張斌 韓敏 相德才 劉韶娜 沙茜 張桂生 趙智勇 趙彥光
摘要:【目的】明確自然抵抗相關巨噬細胞蛋白1基因(Nramp1)多態(tài)性對其在滇陸豬群體各組織中表達的影響,從分子遺傳學角度闡述滇陸豬不同基因型個體對疫病免疫的遺傳差異,為其抗病育種選育提供參考依據(jù)?!痉椒ā坎捎肞CR對27頭滇陸豬Nramp1基因進行擴增,以DNASTAR 5.0進行序列比對分析及多態(tài)性(SNP)位點檢測;同時利用實時熒光定量PCR檢測Nramp1基因在滇陸豬各組織中的相對表達量,并運用SPSS 19.0分析Nramp1基因多態(tài)性對其在滇陸豬群體各組織中表達的影響?!窘Y(jié)果】在滇陸豬Nramp1基因第5外顯子、第5內(nèi)含子和第6外顯子上分別發(fā)現(xiàn)SNP1(T→C)、SNP2(A→G)和SNP3(G→A)等3個SNPs位點,都只存在2種基因型,且SNP1位點和SNP3位點在試驗豬群體中屬于低度多態(tài)[多態(tài)信息含量(PIC)/雜合度(He)<0.25)],SNP2位點屬于中度多態(tài)(0.25 關鍵詞: 滇陸豬;自然抵抗相關巨噬細胞蛋白1基因(Nramp1);多態(tài)性位點(SNPs);基因型;組織差異表達 中圖分類號: S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼: A 文章編號:2095-1191(2020)01-0202-07 Abstract:【Objective】To clarify the effect of polymorphism of natural resistance-related macrophage protein 1 gene (Nramp1) on its expression in tissues of Dianlu pig, aiming at elaborating the genetic differences of different genotypes of Dianlu pigs on disease immunity from the perspective of molecular genetics, and providing a reference for disease resistance breeding. 【Method】The Nramp1 gene of 27 Dianlu pigs were amplified by PCR,and the sequence alignment analy-sis and the polymorphic sites(SNP)were detected with DNASTAR 5.0. Meanwhile, the real-time quantitative fluorescence PCR(qPCR) was used to detect the relative expression of the Nramp1 gene in tissues of Dianlu pigs, and the SPSS 19.0 was used to analyze the effect of Nramp1 gene polymorphism on its expression in the tissues of Dianlu pig. 【Result】Three SNPs of SNP1 (T→C), SNP2 (A→G) and SNP3 (G→A) were found on the 5th exon, 5th intron and 6th exon of the Nramp1 gene in Dianlu pig, respectively. There were only two genotypes in each polymorphism. The SNP1 and SNP3 were at low polymorphism [polymorphism information content(PIC)/heterozygosity(He) <0.25] and SNP2 was at mo-derate polymorphism (0.25<PIC/He<0.5) in the experimental population. There were significant differences in the relative expression of the Nramp1 gene among the tissues of Dianlu pigs(P<0.05, the same below), that showing lung>liver>spleen>heart. In addition, the tissue-differential expression of the Nramp1 gene in different genotype groups of Dianlu pig was also different, especially the Nramp1 gene expression in the liver of homozygous group at SNP2 was significantly lower than that of heterozytous group, indicating that the variation of the Nramp1 gene polymorphism site had significant effect on its expression in the tissues of Dianlu pig. 【Conclusion】The variation of the Nramp1 gene SNP can influence Nramp1 gene expression change in the tissues of Dianlu pig, thereby affecting the immune response reaction of Dianlu pig body. SNP2 site can be used as a molecular marker for disease resistance breeding in Dianlu pig.
Key words: Dianlu pig; natural resistance-related macrophage protein 1 gene(Nramp1); polymorphic sites(SNPs); genotype; tissue differential expression
Foundation item:Yunnan Key Research and Development Project(2018BB003);Yunnan Application and Basic research Project(2017FD055,2018FD001); Basic Research Project of Yunnan Animal Science and Veterinary Institute(2019RW012)
0 引言
【研究意義】滇陸豬是云南省自主培育成功的新品種,具有產(chǎn)子多、肉質(zhì)好、生長速度較快、母性強及瘦肉率高等優(yōu)勢(國家畜禽遺傳資源委員會,2011),但在大規(guī)模集約化養(yǎng)殖過程中其面臨的問題也逐漸凸顯,尤其是各種流行病害(豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細小病毒病和豬支原體肺炎等)對其養(yǎng)殖業(yè)帶來的危害。針對相關疫病的發(fā)生與流行雖然可通過疫苗免疫進行預防,但在免疫力選擇下會不斷產(chǎn)生優(yōu)勢致病性菌(毒)株(Escudero et al.,2007;張雪花等,2018),且這些病原體極易污染并長期存在而難以清除。因此,迫切需要對滇陸豬實施抗病育種選育,為促進其養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展提供保障?!厩叭搜芯窟M展】自然抵抗相關巨噬細胞蛋白1基因(Nramp1)是Vidal等(1993,1996)在近交小鼠中發(fā)現(xiàn)的一段較保守基因序列,是Nramp基因家族成員之一。豬Nramp1基因由15個外顯子和14個內(nèi)含子組成(Wu et al.,2007),且有研究發(fā)現(xiàn)該基因第6個內(nèi)含子NdeⅠ限制性位點的多態(tài)性變異不僅與豬免疫功能存在顯著相關性(Wu et al.,2008),還與仔豬腹瀉的發(fā)生發(fā)展密切相關(趙生國等,2013;古少波等,2017;羅興等,2017)。此外,Ding等(2014)采用PCR-RFLP對皖南黑豬、淮豬和渭豬的Nramp1基因進行研究,結(jié)果表明該基因的g.130 C>T位點和g.657 A>G位點變異與單核細胞百分比、中間細胞百分比及CD4/CD8 T淋巴細胞等血液免疫性狀相關。戴超輝等(2017)從細胞水平探討Nramp1基因與仔豬腹瀉的相關性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬腸道上皮細胞經(jīng)不同大腸桿菌刺激后,Nramp1基因在腸道上皮細胞中的表達量呈不同倍數(shù)的上調(diào)變化。Wen等(2018)對豬的Nramp1蛋白結(jié)構(gòu)及其氨基酸序列進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)約克夏豬與藏豬存在抗病性差異,其原因可能是約克夏豬Nramp1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域及三級結(jié)構(gòu)與藏豬Nramp1蛋白相比存在顯著差異。可見,Nramp1基因可作為豬分子抗病育種的候選基因?!颈狙芯壳腥朦c】至今,有關Nramp1基因的抗病性雖然已從DNA或mRNA層面在不同豬品種上得到驗證,但有關其DNA多態(tài)性與mRNA表達量的相關性尚無研究報道?!緮M解決的關鍵問題】通過PCR擴增及實時熒光定量PCR檢測等方法分析Nramp1基因多態(tài)性變化對Nramp1基因在滇陸豬群體各組織中表達的影響,旨在從分子遺傳學角度闡述滇陸豬不同基因型個體對疫病免疫的遺傳差異,為其抗病育種選育提供參考依據(jù)。
1 材料與方法
1. 1 試驗材料
以隨機挑選不同母本的6月齡滇陸豬為試驗材料,共27頭,采集其耳組織,置于裝有75%酒精的離心管中,-70 ℃保存。同時對27頭滇陸豬進行屠宰,采集其心臟、肝臟、脾臟和肺臟等組織樣品,立即置于裝有RNA Save液的離心管中,-70 ℃保存。
1. 2 滇陸豬Nramp1基因多態(tài)性檢測
1. 2. 1 基因組DNA提取及檢測 參照天根生化科技(北京)有限公司的組織DNA提取試劑盒說明,提取滇陸豬耳組織樣品的基因組DNA,并以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行提取效果檢測。
1. 2. 2 引物設計 參照GenBank已公布的豬Nramp1全基因序列(NC_010457.5),采用Primer Premier 5.0設計擴增滇陸豬Nramp1基因的特異性引物(F1:5'-TTCCAGCCCAACAGTGTAGG-3'和R1:5'-CTTT CATTGCCAGGTCCCCT-3'),擴增片段長度689 bp,委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。
1. 2. 3 PCR擴增及測序分析 對27頭滇陸豬耳組織DNA樣品進行PCR擴增,PCR反應體系25.0 μL,包含Master Mix 12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,DNA模板(約50 ng)2.0 μL,ddH2O 8.5 μL。擴增程序:94 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,進行40個循環(huán);72 ℃延伸7 min,擴增產(chǎn)物4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,然后送至中美泰和生物技術(北京)有限公司進行單向(正向)測序,再以DNASTAR 5.0進行序列比對分析及多態(tài)性位點檢測。
1. 3 滇陸豬Nramp1基因相對表達量檢測
1. 3. 1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 使用從天根生化科技(北京)有限公司購買的TRNzol-A+ Reagent提取27頭滇陸豬組織樣品中的總RNA,并參照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明將以上總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
1. 3. 2 引物設計 以GAPDH基因作為內(nèi)參基因,依據(jù)GenBank已公布的豬Nramp1基因mRNA(NM_213821.2)和GAPDH基因mRNA(NM_001206359.1)序列,利用Primer Premier 5.0設計引物(表1)。
1. 3. 3 實時熒光定量PCR擴增 對27頭滇陸豬組織RNA樣品進行實時熒光定量PCR擴增,反應體系20.0 μL,包含2×Super Real PreMix Plus 12.5 μL,正、反向引物(10 μmol/L)各1.0 μL,cDNA模板(約含100 ng)1.0 μL,ddH2O 4.5 μL。每個樣品設3個重復,并設定陰性對照。擴增程序:95 ℃預變性30 s;95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,進行40個循環(huán),并繪制熔解曲線。
1. 4 統(tǒng)計分析
采用Excel 2010計算目的基因多態(tài)性(SNP)位點的基因型頻率、等位基因頻率、雜合度(He)及多態(tài)信息含量(PIC)(表2);使用2-△△Ct法換算目的基因在各組織中的相對表達量,并以SPSS 19.0對目的基因的組織差異表達進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。
2 結(jié)果與分析
2. 1 滇陸豬Nramp1基因PCR擴增及序列分析結(jié)果
以滇陸豬耳組織基因組DNA為模板,用F1/R1特異引物擴增滇陸豬Nramp1基因的第5外顯子、第5內(nèi)含子及第6外顯子等序列,擴增獲得的基因片段(圖1)與預期結(jié)果一致,且無非特異性條帶出現(xiàn),測序結(jié)果顯示目的基因序列長度為689 bp。
對27份滇陸豬Nramp1基因的PCR擴增產(chǎn)物進行測序及序列比對分析,發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與GenBank已公布的豬Nramp1基因序列吻合,即確定為豬Nramp1基因序列。經(jīng)SeqMan程序分析發(fā)現(xiàn)有3個多態(tài)性(SNP)位點(SNP1、SNP2和SNP3),分別位于第5外顯子(T→C)、第5內(nèi)含子(A→G)和第6外顯子(G→A)上,且這3個SNPs位點都只存在2種基因型(圖2),即SNP1位點為純合基因型(TT)時,SNP3位點也為純合基因型(GG);SNP1位點為雜合基因型(TC)時,SNP3位點也為雜合基因型(GA)。
2. 2 滇陸豬Nramp1基因SNP位點的遺傳分布情況
由表3可知,滇陸豬Nramp1基因SNP1、SNP2和SNP3等3個SNP位點在試驗豬群體中的優(yōu)勢基因型分別是TT型(0.78)、AG型(0.56)和GG型(0.78),優(yōu)勢等位基因型分別是T(0.89)、A(0.72)和G(0.89)。進一步計算各SNPs位點的He和PIC,發(fā)現(xiàn)在試驗滇陸豬群體中位于Nramp1基因外顯子區(qū)域的SNP1和SNP3位點屬于低度多態(tài)(PIC/He<0.25),而位于內(nèi)含子區(qū)域的SNP2位點屬于中度多態(tài)(0.25 2. 3 滇陸豬Nramp1基因在各組織中的相對表達量 對提取的所有組織樣品總RNA進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品的總RNA濃度均在400 ng/μL以上,且OD260/OD280在1.8~2.0,說明提取獲得的滇陸豬組織樣品總RNA濃度和完整性均滿足后續(xù)試驗要求。由圖3可看出,目的基因和內(nèi)參基因的實時熒光定量PCR熔解曲線單一,即這2個基因的實時熒光定量PCR擴增效果良好,無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物生成。 以Nramp1基因在耳缺號為025的滇陸豬心臟中的平均Ct為對照,計算Nramp1基因在滇陸豬各組織中的相對表達量。由圖4可知,Nramp1基因在滇陸豬心臟、肝臟、脾臟和肺臟等組織均有表達,且在各組織間的相對表達量存在顯著差異(P<0.05,下同),具體表現(xiàn)為肺臟>肝臟>脾臟>心臟。 2. 4 不同基因型對Nramp1基因在滇陸豬群體中表達的影響 由圖5-A可知,在滇陸豬SNP1(或SNP3)位點純合(TT或GG)群體中,Nramp1基因在肺臟中的相對表達量顯著高于在心臟、肝臟和脾臟中的相對表達量,在肝臟和脾臟中的相對表達量又顯著高于在心臟中的相對表達量,但在肝臟和脾臟中的相對表達量差異不顯著(P>0.05,下同);在滇陸豬SNP1(或SNP3)位點雜合群體(TC或GA)中,Nramp1基因的相對表達量也表現(xiàn)為肺臟>肝臟>脾臟>心臟,與純合群體不同的是Nramp1基因在肝臟中的相對表達量顯著高于在心臟和脾臟中的相對表達量,而在心臟和脾臟中的相對表達量差異不顯著。由圖5-B可知,在滇陸豬SNP2位點純合群體(AA)中,Nramp1基因在各組織中的表達規(guī)律與在滇陸豬SNP1(或SNP3)位點純合群體中的表達趨勢一致;在滇陸豬SNP2位點雜合群體(AG)中,Nramp1基因在各組織間的相對表達量存在顯著差異。 Nramp1基因在不同基因型滇陸豬群體間的組織差異表達情況如圖6所示。由圖6-A可知,在滇陸豬SNP1(或SNP3)位點各基因型群體間,Nramp1基因在純合群體各組織中的相對表達量與在雜合群體各組織中的相對表達量均無顯著差異。由圖6-B可知,在滇陸豬SNP2位點各基因型群體間,Nramp1基因在純合群體肝臟中的相對表達量顯著低于在雜合群體肝臟中的相對表達量,但在2個群體其他3個組織中的相對表達量均無顯著差異。 3 討論 趙生國等(2013)研究發(fā)現(xiàn),在大白豬、長白豬、杜洛克、甘肅黑豬和合作豬Nramp1基因的第2外顯子和第6內(nèi)含子上各存在1個SNP位點,且這2個SNPs位點與仔豬腹瀉密切相關。戴超輝等(2017)研究表明,以大腸桿菌刺激豬腸道上皮細胞后Nramp1基因表達明顯上調(diào),說明Nramp1基因在大腸桿菌侵染機體的過程中發(fā)揮重要免疫調(diào)控作用。古少波等(2017)采用PCR-RFLP對八眉豬和煙臺豬Nramp1基因第6內(nèi)含子的NdeⅠ酶切位點進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該SNP位點存在AB和BB 2種基因型,其中AB基因型是這2個豬群中的優(yōu)勢基因型,也是母豬群體腹瀉的易感基因型。羅興等(2017)對大白仔豬斷奶前的腹瀉進行研究,發(fā)現(xiàn)Nramp1基因第6內(nèi)含子NdeⅠ酶切多態(tài)性位點AA型或AB型個體腹瀉頻率、腹瀉指數(shù)均顯著高于BB型個體??梢?,Nramp1基因是與豬疾病免疫相關的重要候選基因,其多態(tài)性差異導致豬個體對疫病的免疫效力不同,可能是Nramp1基因多態(tài)性對其mRNA表達有顯著影響所致(夏小慧等,2012)。 本研究對滇陸豬Nramp1基因多態(tài)性進行檢測,結(jié)果在Nramp1基因的第5外顯子、第5內(nèi)含子和第6外顯子上分別檢測出SNP1(T→C)、SNP2(A→G)和SNP3(G→A)等3個SNPs位點;鄭王山等(2015)對藏豬、甘肅黑豬、大白豬、約克夏豬和杜洛克豬等5個豬種的Nramp1基因進行全序列測定時發(fā)現(xiàn),在Nramp1基因的第5外顯子檢測出A→T、C→A和G→A等3個SNPs位點,第5內(nèi)含子未檢測出SNP位點,第6外顯子檢測出1個SNP位點(G→A),說明Nramp1基因多態(tài)性還存在品種差異。本研究對滇陸豬Nramp1基因的組織差異表達進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nramp1基因在心臟、肝臟、脾臟和肺臟等組織中均有表達,與其在豬(Zhang et al.,2000)、藏豬(應三成和張義正,2007)、野交雜種豬(陳赫書和劉娣,2009)和家兔(鄺良德等,2013)中的表達模式一致;Nramp1基因在滇陸豬各組織間的表達量均存在顯著差異,具體表現(xiàn)為肺臟>肝臟>脾臟>心臟,但與其在藏豬(應三成和張義正,2007)、野交雜種豬(陳赫書和劉娣,2009)和家兔(鄺良德等,2013)中的組織差異表達結(jié)果不一致,說明Nramp1基因的組織表達在不同群體或物種中存在一定差異。本研究還分析了Nramp1基因多態(tài)性變異對其在滇陸豬不同組織中表達的影響,結(jié)果表明Nramp1基因在滇陸豬不同基因型群體中表現(xiàn)出的組織差異表達也不同;此外,Nramp1基因在SNP2位點純合群體肝臟中的相對表達量顯著低于在雜合群體肝臟中的相對表達量,說明Nramp1基因SNP位點變異對Nramp1基因在滇陸豬組織中的表達有顯著影響。因此,在今后的滇陸豬育種工作中應盡量篩選攜帶AG基因型的個體,以提高豬群體對疫病的免疫力。 4 結(jié)論 Nramp1基因SNP位點變異能影響Nramp1基因在滇陸豬各組織中的表達變化,從而影響機體的免疫應答反應,其中SNP2位點可作為滇陸豬抗病育種的分子標記。 參考文獻: 陳赫書,劉娣. 2009. 野交雜種豬NRAMP1基因的定量表達[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報,40(10):75-78. [Chen H S,Liu D. 2009. NRAMPl gene in quantitative expression of wild boar crossbred pigs[J]. Journal of Northeast Agricultural University,40(10):75-78.] 戴超輝,吳嘉韻,孫麗,吳圣龍,包文斌. 2017. 大腸桿菌刺激豬腸上皮細胞后Nramp1基因的表達變化分析[J]. 中國畜牧雜志,53(6):40-43. [Dai C H,Wu J Y,Sun L,Wu S L,Bao W B. 2017. Analysis of the expression changes of Nramp1 gene in pig intestines epithelial cells stimulated by Escherichia coli[J]. Chinese Journal of Animal Science,53(6):40-43.] 國家畜禽遺傳資源委員會. 2011. 中國畜禽遺傳資源志(豬志)[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社:445-448. [China Natio-nal commission of animal genetic resources. 2011. Animal genetic resources in China(pigs)[M]. Beijing:China Agriculture Press:445-448.] 古少波,杜倩,舒丹,李志瑕,田曉靜,劉麗霞. 2017. 豬Nramp1基因內(nèi)含子6多態(tài)性與仔豬腹瀉的相關性[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報,29(6):882-887. [Gu S B,Du Q,Shu D,Li Z X,Tian X J,Liu L X. 2017. Polymorphism of Nramp1 intron 6 and its correlation with piglet diarrhea[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis,29(6):882-887.] 鄺良德,楊發(fā)龍,謝曉紅,雷岷,李叢艷,鄭潔. 2013. 家兔組織器官中Nramp1基因表達差異研究[J]. 動物醫(yī)學進展,34(2):56-60. [Kuang L D,Yang F L,Xie X H,Lei M,Li C Y,Zheng J. 2013. Study on the different expression of Nrampl gene in organs and tissues of rabbits[J]. Progress in Veterinary Medicine,34(2):56-60.] 羅興,尹立林,劉飛,張維旭,李新云,趙書紅,王海燕. 2017. BCL10、Nramp1基因多態(tài)性與大白仔豬斷奶前腹瀉關聯(lián)分析[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學學報,36(4):83-89. [Luo X,Yin L L,Liu F,Zhang W X,Li X Y,Zhao S H,Wang H Y. 2017. Association between polymorphism of BCL10,Nramp1 gene and diarrhea traits in Large White piglets before weaning[J]. Journal of Huazhong Agricultural University,36(4):83-89.] 夏小慧,胡揚,張騰國,陳婷. 2012. SLC2A4基因啟動子區(qū)rs5418位點變異對基因表達的影響[J]. 中國病理生理雜志,28(10):1791-1795. [Xia X H,Hu Y,Zhang T G,Chen T. 2012. Effects of rs5418 site variation in SLCZA4 promoter region on gene expression[J]. Chinese Journal of Pathophysiology,28(10):1791-1795.] 應三成,張義正. 2007. 藏豬NRAMP1基因的定量表達研究[J]. 四川大學學報(自然科學版),44(3):697-701. [Ying S C,Zhang Y Z. 2007. Quantitative analysis of NRAMP1 gene expression in Tibetan pigs[J]. JoumaI of Sichuan University(Natural Science Edition),44(3):697-701.] 張雪花,張道華,陸吉虎,梅梅,華濤,唐波,侯繼波,唐應華. 2018. 高效佐劑對豬細小病毒和圓環(huán)病毒二聯(lián)滅活疫苗的免疫增強效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報,34(2):361-367. [Zhang X H,Zhang D H,Lu J H,Mei M,Hua T,Tang B,Hou J B,Tang Y H. 2018. Effect of immunopotentiators on the efficacy of the bivalent vaccine of PPV and PCV2[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences,34(2):361-367.] 趙生國,蔡原,滾雙寶,楊巧麗,劉麗霞. 2013. 豬天然抗性相關巨噬細胞蛋白基因(Nramp1)多態(tài)性及其與豬仔腹瀉相關性分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術學報,21(11):1351-1357. [Zhao S G,Cai Y,Gun S B,Yang Q L,Liu L X. 2013. Genetic polymorhisms in the swine(Sus scrofa) natural-resistance-associated marophage protein 1 gene(Nramp1) and their relationships with piglet diarrhea[J]. Journal of Agricultural Biotechnology,21(11):1351-1357.] 鄭王山,程簫,趙生國. 2015. 藏豬天然抗性相關巨噬細胞蛋白基因克隆及變異研究[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志,34(6):1-9. [Zheng W S,Cheng X,Zhao S G. 2015. Research on clone and mutation of NRAMPl gene in Tibetan pig[J]. Journal of Animal Science and Veterinary Medicine,34(6):1-9.] Ding X,Zhang X,Yang Y,Ding Y,Xue W,Meng Y,Zhu W,Yin Z. 2014. Polymorphism,expression of natural resistance-associated macrophage protein 1 encoding gene (NRAMP1) and its association with immune traits in pigs[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences,27(8):1189-1195. Escudero J A,San Millan A,Catalan A,de la Campa A G,Rivero E,Lope G,Dominguez L,Moreno M A,Gonzlez-Zorn B. 2007. First characterization of fluoroquinolone resistance in Streptococcus suis[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,51(2):777-782. Vidal S M,Malo D,Vogan K,Skamene E,Gros P. 1993. Natural resistance to infection with intracellular parasites:Isolation of a candidate for Bcg[J]. Cell,73(3):469-485. Vidal S M,Pinner E,Lepage P,Gauthier S,Gros P. 1996. Na-tural resistance to intracellular infections:Nramp1 encodes a membrane phosphoglycoprotein absent in macrophages from susceptible(Nramp1 D169) mouse strains[J]. Journal of Immunology,157(8):3559-3568. Wen Y L,Cheng X,Zhao S G. 2018. Nucleotide variants of the Nramp1 gene in pigs and their effects on disease resistance[J]. Indian Journal of Animal Research. doi.org/10. 18805/ijar.v0iOF.8491. Wu Z F,Luo W H,Yang G F,Zhang X Q. 2007. Genomic organization and polymorphisms detected by denaturing high performance liquid chromatography of porcine SLC11A1 gene[J]. DNA Sequence,18(5):327-333. Wu H,Cheng D,Wang L. 2008. Association of polymorphisms of Nramp1 gene with immune function and production performance of Large White pig[J]. Journal of Genetics and Genomics,35(2):91-95. Zhang G,Wu H,Ross C R,Minton J E,Blecha F. 2000. Clo-ning of porcine NRAMP1 and its induction by lipopolysaccharide,tumor necrosis factor alpha,and interleukin-1beta:Role of CD14 and mitogen-activated protein kina-ses[J]. Infection and Immunity,68(3):1086-1093. (責任編輯 蘭宗寶)