梁政委，杜增豐，李超倫，王敏曉，王 冰，張 鑫，閻 軍

1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，中國(guó)科學(xué)院海洋地質(zhì)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院海洋研究所深海極端環(huán)境與生命過(guò)程研究中心，山東 青島 266071 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋地質(zhì)過(guò)程與環(huán)境功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 4. 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心，山東 青島 266071

引 言

海洋貽貝屬軟體動(dòng)物門，瓣鰓綱，其廣泛分布于沿岸和近海，主要通過(guò)足絲附著于巖石、船體或其他基質(zhì)表面來(lái)生存。貽貝的足絲通過(guò)貽貝足腺體分泌貽貝粘附蛋白(mussel adhesive protein, MAP)而形成的，這些蛋白在貽貝腹溝內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列作用形成組分、結(jié)構(gòu)和功能完全不同的核心、外皮表面和粘附盤[1-2][圖1(a)]。

近年來(lái)，關(guān)于貽貝足以及足絲的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，F(xiàn)ilippidi等闡明了足絲組成：足絲核心部分主要由半結(jié)晶的膠原蛋白組成，稱為Precols；足絲纖維外皮表面由貽貝足蛋白-1(mfp-1)組成，對(duì)核心起到保護(hù)作用；粘附盤由大量富多巴的蛋白質(zhì)組成(mfp-2, -3, -4, -5, -6)，主要成分是酪蛋白經(jīng)過(guò)后翻譯修飾羥基化而形成的-3,4-二羥基苯丙氨酸(多巴，DOPA)，在貽貝足絲與其他基質(zhì)表面粘附時(shí)起主要作用[2-3]，Inoue等利用分子生物學(xué)方法研究了海洋貽貝足絲粘附蛋白的分子結(jié)構(gòu)[4]、Schmitt等的研究工作闡述了貽貝的DOPA與Fe等金屬離子進(jìn)行螯合作用的粘附機(jī)理[5]、Priemel等利用拉曼光譜技術(shù)對(duì)貽貝足腺體以及人工誘導(dǎo)后的腺體進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)揭示了貽貝足絲的生成的一系列生物調(diào)控過(guò)程[6-7]。相比于傳統(tǒng)的研究方法，拉曼光譜是一種非接觸、無(wú)損的提供物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)等生物化學(xué)信息原位探測(cè)技術(shù)手段，其不需要特殊繁雜的樣品預(yù)處理，可以避免樣品污染以獲得原本的樣品信息。而共聚焦顯微拉曼光譜儀在拉曼光譜儀的基礎(chǔ)上，在光路中引入針孔，激光通過(guò)針孔聚焦為微小光斑，只有在焦平面上的樣品產(chǎn)生的拉曼信號(hào)可以通過(guò)共聚焦孔回收至光譜，提高了信噪比和空間分辨率，還能有效的減少熒光干擾。對(duì)樣品微區(qū)進(jìn)行無(wú)損的拉曼光譜分析和2D掃描，可以直觀地呈現(xiàn)生物樣品化學(xué)組成與分布特征。近年來(lái)，共聚焦顯微拉曼光譜已經(jīng)逐漸應(yīng)用在生物組織和細(xì)胞檢測(cè)方面。

足絲是貽貝足腺體的外在表現(xiàn)形式，本文結(jié)合掃描電鏡和共聚焦顯微拉曼光譜對(duì)深海和淺海貽貝的足組織進(jìn)行分析，從貽貝足絲的表觀差異到貽貝足腺體的分泌蛋白組分和分布特征，探討兩種貽貝足組織分泌蛋白的差異對(duì)生成足絲的影響以及對(duì)環(huán)境適應(yīng)機(jī)制，可以利用拉曼光譜成像技術(shù)研究不同環(huán)境下的貽貝足腺體分布特征，其對(duì)工業(yè)上生產(chǎn)應(yīng)對(duì)不同環(huán)境生產(chǎn)高效理想粘性復(fù)合材料具有指示意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品制備

深海貽貝(Bathymodiolusplatifrons)樣品于2017年“科學(xué)號(hào)”冷泉航次取自南海冷泉大陸坡福爾摩沙脊“Fanmaoqu”位點(diǎn)[圖1(b和c)]，采樣過(guò)程由“發(fā)現(xiàn)”號(hào)水下纜控機(jī)器人(ROV)完成。淺海貽貝(Mytilusedulis)來(lái)自于大連小平島。樣品采集至甲板后立即用海水沖洗，解剖的足組織于-80 ℃凍存。在-25 ℃的溫度下，使用冷凍切片機(jī)(HM 505 E, Germany, 69190 Walldorf)切下10 μm厚度的足組織切片，將其固定在載玻片上用于拉曼探測(cè)分析。

圖1 (a) 貽貝足絲形成模式圖；(b) 深海貽貝(Bathymodiolus platifrons)的采樣位點(diǎn)的地形圖；(c) 深海貽貝(Bathymodiolus platifrons)和淺海貽貝(Mytilus edulis)足、足絲、粘附盤結(jié)構(gòu)圖

Fig.1(a)Themodelofmusselbyssusformation; (b)Samplingsiteofdeep-seamussels(Bathymodiolusplatifrons); (c)Structuralimageoffoot,byssusandadhesiveplaqueofmussel(Bathymodiolusplatifrons)andmussel(Mytilusedulis)

1.2 儀器

共聚焦顯微拉曼光譜儀(alpha 300R+, WITec, Ulm, Germany)(圖2)用于貽貝足的單譜和成像分析，激發(fā)光源波長(zhǎng)為532 nm，顯微鏡物鏡為50×/0.55(Zeiss, EC, Epiplan-Neofluar, Germany)，到達(dá)樣品處的激光功率為20 mW，UHTS300型光譜儀搭配600刻線光柵使光譜采集范圍為0～3 000 cm-1，分辨率為3 cm-1。進(jìn)行光譜采集時(shí)積分時(shí)間為1.5 s，累積次數(shù)為10，劃定面掃描區(qū)域，設(shè)置x和y方向的像素點(diǎn)，步長(zhǎng)為500 nm。使用WITec Project plus軟件對(duì)拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，analysis是通過(guò)對(duì)某組分的特征峰區(qū)域進(jìn)行單變量成像，進(jìn)而整合所檢測(cè)區(qū)域的多個(gè)組分圖像得到各組分相對(duì)分布的2D拉曼光譜圖像。

圖2 WITec共聚焦拉曼光譜儀部件組成以及光路模式圖

1: 透鏡式UHTS拉曼譜儀系列；2: 光子晶體光纖；3: CCD探測(cè)器；4: 濾光片裝置；5: 激光光源；6：光纖；7：柯勒白光照明；8: 物鏡；9：聚焦用的Z軸電機(jī)；10：壓電掃描臺(tái)與機(jī)械平臺(tái)

Fig.2ImageofcomponentsofconfocalRamanmicroscopy(WITec)andlightpath

1: Ultra-high throughout spectrometer; 2: Optical fiber; 3: CCD; 4: Filter; 5: Excitation laser; 6: Optial fiber; 7: Kolver lighting source; 8: Objective lens; 9: Z-axis motor; 10: XY-axis motor

2 結(jié)果與討論

2.1 深海和淺海貽貝足絲的表觀特征

結(jié)合深海貽貝和淺海貽貝足絲的形態(tài)學(xué)知識(shí)和掃描電鏡表征(圖3)，兩種貽貝足絲特征如下：深海貽貝足絲稀疏而寬粗，粗度約為400 μm，其外皮表面較粗糙雜亂，粘附盤較大；淺海貽貝足絲繁多而纖細(xì)，粗度約為70 μm，其外皮表面較光滑平整，粘附盤較小。兩種貽貝足絲形態(tài)學(xué)表觀相差很大，而足絲由貽貝足腺體分泌的蛋白在各種作用下生成，所以足絲表觀差異是貽貝足腺體差異的外在表現(xiàn)形式，所以檢測(cè)兩種貽貝足腺體的組成以及分布對(duì)了解兩種足絲差別具有重要意義。

2.2 深海(Bathymodiolus platifrons)和淺海貽貝(Mytilus edulis)足的組分檢測(cè)以及分布特征

由于樣品進(jìn)行冷凍切片，受環(huán)境影響失水，鏡下形態(tài)改變，且兩種貽貝足的尺寸存在差異，在未經(jīng)染色的條件下無(wú)法保證兩種貽貝測(cè)定時(shí)位置一致性，所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種貽貝的足腺體局部進(jìn)行拉曼檢測(cè)和成像，通過(guò)多點(diǎn)位多光譜重復(fù)檢測(cè)的方式確定腺體間的臨界位置。

拉曼光譜(如圖4和圖5)表明兩種貽貝足蛋白種類基本相同，都存在位于1 667 cm-1的amide Ⅰ和位于1 230～1 340 cm-1的amide Ⅲ蛋白質(zhì)骨架信號(hào)，基本表現(xiàn)為1 242，1 269，1 318和1 337 cm-1四個(gè)拉曼峰。而Amide Ⅲ的四個(gè)峰的相對(duì)強(qiáng)度變化又可以表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異，其中核心腺體的蛋白質(zhì)表現(xiàn)為有序的β重疊或螺旋蛋白質(zhì)高級(jí)構(gòu)象，對(duì)應(yīng)譜圖表現(xiàn)為位于1 242和1 269 cm-1位置的兩個(gè)峰的峰強(qiáng)度相對(duì)其他兩個(gè)較高，與膠原蛋白preCol的二級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一致，而外皮和粘附盤腺體的蛋白構(gòu)象無(wú)序，其光譜上表現(xiàn)為位于1 242和1 269 cm-1位置的兩個(gè)峰峰強(qiáng)度相對(duì)較低。

圖3 貽貝足絲掃描電鏡圖

上方為深海貽貝(Bathymodiolusplatifrons)，(a)和(c)分別為其粘附盤60倍和10 000倍電鏡圖，(b)和(d)分別為其足絲190倍和1 000倍電鏡圖；下方為近海貽貝(Mytilusedulis)，(e)和(g)分別為其粘附盤150倍和10 000電鏡圖，(f)和(h)分別為其足絲1 100倍和10 000電鏡圖；(a)標(biāo)尺為500 μm，(b)和(e)標(biāo)尺為300 μm，(c)和(g)標(biāo)尺為5 μm，(d), (h)和(f)標(biāo)尺為50 μm

Fig.3SEMofmusselfootbyssus

Upper part is deep-sea mussel, (a) and (c) is SEM of deep-sea mussel plaque 60× and 10 000× respectively, (b) and (d) is SEM of deep-sea mussel byssus 190× and 1 000× respectively; below part is shallow sea mussel, (e) and (g) SEM of shallow-sea mussel plaque 150× and 10 000× respectively, (f) and (h) is SEM of shallow-sea mussel byssus 150× and 10 000× respectively. Scale bar: (a) 500 μm，(b) and (e) 300 μm，(c) and (g) 5 μm，(d), (h) and (f) 50 μm

此外，三個(gè)腺體組成上也存在差異，外皮腺體和粘附盤腺體由特殊的蛋白質(zhì)組成，拉曼光譜表現(xiàn)為位于643，830，850和1 615 cm-1四個(gè)峰位置的酪氨酸(Tyr)信號(hào)以及由酪氨酸后翻譯修飾羥基化形成的拉曼信號(hào)峰位于785 cm-1的-3,4-二羥基苯丙氨酸(多巴，DOPA)信號(hào)[8]，表明外皮腺體(mfp-1)和粘附盤腺體(mfp2-6)存在酪氨酸和多巴。譜圖還呈現(xiàn)了位于1 006 cm-1的苯丙氨酸(Phe)信號(hào)[9]，其為mfp-2的主要組分，表明了足蛋白-2的存在。相對(duì)于深海貽貝，淺海貽貝的拉曼譜圖表現(xiàn)出高強(qiáng)度的位于1 043 cm-1位置的膠原蛋白信號(hào)[8]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種貽貝的三個(gè)腺體的局部區(qū)域進(jìn)行了拉曼成像，得到了2D拉曼彩色分布圖(如圖4和圖5)，其形象的展現(xiàn)了三個(gè)腺體區(qū)域的局部界限與分布，其中紅色、藍(lán)色和綠色分別與外皮、核心和粘附盤腺體區(qū)域一一對(duì)應(yīng)，黃色區(qū)域代表除三種腺體外貽貝足組織的剩余組分。2D拉曼彩色分布圖表明兩種貽貝足組織組分分布特征：淺海貽貝的核心和粘附盤腺體區(qū)域分布較分散，即區(qū)域中夾雜零散的黃色部分，而外皮腺體分布較集中；深海貽貝的核心和粘附盤腺體區(qū)域分布相對(duì)集中，即黃色區(qū)域分布集中，外皮腺體區(qū)域較集中。

2.3 貽貝足腺體以及足絲與環(huán)境的關(guān)系

貽貝足腺體分泌蛋白形成足絲，足絲是足腺體的外在表現(xiàn)形式，所以足腺體分布特征決定了的足絲形態(tài)特征。深海貽貝和近海貽貝表現(xiàn)出較大差異的足絲表觀和內(nèi)部足腺體分布，這可能源于兩種貽貝對(duì)各自生存環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制：本實(shí)驗(yàn)所用的深海貽貝生存在中國(guó)南海冷泉繁茂區(qū)，附著于自生碳酸鹽巖上，需要利用冷泉滲漏的甲烷生存，其棲息環(huán)境表現(xiàn)為高壓、黑暗、低溫、富甲烷、富硫化氫結(jié)合等，貽貝足絲較粗，其強(qiáng)度、韌性相對(duì)較好，即便受到海流或其他地質(zhì)活動(dòng)影響，有利于貽貝安穩(wěn)的固定在冷泉滲漏區(qū)域來(lái)生存；而淺海貽貝生存在大連小平島，水域環(huán)境溫度較高，受人類活動(dòng)影響較大，淺海海流較大，在受海流擾動(dòng)時(shí)貽貝足絲較細(xì)有利于貽貝斷開單個(gè)足絲進(jìn)行遷徙重新附著。除海流外，pH、壓力、溫度等理化環(huán)境參數(shù)以及粘附基質(zhì)也可能造成兩種貽貝足和足絲的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異。所以貽貝為適應(yīng)不同環(huán)境表現(xiàn)出的貽貝足絲的高粘附強(qiáng)度、高韌性、強(qiáng)耐水性的性質(zhì)，這些有效的粘附蛋白是一種高效的高聚天然生物膠黏劑，其為工業(yè)生產(chǎn)適應(yīng)多種復(fù)雜環(huán)境應(yīng)用的聚合物材料提供理論基礎(chǔ)。

圖4 中國(guó)南海冷泉貽貝足腺體的拉曼光譜圖

(a)：三個(gè)足腺體的拉曼光譜，(b)：外皮腺體和核心腺體的2D拉曼彩色圖，核心腺體(1 196～1 300/1 300～1 390 cm-1，藍(lán)色)，外皮腺體(1 596～1 630 cm-1，紅色)；(c)：核心腺體和粘附盤腺體的2D拉曼彩色分布圖，核心腺體(1 196～1 300/1 300～1 390 cm-1，藍(lán)色)，粘附盤腺體(1 596～1 630 cm-1，綠色)，標(biāo)尺條為4 μm

Fig.4RamanspectraimageofmusselfootglandsfromcoldseepattheSouthChinaSea

(a): Raman spectra of three foot glands；(b): 2D Raman color-coded image of cuticleand core gland, core gland (ratio of integration of 1 196～1 300 to 1 300～1 390 cm-1, blue), the cuticle gland (1 596～1 630 cm-1, red)；(c): 2D Raman color-coded image of core and plaque gland; core gland (ratio of integration of 1 196～1 300 to 1 300～1 390 cm-1, blue), the plaque gland (1 596～1 630 cm-1, green)；Scale bars: 4 μm

圖5 大連小平島貽貝(Mytilus edulis)足腺體的拉曼光譜圖

(a)：三個(gè)足腺體的拉曼光譜，(b)：外皮腺體和核心腺體的2D拉曼彩色圖，核心腺體(1 196～1 300/1 300～1 390 cm-1，藍(lán)色)，外皮腺體(1 596～1 630 cm-1，紅色)；(c)：核心腺體和粘附盤腺體的2D拉曼彩色分布圖，核心腺體(1 196～1 300/1 300～1 390 cm-1，藍(lán)色)，粘附盤腺體(1 596～1 630 cm-1，綠色)，標(biāo)尺條為10 μm

Fig.5Ramanspectraimageofmusselmussel(Mytilusedulis)footglandfromDalianXiaopingisland

(a): Raman spectra of three foot glands, (b): 2D Raman color-coded image of cuticleand core gland, core gland (ratio of integration of 1 196～1 300 to 1 300～1 390 cm-1, blue), the cuticle gland (1 596～1 630 cm-1, red)；(c): 2D Raman color-coded image of core and plaque gland；core gland (ratio of integration of 1 196～1 300 to 1 300～1 390 cm-1, blue), the plaque gland (1 596～1 630 cm-1, green)；Scale bars: 10 μm

3 結(jié) 論

分別對(duì)淺海貽貝和深海貽貝足組織切片進(jìn)行拉曼檢測(cè)和成像，得到了三個(gè)腺體的拉曼光譜以及腺體局部區(qū)域的2D拉曼彩色分布圖。拉曼光譜表明兩種貽貝足腺體組成：核心腺體表現(xiàn)為有序高級(jí)的蛋白構(gòu)象，外皮和粘附盤表現(xiàn)為豐富的酪氨酸和多巴組成；淺海貽貝在1 043 cm-1位置有高強(qiáng)度的膠原蛋白信號(hào)。拉曼成像呈現(xiàn)兩種貽貝腺體分布特征：深海貽貝表現(xiàn)為較為集中的腺體分布，淺海貽貝腺體分布較為分散，表明貽貝為適應(yīng)不同環(huán)境形成不同的腺體分布機(jī)制。共聚焦顯微拉曼光譜為不同環(huán)境下生存貽貝的足腺體分布特征研究提供技術(shù)方法，是一種潛在的研究開發(fā)適用于不同環(huán)境要求的新型高效人工聚合物探測(cè)技術(shù)。