陳懷廣楊燦邦陳曉蕊杜為揚溫欽耀楊智承金桂芳

（廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510006）

細辛腦注射液（又稱細辛醚注射液、α-細辛腦注射液）是一種中藥單體抗炎性祛痰止咳藥。 近年來的臨床研究［1-4］表明細辛腦注射液治療毛細支氣管炎、肺炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病表現(xiàn)出較好的療效。 隨著該藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，不良反應(yīng)報道逐年增加，引發(fā)了人們對細辛腦注射液安全性再評價的重視。 黨安建［5-7］等對不良反應(yīng)監(jiān)測中心收集的細辛腦不良反應(yīng)報告進行統(tǒng)計分析，提示細辛腦注射液誘發(fā)的不良反應(yīng)多為急性過敏樣反應(yīng)，且以速發(fā)型過敏反應(yīng)為主，這類過敏反應(yīng)是由免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的抗原抗體反應(yīng)。 目前主要以臨床癥狀為主要判斷依據(jù)，并無實驗室證據(jù)支持。

本研究按照國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《中藥、天然藥物免疫毒性（過敏性、光過敏反應(yīng)）研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》［8］對細辛腦注射液進行豚鼠被動皮膚過敏試驗（passive cutaneous anaphylaxis，PCA），考察細辛腦注射液的致敏性，為臨床合理用藥提供參考，并檢測致敏豚鼠血清中IgE 的含量初步探索過敏反應(yīng)類型。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性豚鼠，SPF 級，體質(zhì)量250 ～350 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2017-0041。 動物分籠喂養(yǎng)，溫度17 ～25 ℃，相對濕度30%～70%。

1.2 主要試劑

細辛腦注射液（海南利能康泰制藥有限公司，5 mL／支，批號為1701135）；葡萄糖生理鹽水（安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號為160408）；伊文思藍（廣州市齊云生物技術(shù)有限公司， 批號為gy201106）；豚鼠IgE- Elisa 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號為20170315）。

1.3 主要儀器與設(shè)備

渦旋 振 蕩 儀（美 國Essenscien 公 司， V3）；Multiskan Go 型全波長掃描儀（美國Thermo 公司）；微量移液器［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；IMS-70 型全自動雪花制冰機（常熟市雪科電器有限公司）。

2 方法［8?11］

2.1 致敏及制備抗血清

取雄性豚鼠24 只，隨機分為4 組：陰性對照組、細辛腦注射液低劑量組（3.72 mg／kg）、細辛腦高劑量組（7.44 mg／kg）、陽性對照組，每組6 只。 細辛腦注射液低劑量為人臨床用量的等倍劑量，高劑量為人臨床用量的2 倍劑量。 陰性對照組給予生理鹽水，陽性對照組給予同體積5%新鮮蛋清液，致敏途徑為腹腔注射，隔日1 次，共4 次，末次致敏14 d 后取血，3 000 r／min 離心15 min，分離上層血清，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 IgE 含量的測定

采用豚鼠ELISA 試劑盒（競爭法）對“2.1”項中制備的抗血清進行IgE 含量測定。

2.3 被動皮膚過敏反應(yīng)

將各組豚鼠背部脫毛，脫毛面積約為3 cm×4 cm，將“2.1”項中制備的抗血清用生理鹽水分別稀釋為1 ∶2和1 ∶8，分別皮內(nèi)注射于脫毛區(qū)域距脊柱1.5 cm的兩處，注射體積為0.1 mL，進行被動致敏。24 h 后，各組豚鼠靜脈注射含1%伊文思藍的相應(yīng)藥液1 mL 進行激發(fā)。 激發(fā)30 min 后脫頸處死各組豚鼠，剪取背部皮膚，測量皮膚內(nèi)層的藍斑直徑，不規(guī)則斑點直徑為長徑與短徑之和的平均值，直徑＞5 mm者判定為被動過敏反應(yīng)陽性，比較各組過敏反應(yīng)陽性率來確定藥物致敏性。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS19.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組抗血清中的IgE 含量以±s表示，組間比較采用單因素方差分析；陽性率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細辛腦注射液對豚鼠血清IgE 水平的影響

結(jié)果見表1，細辛腦注射液高劑量組和陽性對照組豚鼠血清中IgE 含量均明顯升高，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05 或P＜0.01），細辛腦低劑量組豚鼠血清中IgE 水平與陰性對照組相比增加不明顯。

表1 細辛腦注射液對豚鼠血清IgE 含量影響Table 1 Effects of asarone injection on serum IgE concentrations of guinea pigs（n＝6，±s）

表1 細辛腦注射液對豚鼠血清IgE 含量影響Table 1 Effects of asarone injection on serum IgE concentrations of guinea pigs（n＝6，±s）

與陰性對照組比較：?P＜0．05，??P＜0.01。

組別 劑量／（mg·kg-1）IgE／（mg·L-1）陰性對照組 - 5.15±1.2細辛腦注射液 低劑量組 3.72 5.88±1.6 高劑量組 7.44 7.05±2.0?陽性對照組 5%雞蛋清 9.12±1.9??

3.2 細辛腦注射液對豚鼠被動皮膚過敏反應(yīng)的影響

由表2 可見，抗血清稀釋比例為1 ∶2和1 ∶8 時，陰性對照組豚鼠背部皮膚均無藍斑出現(xiàn)。 陽性對照組豚鼠的背部脊柱左右兩側(cè)均出現(xiàn)明顯藍斑，且藍斑直徑均＞5 mm，陽性反應(yīng)率為100%；細辛腦注射液低、高劑量組與陰性對照組相比，過敏反應(yīng)陽性率均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 且皮內(nèi)注射稀釋比例1 ∶2 抗血清和1 ∶8 抗血清的兩側(cè)出現(xiàn)的藍斑大小不同，注射稀釋比例1 ∶2 抗血清的一側(cè)的過敏反應(yīng)陽性率高于注射1 ∶8 稀釋抗血清的一側(cè)，各組豚鼠背部皮膚藍斑見圖1。

表2 細辛腦注射液對豚鼠被動皮膚過敏反應(yīng)陽性率的影響Table 2 Effect of asarone injection on the positive rate of passive cutaneous anaphylaxis in guinea pigs （n＝6）

圖1 細辛腦注射液對豚鼠被動過敏試驗皮膚藍斑形成的影響（1×）Figure 1 Effects of asarone injection on the formation of blue spots in the skin of guinea pigs in passive anaphylaxis test （1×）

4 討論

近年來中藥注射劑不良反應(yīng)頻發(fā)，國家食品藥品監(jiān)督管理局鼓勵對已上市的中藥注射劑特別是出現(xiàn)不良反應(yīng)的進行安全性再評價［12］。 目前國內(nèi)對細辛腦注射液不良反應(yīng)的研究主要為不良反應(yīng)報告的回顧性分析，而臨床前安全性評價的實驗性研究數(shù)據(jù)缺乏。

被動皮膚過敏試驗是一種比較敏感的測試特異抗體滴度和考察藥物是否誘發(fā)Ⅰ型過敏反應(yīng)的方法。 致敏動物的血清內(nèi)富含IgE 抗體，將其皮內(nèi)注射于正常豚鼠后，IgE Fc 端與皮膚肥大細胞表面特異受體結(jié)合形成IgE 復(fù)合物，使正常動物被動致敏。使用致敏試劑靜脈注射時，抗原抗體結(jié)合導(dǎo)致肥大細胞脫顆粒釋放組胺等過敏介質(zhì)，進而使皮膚局部血管通透性增加，伊文思藍染料可在抗血清皮內(nèi)接種處滲出著色，測量該處皮膚藍染的范圍可知血管通透性變化的大小，能反映該致敏試劑誘發(fā)皮膚過敏反應(yīng)的程度。 本試驗結(jié)果顯示細辛腦注射液低劑量組被動過敏反應(yīng)陽性率為66.7%和33.3%（1 ∶2和1 ∶8 抗血清），細辛腦注射液高劑量組被動過敏反應(yīng)陽性率為100%和83.3%（1 ∶2和1 ∶8 抗血清），說明細辛腦注射液可引起豚鼠非常明顯的被動皮膚過敏反應(yīng)，反應(yīng)強弱與劑量相關(guān)，且血清中IgE 含量高低影響過敏反應(yīng)的強弱，結(jié)果符合文獻［5］中超劑量使用該藥是導(dǎo)致過敏反應(yīng)的可能原因之一的報道，提示臨床使用相關(guān)制劑應(yīng)嚴格規(guī)范使用劑量。

細辛腦注射液不良反應(yīng)報告的分析提示其誘發(fā)的很可能是Ⅰ型過敏反應(yīng)，IgE 是介導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)［11，13］的重要介質(zhì)，血清或體液中IgE 水平的檢測對明確藥物誘發(fā)的是否為Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)和認識藥物誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)機制具有重要意義。 血清IgE 檢測結(jié)果顯示，細辛腦注射液高劑量組血清IgE 的含量與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而細辛腦注射液低劑量組IgE 含量升高并不明顯，與其在被動皮膚過敏試驗中陽性反應(yīng)結(jié)果不一致，這是由于試劑盒敏感性的限制還是由于細辛腦注射液會誘發(fā)多種類型的過敏反應(yīng)，而不局限于Ⅰ型過敏反應(yīng)，有待進一步分析研究。

細辛腦注射液成分復(fù)雜，其生產(chǎn)過程中加入的助溶劑如吐溫-80、丙二醇［14］以及注射劑的生產(chǎn)及存放過程中降解產(chǎn)生的β-細辛腦［15-16］都可能是致敏的原因，找出確切的引發(fā)過敏的成分并提高制劑工藝避免臨床應(yīng)用不良反應(yīng)的發(fā)生，需要科研人員和生產(chǎn)廠家的共同努力。