李秋鴻盧嘉怡

（廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州510006）

原位肝移植能夠顯著提高終末期肝病患者的生存率和生活質(zhì)量，但是這項(xiàng)技術(shù)非常昂貴和復(fù)雜，并且受到肝臟供體的限制［1］。 人原代肝細(xì)胞被認(rèn)為是藥理學(xué)與毒理學(xué)、細(xì)胞移植研究的合適模型［2］。動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，肝細(xì)胞移植可以用于治療肝臟代謝性疾病以及肝功能衰竭［3］。 在某些特定的情況下，肝細(xì)胞移植還能夠促進(jìn)宿主的肝細(xì)胞再生，從而使宿主避免了后續(xù)的器官移植治療。 然而人原代肝細(xì)胞的來源非常有限，在體外很難培養(yǎng)與擴(kuò)增［4］。 人多能干細(xì)胞（包括人胚胎干細(xì)胞和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）能夠在體外合適的分化體系下被定向誘導(dǎo)為肝細(xì)胞，這為肝臟疾病潛在藥物的篩選、肝臟疾病模型的建立以及肝細(xì)胞移植治療提供了可再生的細(xì)胞來源［5］。 肝細(xì)胞分化的過程一般包括將人多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)為原條、定型內(nèi)胚層、前腸以及肝祖細(xì)胞，最后分化為肝細(xì)胞［6］。 由于細(xì)胞存在異質(zhì)性以及往往經(jīng)歷比較長的誘導(dǎo)周期，人們總是很難將多能干細(xì)胞完全誘導(dǎo)分化為某種單一類型的細(xì)胞群體，因此體外肝細(xì)胞的誘導(dǎo)效率并不高［6］。因此，本研究旨在探索并建立一套能夠顯著提高肝分化效率的方法。 研究發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞分化后期加入一種化學(xué)小分子藥物-Repsox，可以比較顯著地提高肝細(xì)胞的分化效率；經(jīng)Repsox 處理后，細(xì)胞群體能夠分泌更多的白蛋白（albumin），并合成更多的尿素（urea）。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人類胚胎干細(xì)胞株H1 來自于威斯康星州WiCell 研究所（Wicell，Madison，WI）。

1.2 主要試劑

mTeSR1（Stemcell Technologies）；Matrigel（BD Biosciences）；Accutase（Sigma）；RPMI／B27（Gibco）；Activin A （Peprotech）； BMP2 （Peprotech）； FGF4（Peprotech）；HGF（Peprotech）；KGF（Peprotech）；Oncostatin-M （ R＆D Systems）； hepatocyte culture media（HCM，Lonza）；Repsox（Selleck）；Trizol 試劑（MRC）；ReverTra Ace qPCR RT Kit （TOYOBO）；SYBR Premix Ex Taq Kit（TAKARA）；TGFβ1 ELISA Kit（R＆D Systems）；Albumin ELISA Kit（KOMABIOTECH）；FBS （HyClone）；ALB 抗體（GeneTex）；Alexa Fluor?488 Donkey Anti-Goat IgG Antibody （Invitrogen）；DAPI（Sigma）。

1.3 主要儀器

倒置熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss，型號：Zeiss Axiovert A1）； CFX96 Touch 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司，型號：CFX96 Touch）；Zeiss LSM 710 共聚焦顯微鏡（德國Carl Zeiss，型號：Carl Zeiss LSM710）； 全自動生化分析儀（邁瑞Mindray，型號：BS-450）。

2 方法

2.1 干細(xì)胞培養(yǎng)與肝細(xì)胞定向分化

人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)：將未分化的人類胚胎干細(xì)胞H1 接種于鋪有Matrigel 的培養(yǎng)板上，加入mTeSR1 培養(yǎng)液在37 ℃、5%（φ）CO2的條件下進(jìn)行單層培養(yǎng)。 當(dāng)細(xì)胞密度較大時(shí)，采用Accutase 消化液按照1 ∶4～1 ∶6的比例進(jìn)行傳代。

肝細(xì)胞定向分化［11］：當(dāng)細(xì)胞密度接近95%左右時(shí)，加入含有100 ng／mL Activin A 重組蛋白的RPMI／B27 培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d（D3）；然后加入含有20 ng／mL BMP2 蛋白和30 ng／mL FGF4 蛋白的RPMI／B27 培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d（D7）；隨后加入20 ng／mL HGF 蛋白和20 ng／mL KGF 蛋白的RPMI／B27 培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d（D13）；最后在含有20 ng／mL Oncostatin-M 的肝細(xì)胞培養(yǎng)液（不含有EGF）誘導(dǎo)培養(yǎng)8 d（D21）。 實(shí)驗(yàn)組在D13 開始添加1 μm Repsox 直至D21 結(jié)束。

2.2 RT-qPCR 檢測TGFβ1 的表達(dá)

在肝細(xì)胞定向誘導(dǎo)過程中，用Accutase 消化液處理D0、D3、D13、D21 的細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液后離心，加入約1 mL Trizol 試劑，使細(xì)胞完全裂解。 加入氯仿，取水相至預(yù)冷的異丙醇中獲得RNA 沉淀，將其重新溶解于蒸餾水中測定濃度。 依據(jù)ReverTra Ace qPCR RT Kit 的說明書，將2 μg RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA 并適度稀釋，用作下一步qPCR 反應(yīng)的模板。采用SYBR Premix Ex Taq Kit 進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參。

所用引物的序列如下：TGFβ1，5′-CTAATGGTG GAAACCCACAACG-3′（正向），5′-TATCGCCAGGAA TTGTTGCTG-3′（反 向）；GAPDH，5′-AGGGCTGCT TTTAACTCTGGT-3′（正向），5′-CCCCACTTGATTTTG GAGGGA-3′ （反向）。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測TGFβ1 蛋白、albumin 蛋白的含量

嚴(yán)格按照TGFβ1 ELISA Kit、Albumin ELISA Kit說明書的操作步驟進(jìn)行。

2.4 尿素含量測定

當(dāng)細(xì)胞分化至21 d，在培養(yǎng)液中額外加入5 mmol／L NH4Cl，將細(xì)胞繼續(xù)在5%CO2，37 °C 培養(yǎng)24 h。 收集培養(yǎng)液上清，離心取上清。 依據(jù)紫外-谷氨酸脫氫酶法，利用全自動生化分析儀測定培養(yǎng)液上清中的尿素含量。

2.5 免疫熒光檢測albumin 蛋白的表達(dá)

采用4%（φ）多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，加入0.3% Triton X-100 溶液通透30 min，然后加入10%FBS 溶液室溫孵育1 h。 加入羊抗人ALB 一抗于4 ℃冰箱中孵育12 h，PBS 清洗3 次，再加入Alexa Fluor? 488 標(biāo)記的驢抗羊二抗避光孵育1 h，最后加入DAPI 避光孵育5 min，PBS 清洗3 次后封片。 使用Zeiss LSM 710 共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistics（1.0.0.1275）統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肝細(xì)胞分化過程中TGFβ1 的mRNA 表達(dá)量和蛋白分泌量變化

人胚胎干細(xì)胞株H1 定向誘導(dǎo)為肝細(xì)胞過程中，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了顯著的變化，由典型的上皮樣細(xì)胞（D0）變化為間充質(zhì)樣細(xì)胞（D3）再轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀拥母渭?xì)胞（D21），見圖1。 肝細(xì)胞分化過程中TGFβ1 的mRNA 表達(dá)量和蛋白分泌量都呈現(xiàn)先大幅增加后緩慢減少的趨勢，與D21 細(xì)胞相比，胚胎干細(xì)胞中TGFβ1 的mRNA 表達(dá)和蛋白分泌水平較低（P＜0.01）；而D3 和D13 細(xì)胞群體的TGFβ1的mRNA 表達(dá)和蛋白分泌水平較高（P＜0.05），見圖2。

3.2 Repsox 對肝細(xì)胞中TGFβ1 的mRNA 表達(dá)和蛋白分泌水平的影響

在體外肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的第4 階段，加入TGFβ信號通路的特異性抑制劑Repsox，通過檢測D21 細(xì)胞中TGFβ1 的mRNA 表達(dá)量以及上清培養(yǎng)液中TGFβ1 蛋白分泌量發(fā)現(xiàn)，加入Repsox 能夠顯著地抑制D21 細(xì)胞中TGFβ1 的mRNA 表達(dá)量（P＜0.05）和上清培養(yǎng)液中TGFβ1 蛋白的分泌量（P＜0.05），結(jié)果見圖3。

圖1 肝細(xì)胞分化過程中細(xì)胞的形態(tài)變化（標(biāo)尺：20 μm，100×）Figure 1 Morphological changes of hepatocytes during differentiation of hESCs （Scale bar： 20 μm，100×）

圖2 肝細(xì)胞分化過程中TGFβ1 的mRNA 表達(dá)量和蛋白分泌量變化Figure 2 Changes of TGFβ1 mRNA expression and protein secretion during hepatocyte differentiation

3.3 Repsox 對肝細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化效率的影響

如圖4 所示，實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)ALB 蛋白的細(xì)胞數(shù)量多于對照組。 與此同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中albumin 分泌量以及尿素合成量明顯高于對照組（P＜0.05），結(jié)果見圖5。

圖3 Repsox 抑制肝細(xì)胞中TGFβ1 的mRNA 表達(dá)量和蛋白分泌量Figure 3 Inhibition of Repsox on TGFβ1 mRNA expression and protein secretion in hESCs-derived hepatocytes

圖4 對照組與實(shí)驗(yàn)組D21 細(xì)胞中ALB 蛋白的表達(dá)情況（標(biāo)尺：20 μm）Figure 4 ALB expression in D21 cells treated with or without Repsox （Scale bar： 20 μm）

圖5 對照組與實(shí)驗(yàn)組D21 細(xì)胞中白蛋白分泌量及尿素合成量測定Figure 5 Determination of albumin secretion and urea synthesis in D21 cells treated with or without Repsox

4 討論

人多能干細(xì)胞在體外具有自我更新和多譜系分化的潛能，它們在諸多方面都與胚胎外植體有相似之處，因此它們是人們研究胚胎發(fā)育的重要體外模型［7］。 人多能干細(xì)胞能夠在多重信號分子的連續(xù)作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楦渭?xì)胞，該過程的進(jìn)行涉及多種信號通路的參與，相關(guān)分子機(jī)制尚不完全清楚［8］。 在人肝細(xì)胞體外分化過程中，細(xì)胞會在分化初期由原本的上皮細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)；到分化后期，細(xì)胞又會由間充質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)逐漸回到上皮細(xì)胞狀態(tài)，即發(fā)生了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化兩個(gè)事件［9］。 前一個(gè)事件的發(fā)生比較明顯，容易觀察與檢測；而后一個(gè)事件的發(fā)生卻不太顯著，對誘導(dǎo)至第21 天的細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR 檢測，還能夠發(fā)現(xiàn)某些特定間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)［9］。 這可能是體外誘導(dǎo)的肝細(xì)胞在成熟度和功能方面不及原代肝細(xì)胞的原因之一［10］。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及其逆過程的發(fā)生往往與TGFβ 通路密切相關(guān)［11-12］，本研究檢測了肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中TGFβ1 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TGFβ1 基因的表達(dá)和蛋白分泌量在誘導(dǎo)分化初期顯著上調(diào)，而在誘導(dǎo)分化末期則逐漸下調(diào)，但下調(diào)幅度遠(yuǎn)不及上調(diào)幅度大，由此推測TGFβ1 基因的不完全下調(diào)可能是影響肝細(xì)胞分化效率的因素之一。 本研究試圖通過在肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化后期添加小分子抑制劑Repsox 來抑制TGFβ1 基因的表達(dá)［13］，并評估其對肝細(xì)胞分化效率及肝細(xì)胞功能的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在分化后期加入Repsox 以后，誘導(dǎo)至第21 天的細(xì)胞群體中表達(dá)白蛋白的細(xì)胞數(shù)量增加；檢測誘導(dǎo)至第21 天的細(xì)胞群體的白蛋白分泌量和尿素合成量，均發(fā)現(xiàn)相比于對照組有了顯著的增加。 以上結(jié)果說明，通過在誘導(dǎo)分化后期加入小分子抑制劑Repsox 有利于促進(jìn)TGFβ1 基因的表達(dá)下調(diào)，最終引起肝細(xì)胞的分化效率以及肝細(xì)胞功能水平的增加。

本研究建立了提高體外肝分化效率及改善肝細(xì)胞功能的方法，為下一步建立病人個(gè)性化的體外疾病模型和藥篩模型提供了參考；功能上更接近于原代成熟肝細(xì)胞的誘導(dǎo)肝細(xì)胞的獲得，為肝細(xì)胞移植治療提供了可靠的再生資源。