張靖年畢曉黎胥愛麗李養(yǎng)學李素梅藍森梅

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院／廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州510095；2.中山大學新華學院，廣東 廣州510520）

補肝益腎顆粒原方系廣東省第二中醫(yī)院骨科專家常用的臨床驗方，由淫羊藿、山藥、續(xù)斷、白芍、澤瀉、制何首烏等8 味中藥組成，方中淫羊藿補肝腎之陽［1］，為君藥。 溫性之杜仲［2］、續(xù)斷［3］、桑寄生［4］為臣藥，能補肝腎、強筋骨。 佐以制何首烏補益精血［5］，澤瀉利濕而泄腎濁［6］，白芍柔肝斂陰［7］。 全方肝腎同補，補中寓泄，共奏補益肝腎作用。 該方臨床療效良好，但湯劑存在煎煮、攜帶、使用不方便的特點。 現(xiàn)將其制成顆粒劑，既保持原湯劑的特色和優(yōu)勢，又具有體積小、利于儲藏、便于攜帶、使用方便等優(yōu)點。 但該制劑目前尚無質(zhì)量標準，為較好地控制其質(zhì)量以保證臨床療效，本試驗采用TLC 法定性鑒別方中君藥淫羊藿、佐藥白芍、制何首烏等藥味。研究表明，淫羊藿苷具有改善骨代謝、治療骨質(zhì)疏松癥等藥理作用［8-9］，還可改善生殖功能［10-11］、保護腎臟［12］；川續(xù)斷皂苷Ⅵ對成骨分化具有促進作用［13-14］，并具有一定的肝臟保護作用［15-16］，這與補肝益腎顆粒的功效有一定的關聯(lián)性。 因此，本試驗采用HPLC 法定量測定君藥淫羊藿所含淫羊藿苷、臣藥續(xù)斷所含川續(xù)斷皂苷Ⅵ的質(zhì)量分數(shù)，以期為本品質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CAMAG TLC SAMPLER 4 型自動點樣儀，CAMAG REPROSTAR 3 型薄層成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG 公司）；Waters e2695 Sepatation Module 高效液相色譜儀，Waters 2998 PDA 檢測器，四元梯度泵，Empower Pro 色譜工作站（美國Waters 公司）；KQ5200DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER XS205DU 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）；MilliPore Advantage A10 自動純水機（美國MilliPore 公司）。

1.2 試藥

乙腈等HPLC 所用試劑均為色譜純（德國默克公司）；水為屈臣氏蒸餾水；其他試劑均為分析純（廣州化學試劑廠）。

補肝益腎顆粒（批號：20181004、20181005、20181006）由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供；淫羊藿對照藥材（批號：121632-201502）、白芍對照藥材（批號：120905-201610）、制何首烏對照藥材（批號：121454-201405）、淫羊藿苷對照品（批號：110737-201516，質(zhì)量分數(shù)94.2%）購自中國食品藥品檢定研究院；川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品（批號：C-014-170717，質(zhì)量分數(shù)98.3%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 淫羊藿的鑒別取本品2 g，加水20 mL 使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2 次，每次20 mL，混合乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。 另取淫羊藿對照藥材0.4 g，加水適量，加熱至沸騰并保持微沸30 min，濾過，濾液濃縮至約20 mL，自“用乙酸乙酯振搖提取2 次”起，同法制成對照藥材溶液。 再取除淫羊藿外處方比例的其余7味中藥，按處方工藝制備陰性樣品，取陰性樣品2 g，自“加水20 mL 使溶解”起，同法制成淫羊藿陰性對照溶液。 按照薄層色譜法［17］試驗，吸取上述溶液各3 μL，分別點于同一硅膠H 薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（體積比13 ∶10 ∶10）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以AlCl3試液，105 ℃加熱2 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。 供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。 見圖1。

圖1 淫羊藿鑒別的薄層色譜圖Figure 1 TLC of Epimedii Folium

2.1.2 白芍的鑒別取本品4 g，研細，加乙醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用水飽和正丁醇溶液萃取2 次，每次20 mL，混合水飽和正丁醇液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。 另取白芍對照藥材1 g，加水適量，加熱至沸騰并保持微沸30 min，濾過，濾液濃縮至約20 mL，自“用水飽和正丁醇溶液萃取2 次”起，同法制成對照藥材溶液。 再取除白芍外處方比例的其余7 味中藥，按處方工藝制備陰性樣品，取陰性樣品4 g，自“加乙醇25 mL”起，同法制成白芍陰性對照溶液。 按照薄層色譜法［17］試驗，吸取供試品、對照藥材及陰性對照3 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（體積比40 ∶5 ∶10 ∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%（質(zhì)量濃度）香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱約1 min。 供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的藍紫色斑點，陰性對照無干擾。 見圖2。

圖2 白芍鑒別的薄層色譜圖Figure 2 TLC of Paeoniae Radix Alba

2.1.3 制何首烏的鑒別取本品4 g，加水30 mL 使溶解，用乙醚振搖提取2 次，每次30 mL，混合乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。 另取制何首烏對照藥材1 g，加適量水煮沸30 min，濾過，濾液濃縮至約30 mL，自“用乙醚振搖提取2 次”起，同法制成對照藥材溶液。 再取除制何首烏外處方比例的其余7 味中藥，按處方工藝制備陰性樣品，取陰性樣品4 g，自“加水30 mL 使溶解”起，同法制成制何首烏陰性對照溶液。 按照薄層色譜法［17］試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（體積比10 ∶1 ∶1 ∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。 供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。 見圖3。

2.2 定量測定

2.2.1 對照品溶液的制備取淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 分別含淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ254.75、113.75 μg 的混合對照品溶液，即得。

圖3 制何首烏鑒別的薄層色譜圖Figure 3 TLC of Polygoni Multiflori Radix Praeparata

2.2.2 供試品溶液的制備取本品適量，研細，精密稱取1 g，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，水浴加熱回流處理60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白溶液的制備取甲醇溶液適量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性研究色譜柱：phenomenex Luna Omega Polar C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱；流動相：乙腈（A）-水（B）：0 ～20 min，25%A→30%A；20 ～30 min，30%A；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL／min；檢測波長：212 nm；進樣量：10 μL。分別精密吸取對照品、供試品、空白溶液10 μL，按上述條件測定，理論塔板數(shù)按淫羊藿苷計，不低于3 000；分離度＞1.5。 見圖4。

2.2.5 線性關系考察分別精密稱取淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ10.19、4.55 mg，置于同一10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，記編號MS1。 精密吸取MS1 5 mL 置于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，記編號MS2；依次倍比稀釋制得MS3～MS6。 分別精密吸取上述6 種混合對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.2.4”項下色譜條件測定。 以對照品進樣量X為橫坐標，對應的峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸，得到淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的回歸方程分別為Y1＝1．998 5×105X1-7．369 4×104（r1＝0．999 9）、Y2＝1．791 5×105X2-5．836 2×103（r2＝0．999 9），線性范圍分別為：進樣量0.318 4 ～10.190 0 μg、0.142 2 ～4.550 0 μg。 表明淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ進樣量與峰面積之間均具有良好的線性關系。

圖4 淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的HPLC 色譜圖Figure 4 HPLC chromatograms of icariin and asperosaponin Ⅵ

2.2.6 精密度試驗取批號為201801005 的補肝益腎顆粒，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項下方法測定，連續(xù)進樣測定6 次，計算淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積RSD 值分別為0.38%和0.46%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗取批號為201801005 的補肝益腎顆粒，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項下方法，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定。 計算得淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積RSD值分別為0.88%和0.97%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復性試驗取批號為201801005 的補肝益腎顆粒，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項下方法測定，平行操作6 份。 計算得淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均質(zhì)量分數(shù)分別為0.148 8%、0.193 6%，RSD 值分別為1.60%和1.72%，表明本方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗取已知淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量分數(shù)分別為0.149 4%、0.193 0%的補肝益腎顆粒（批號：201801005）9 份，每份0.5 g，精密稱定。 分別加入為樣品中待測成分約0.5、1.0、1.5倍量的淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.4”項下色譜條件分別進樣測定，計算回收率。 結果淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ平均回收率分別為99.82%、100.70%，表明回收率良好。 見表1。

表1 補肝益腎顆粒中淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ加樣回收率試驗結果Table 1 Recovery results of icariin and asperosaponin Ⅵin Bugan Yishen granules （n＝9）

2.2.10 樣品質(zhì)量分數(shù)測定分別取批號20181004、20181005、20181006 的補肝益腎顆粒各2 份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.4”項下色譜條件進樣測定，計算淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的質(zhì)量分數(shù)，結果見表2。

表2 補肝益腎顆粒中淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量分數(shù)測定結果Table 2 The contents of icariin and asperosaponin Ⅵin Bugan Yishen granules （n＝2） w／%

結果顯示，3 批補肝益腎顆粒中淫羊藿苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均質(zhì)量分數(shù)分別為0.154 3%和0.194 5%，以平均質(zhì)量分數(shù)的80%設限，規(guī)定本品淫羊藿苷質(zhì)量分數(shù)不得低于0.124%，川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量分數(shù)不得低于0.156%。

3 討論

補肝益腎顆粒為水提制劑，因此進行質(zhì)量分數(shù)測定樣品前處理時考察了甲醇-水和乙醇-水溶媒體系，分別在甲醇、50%（體積分數(shù)，下同）甲醇、乙醇和50%乙醇4 種溶媒條件下測定淫羊藿苷和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的質(zhì)量分數(shù)，結果表明甲醇提取效果最佳。淫羊藿苷最大吸收波長為270 nm，而川續(xù)斷皂苷Ⅵ為212 nm，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，在212 nm 下測定淫羊藿苷質(zhì)量分數(shù)與270 nm 下檢測時相比，結果區(qū)別不大，因此選取212 nm 作為測定波長同時測定2 種化學成分的質(zhì)量分數(shù)。

本試驗建立的質(zhì)量標準可快速、準確反映該制劑質(zhì)量，為其臨床療效及質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)，對補肝益腎顆粒的進一步開發(fā)具有一定的指導意義。