP蛋白氨基酸序列進行比對，分析其保守和非保守結(jié)構(gòu)。運用MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建基于CP基因核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，以同屬的花生矮化病毒（Peanut stunt virus，PSV）ER株系為外群。

為更好地分析其進化歷程和親緣關(guān)系，選取已報道的標準CMV-Fny美國株系及亞洲的中國、日本、韓國和印度等地區(qū)的CMV株系進行序列比對分析。GenBank登錄號分別為：（1）CMV IA株系：M AF268599、Fny D10538、Y D12499和Legume D16405;（2）CMV IB株系：As X77855、XJ2 DQ070746、DanShen AY600- 989、Am JQ362394、HLJ DQ459481和CH JX993913;（3）CMVⅡ株系：Indian AM396983、lily DQ885291和PaFM AB109908。PSV-ER外群序列登錄號U15730。

2 結(jié)果與分析

2. 1 CMV樣品鑒定結(jié)果

采集花葉、黃化等癥狀辣椒病毒病樣品（圖1），提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，用CMV的特異性引物進行PCR擴增，得到大小為900 bp的片段，與預期結(jié)果一致（圖2）。將目標片段連接到T載體后測序，BLAST序列比對結(jié)果顯示，該片段包含長657 bp的完整CMV CP基因序列，編碼218個氨基酸。

2. 2 CMV分離物的CP基因核苷酸序列及編碼蛋白氨基酸序列分析結(jié)果

將貴州8個縣16個辣椒CMV分離物的CP基因核苷酸序列及編碼蛋白氨基酸序列與CMV各亞組代表株系IA（Fny D10538）、IB（Am JQ362394）、Ⅱ（lily DQ885291）和外群PSV-ER進行一致性比對分析，結(jié)果（表2和表3）表明，貴州不同地區(qū)的CMV分離物與CMV亞組分離物的CP基因核苷酸序列一致性為89.7%～100.0%，CP蛋白氨基酸一致性為96.8%～100.0%。其中，CMV-DF、CMV-RJ、CMV-SQ、CMV-SY和CMV-DJ等10個分離物與CMV-Am、CMV-Fny和CMV-lily的CP基因核苷酸序列一致性分別為98.9%～99.2%、98.3%和89.7%，其蛋白氨基酸序列與CMV-Am和CMV-Fny的一致性均為100.0%，與CMV-lily的一致性為96.8%;CMV-HS、CMV-GL和CMV-AL等6個分離物與CMV-Am、CMV-Fny和CMV-lily的CP基因核苷酸序列一致性分別為89.2%、88.9%和98.0%，其蛋白氨基酸序列與CMV-Am和CMV-Fny的一致性均為96.8%，與CMV-lily的一致性為100.0%。

2. 3 CMV分離物的CP蛋白氨基酸序列比較

對貴州辣椒CMV分離物與CMV各亞組代表株系的CP蛋白氨基酸序列進行比較，結(jié)果（圖3）表明，貴州16個CMV分離物與CMV亞組代表株系在CP蛋白氨基酸序列有23個位點（第5、7、10、12、20、21、24、25、27、31、34、36、48、130、144、147、171、172、193、196、212、214和217）發(fā)生變化，其中，第1～40位氨基酸間有12個位點不同;惠水、關(guān)嶺和安龍的6個CMV分離物CP蛋白氨基酸序列的變化位點與CMV-lily株系相同，屬于CMVⅡ株系;大方、榕江、石阡、綏陽和德江10個CMV分離物CP蛋白氨基酸序列的變化位點與CMV-Am和CMV-Fny株系相同，屬于CMVⅠ株系。從這些分離物的來源看，不同地區(qū)CMV分離物的CP蛋白氨基酸序列存在一定的差異性。

2. 4 CMV分離物的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果

根據(jù)已報道CMV亞組各株系的CP基因核苷酸序列和貴州不同地區(qū)辣椒CMV分離物的CP基因核苷酸序列，利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果（圖4）顯示，所有CMV分離物聚為兩大分支，其中源自大方、榕江、石阡、綏陽和德江5個縣的CMV-DF1、CMV-DF2、CMV-RJ1、CMV-RJ2、CMV-SQ1、CMV-SQ2、CMV-SY1、CMV-SY2、CMV-DJ1、CMV-DJ2等10個辣椒CMV分離物與CMVⅠ代表株系聚為一個大支，又與CMV IB株系的DanShen AY600989、Am JQ362394、As X77855、XJ2 DQ070746、HLJ DQ459481和CH JX993913等株系聚在一起，表明這10個辣椒CMV分離物與CMV IB株系的親緣關(guān)系更近;源自惠水、關(guān)嶺和安龍的6個辣椒CMV分離物CMV-HS1、CMV-HS2、CMV-GL1、CMV-GL2、CMV-AL1和CMV-AL2與CMV Ⅱ聚為另一個大支，表明這些CMV分離物與CMV Ⅱ株系的親緣關(guān)系較近。因此，在16個貴州辣椒CMV分離物中，有10個分離物屬于CMV亞組IB株系，6個分離物屬于CMV亞組Ⅱ株系。

3 討論

CMV是危害貴州辣椒、煙草等作物的主要病毒之一，常與其他病毒復合侵染，在寄主上產(chǎn)生多種癥狀。CMV I主要引起壞死、蕨葉和矮化等癥狀，CMV Ⅱ引起斑駁和花葉等癥狀，但僅觀察寄主癥狀并不能準確地將CMV株系歸屬進行區(qū)分。因此，本研究采集斑駁、花葉和黃化等癥狀的辣椒，采用RT-PCR進行CMV分離物亞組鑒定，結(jié)果表明，大方、榕江、綏陽、石阡和德江等地辣椒CMV分離物與CMV IB聚為一支，屬于CMV亞組IB株系;惠水、關(guān)嶺和安龍等地辣椒CMV分離物與CMV Ⅱ聚為另一支，屬于CMV 亞組Ⅱ株系。席德慧等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，侵染甜菜的分離物CMV-XJ1和CMV-XJ2屬于亞組IB株系，二者存在株系分化趨勢;侵染貴州煙草的CMV株系屬于亞組IB株系（王莉爽等，2015a）;湖南永州辣椒的CMV分離物屬于亞組IB株系（陳玉珍等，2016）;侵染山東葫蘆科蔬菜南瓜、絲瓜等的CMV分離物屬于亞組IB株系（孫曉輝等，2016）;新疆辣椒LJ-10 CMV分離物屬于亞組IB株系（周東等，2017）;侵染番茄的9個山西CMV分離物與XJ2（四川）、Danshen（河北）等聚為一簇，屬于CMV亞組IB株系（張璇等，2018）。綜上所述，煙草、番茄、辣椒、南瓜和絲瓜等作物上CMV亞組IB株系的發(fā)生流行較普遍，與貴州大部分地區(qū)辣椒CMV株系歸屬一致。

本研究發(fā)現(xiàn)貴州辣椒CMV分離物還存在亞組Ⅱ株系，與其他地區(qū)報道侵染辣椒的株系不同，但與侵染西葫蘆的Poland分離株中CMVⅡ較流行（Hasiów-Jaroszews et al.，2017）相符。貴州辣椒CMV分離物歸屬CMV亞組IB株系和CMV亞組Ⅱ株系，可能是由于CMV的發(fā)生、進化和變異與不同寄主、地理位置、生長環(huán)境等因素有關(guān)。相關(guān)研究表明，不同生境和寄主可能導致CMV保守氨基酸殘基變化而引起結(jié)構(gòu)和功能改變，不同CMV亞組分離物氨基酸序列可能與其致病性強弱有關(guān)（覃瑞和程旺元，2004）。本研究僅對16個貴州辣椒CMV分離物的CP基因進行比較分析，發(fā)現(xiàn)CMV分離物的CP基因核苷酸序列及其編碼蛋白氨基酸序列存在一定的差異，其中，氨基酸序列存在23個非保守的氨基酸，是區(qū)分CMV亞組I和亞組Ⅱ的關(guān)鍵，但更多來源CMV分離物氨基酸差異所致的癥狀變化有待進一步探究。

4 結(jié)論

目前侵染貴州不同辣椒主產(chǎn)區(qū)的CMV株系有兩大組群，分別為CMV亞組IB株系和CMV亞組Ⅱ株系，表明在不同地域的辣椒CMV株系發(fā)生了變異。

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（責任編輯 麻小燕）