王立芳 龍喜貴

(1 廣西壯族自治區(qū)婦產(chǎn)醫(yī)院優(yōu)生遺傳門診，南寧市 530003，電子郵箱：longlbbf@126.com； 2 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷中心，南寧市 530021)

孕婦高齡或胎兒超聲異常等高危因素是產(chǎn)前診斷的指征。對于產(chǎn)前診斷中胎兒染色體異常/畸變的檢測，國內(nèi)外均以常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測G顯帶核型分析及拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)檢測為主要方法。G顯帶核型分析可檢測大于5 Mb的染色體異常[1]。相對于染色體核型分析，單核苷酸多態(tài)性微陣列基因芯片(single nucleotide polymorphism micro array，SNP-array)技術(shù)具有高通量、高分辨率等優(yōu)勢，美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)已推薦其作為診斷評估胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常的一線檢測方法[2]。本研究通過聯(lián)合應(yīng)用需細(xì)胞培養(yǎng)的染色體核型分析及不需細(xì)胞培養(yǎng)的SNP-array技術(shù)，對高危孕婦臍靜脈血進(jìn)行染色體異常的產(chǎn)前診斷，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月至2019年7月在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院行產(chǎn)前篩查及遺傳咨詢時(shí)發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)前診斷指征的4 843例孕婦，年齡18～43歲，入組時(shí)孕周25～32周。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕周≥25周；(2)符合臍靜脈血產(chǎn)前診斷的指征，即產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)(包括臨界風(fēng)險(xiǎn))、高齡、胎兒B超指標(biāo)異常(包括水腫、單臍動(dòng)脈、心室強(qiáng)光斑、腸管回聲增強(qiáng)、腎盂擴(kuò)張、腦室擴(kuò)張、脈絡(luò)叢囊腫、鼻骨缺如、長骨短小等)、不良生育史、輔助生殖術(shù)后等。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有急性感染；(2)有先兆流產(chǎn)傾向；(3)不符合產(chǎn)前診斷指征等。

1.2 檢測方法 侵入性產(chǎn)前診斷取材、檢測方法均遵守廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的要求，所有孕婦術(shù)前常規(guī)進(jìn)行咨詢并簽署知情同意書，結(jié)果出具后復(fù)診及咨詢。B超引導(dǎo)下抽取胎兒臍靜脈血2～3 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管送實(shí)驗(yàn)室行染色體核型分析及SNP-array檢測。

1.2.1 染色體核型分析：取0.5 mL臍靜脈血接種于5 mL GIBCO淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)中培養(yǎng)72 h，加入40 μg/mL秋水仙素(廣州達(dá)暉生物技術(shù)股份有限公司)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后進(jìn)行收獲，滴片及G顯帶(Giemsa染色)，應(yīng)用MetaSystems染色體自動(dòng)掃描分析系統(tǒng)(德國ZEISS公司)進(jìn)行核型分析，每例標(biāo)本核型計(jì)數(shù)20個(gè)中期分裂相，分析不少于5個(gè)核型，如發(fā)現(xiàn)異常則加倍計(jì)數(shù)和分析，必要時(shí)做C、N帶分析。按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2016)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析診斷。

1.2.2 SNP-array技術(shù)：經(jīng)知情同意談話告知患者該檢測的必要性，最終共2 986例患者自愿進(jìn)行檢測。取2 mL臍靜脈血，提取DNA，DNA提取試劑盒(批號：5ak022)及Lab-Aid820核酸提取儀由廈門致善生物科技有限公司提供。獲得DNA后行基因芯片檢測，選用HumanCyto SNP-12 BeadChip Kits芯片及配套試劑盒(美國Illumina公司，批號：WG-320-2101)，按試劑盒操作說明進(jìn)行芯片制備、掃描(美國Illumina iScan芯片掃描儀)。查閱文獻(xiàn)及ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)、DECIPHER(https://decipher.sanger.ac.uk/)、UCSC(http://genome.ucsc.edu/)、OMIM(http://www.omim.org/)、DGV(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)等數(shù)據(jù)庫，分析CNV的致病性。

1.2.3 聯(lián)合檢測結(jié)果的判斷：在2 986例同時(shí)接受兩種方法檢查的病例中，任意一種檢測發(fā)現(xiàn)異常，即判斷為聯(lián)合檢測異常。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4 843例臍靜脈血標(biāo)本總?cè)旧w核型分析結(jié)果 4 843例臍靜脈血標(biāo)本中，共發(fā)現(xiàn)染色體核型異常288例(5.95%)，其中常染色體三體最為常見，見表1。此外，還檢出染色體多態(tài)138例(2.85%)，包括49例(1.01%)1qh+、39例(0.81%)inv(9)(p12q13)、11例(0.23%)9qh+、14例(0.29%)16qh+、7例(0.14%)inv(Y)(p11q11)、7例(0.14%)21pstk+等。

表1 4 843例胎兒臍靜血標(biāo)本的染色體核型異常表現(xiàn)

2.2 同時(shí)行兩種檢查的2 986例臍靜脈血標(biāo)本的檢測結(jié)果 要求同時(shí)行SNP-array檢測的2 986例標(biāo)本中，染色體核型分析提示核型正常、異常、染色體多態(tài)各2 714例(90.89%)、203例(6.80%)、69例(2.31%)。

2 986例臍靜脈血標(biāo)本中，SNP-array技術(shù)共檢出262例(8.77%)胎兒存在致病性CNV。在2 714例染色體核型正常的胎兒中，經(jīng)SNP-array檢測發(fā)現(xiàn)106例(3.91%)存在致病性CNV；在203例染色體核型異常的胎兒中，經(jīng)SNP-array檢測發(fā)現(xiàn)152例(74.88%)存在致病性CNV，其余51例(25.12%)為無明確CNV變化；在69例染色體多態(tài)的胎兒中，經(jīng)SNP-array檢測發(fā)現(xiàn)4例(5.80%)致病性CNV。此外，SNP-array共檢出156例(5.22%)臨床意義不明確變異。從2 568例SNP-array檢測正常及156例SNP-array檢測為臨床意義不明確變異的標(biāo)本中分別檢測46例(22.66%)、5例(2.46%)染色體核型異常。見表2。

表2 2 986例胎兒臍靜脈血標(biāo)本的SNP-array檢測結(jié)果[ n(%)]

2.3 染色體核型分析 染色體核型分析與SNP-array技術(shù)聯(lián)合檢測的異常檢出率為10.48%(313/2 986)。染色體核型分析、SNP-array技術(shù)及兩者聯(lián)合檢測的異常檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.593，P<0.001)。聯(lián)合檢測的異常檢出率與單獨(dú)染色體核型分析異常檢出率(6.80%)、單獨(dú)SNP-array技術(shù)的異常檢出率(8.77%)相比，分別提高了3.68%及1.71%(均P<0.05)。

3 討 論

孕晚期臍靜脈血取材產(chǎn)前診斷是預(yù)防出生缺陷的重要舉措。染色體核型分析及全基因組CNV檢測是產(chǎn)前診斷中染色體病與基因組病的確診方法。傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)染色體核型分析，能夠檢測染色體易位、倒位等平衡變異。而染色體微陣列分析可以檢測染色體核型分析技術(shù)不能檢測出的微小缺失或重復(fù)等，兩者聯(lián)合檢測可提高產(chǎn)前診斷的診斷率。

本研究對存在產(chǎn)前診斷指征的4 843份臍靜脈血標(biāo)本進(jìn)行產(chǎn)前診斷，共檢出異常核型288例(5.95%)，高于吳漢鋒等[3]報(bào)告的結(jié)果(3.87%)，這可能與地域差異，以及部分病例為羊水檢測已為異常需進(jìn)一步臍靜脈血標(biāo)本復(fù)核等有關(guān)。性染色體單體/三體的發(fā)病機(jī)制通常與配子發(fā)生減數(shù)分裂時(shí)性染色體不分離或早期胚胎細(xì)胞有絲分裂中的性染色體不分離有關(guān)[4-5]。本研究結(jié)果顯示，在288例異常的核型中，共檢出29例(10.07%)性染色體單體/三體，檢出率較高，原因可能是性染色體的單體或三體為非致死性，從而使胎兒能存活至產(chǎn)前診斷或出生。21-三體、18-三體、13-三體是導(dǎo)致出生缺陷的常見原因。本研究中，常染色體三體是最為常見的染色體核型異常，包括104例(2.15%)21-三體、36例(0.74%)18-三體、9例(0.19%)13-三體，以21-三體最多見，與其他研究[6]結(jié)果相近。而這3種常見的三體綜合征是胎兒致愚、致殘、致死的常見原因，因此，針對常見三體綜合征的產(chǎn)前診斷工作依然是重點(diǎn)。目前，隨著無創(chuàng)產(chǎn)前檢測等技術(shù)的發(fā)展，在早孕期及中孕期，這三種類型的三體綜合征大多能夠被檢出，真正需要拖延到孕晚期行臍靜脈血產(chǎn)前診斷的情況逐漸減少，但對于未行篩查或絨毛、羊水產(chǎn)前診斷的孕婦，臍靜脈血診斷是對前期漏檢的一種有力補(bǔ)救手段。此外，在本研究中，臍靜脈血染色體核型檢測還檢出49例1qh+、39例inv(9)(p12q13)及14例16qh+等正常染色體多態(tài)性變異，其主要涉及隨體及異染色質(zhì)區(qū)，一般位于1、9、16和Y染色體異染色質(zhì)區(qū)和染色體著絲粒區(qū)。通常染色體多態(tài)性不會(huì)導(dǎo)致相關(guān)的病理表型或不良事件。但也有研究表明，染色體的多態(tài)性可能與不良生育有關(guān)[7]，這可能是因?yàn)閱渭兊娜旧w多態(tài)未能完全排除基因組CNV。本研究中，共有69例染色體多態(tài)核型的標(biāo)本進(jìn)一步行SNP-array分析，最終檢出4例致病性CNV，因此，染色體核型檢測提示“染色體多態(tài)”時(shí)尚需排除致病性CNV的情況，以更全面地給予遺傳咨詢及判斷胎兒預(yù)后。

對胎兒細(xì)胞提取DNA進(jìn)行CNV檢測，是近年來隨著二代測序技術(shù)發(fā)展而逐步被開發(fā)利用于產(chǎn)前診斷的遺傳學(xué)檢查方法。在超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒畸形的情況下，行CNV檢測可提高致病性CNV或臨床意義不明確變異的檢出水平[2]。染色體微陣列分析相當(dāng)于檢測常見非整倍體的核型分析[8]。有學(xué)者認(rèn)為，年齡小于36歲的孕婦，其胎兒發(fā)生致病性CNV的風(fēng)險(xiǎn)高于唐氏綜合癥[9]。這說明不管高齡與否，常規(guī)開展CNV檢測具有必要性。本研究結(jié)果顯示，在2 714份染色體檢測正常的臍血標(biāo)本中，致病性CNV檢出率為3.91%；與單獨(dú)染色體核型分析及單獨(dú)SNP-array檢測相比，二者聯(lián)合應(yīng)用的異常檢出率分別提高了3.68%及1.71%(均P<0.05)，與其他研究[10]報(bào)告的結(jié)果類似。這說明二者聯(lián)合應(yīng)用在一定程度上提高了異常檢出率，可為遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷提供更多的依據(jù)。但檢測前需進(jìn)行遺傳咨詢，從而使患者充分了解SNP-array檢測技術(shù)的益處及局限性，并根據(jù)他們的實(shí)際情況做出是否進(jìn)行檢測的決策[11-12]。

此外，同時(shí)接受染色體核型分析及SNP-array檢測的2 986例標(biāo)本中，有156例臍靜脈血標(biāo)本檢測存在臨床意義不明確變異。這些臨床意義不明確變異由于變異與表型之間的相關(guān)性或證據(jù)不足，無法關(guān)聯(lián)胎兒表型[13]，這給臨床診斷及遺傳咨詢帶來了不小壓力；而僅在某些情況下，從具有已知染色體疾病表型或沒有明顯表型的親本中，鑒定出等效臨床意義的不明確變異才可輔助其診斷[14]。隨著CNV檢測技術(shù)的發(fā)展及廣泛應(yīng)用，數(shù)據(jù)庫及資料逐漸完善，這種情況或許將得到改善。對于新發(fā)現(xiàn)的臨床意義不明確變異，美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)建議對患兒出生后進(jìn)行隨訪[15]。

盡管相對于常規(guī)核型分析，基因芯片技術(shù)具有分辨率及靈敏度更高等特點(diǎn)，但無法檢出染色體核型牽涉到無遺傳物質(zhì)改變的衍生染色體、標(biāo)記染色體、易位、倒位及芯片探針未覆蓋的區(qū)域等。本研究中，從2 568例SNP-array檢測正常及156例SNP-array檢測為臨床意義不明確變異的標(biāo)本中，分別檢測出46例(22.66%)、5例(2.46%)異常染色體核型，這表明盡管核型分析耗時(shí)、費(fèi)力且分辨率有限，但仍然在產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢中的遺傳染色體重排中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。此外，聯(lián)合超聲檢查、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測等的結(jié)果，充分考慮不同檢測方法的局限性，告知各種診斷方法及策略的利弊后，做好檢測前咨詢，由孕婦及家屬知情選擇也是十分必要的[17]。

綜上所述，及時(shí)、有效地進(jìn)行遺傳咨詢，并結(jié)合具體情況在孕期提供產(chǎn)前診斷：聯(lián)合B超、染色體核型分析及基因芯片檢測等多種技術(shù)能提高出生缺陷患兒的檢出率，改善產(chǎn)前診斷的診斷性，有利于優(yōu)生優(yōu)育。但隨著技術(shù)發(fā)展，關(guān)于對無遺傳物質(zhì)改變的衍生染色體、標(biāo)記染色體、易位、倒位是否需進(jìn)行產(chǎn)前診斷，以及是否CNV檢測技術(shù)能完全取代G顯帶核型分析，尚需進(jìn)一步討論。