王立芳 龍喜貴

(1 廣西壯族自治區(qū)婦產(chǎn)醫(yī)院優(yōu)生遺傳門診，南寧市 530003，電子郵箱：longlbbf@126.com； 2 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學遺傳與產(chǎn)前診斷中心，南寧市 530021)

孕婦高齡或胎兒超聲異常等高危因素是產(chǎn)前診斷的指征。對于產(chǎn)前診斷中胎兒染色體異常/畸變的檢測，國內(nèi)外均以常規(guī)細胞遺傳學檢測G顯帶核型分析及拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)檢測為主要方法。G顯帶核型分析可檢測大于5 Mb的染色體異常[1]。相對于染色體核型分析，單核苷酸多態(tài)性微陣列基因芯片(single nucleotide polymorphism micro array，SNP-array)技術具有高通量、高分辨率等優(yōu)勢，美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會已推薦其作為診斷評估胎兒染色體結構異常的一線檢測方法[2]。本研究通過聯(lián)合應用需細胞培養(yǎng)的染色體核型分析及不需細胞培養(yǎng)的SNP-array技術，對高危孕婦臍靜脈血進行染色體異常的產(chǎn)前診斷，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月至2019年7月在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院行產(chǎn)前篩查及遺傳咨詢時發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)前診斷指征的4 843例孕婦，年齡18～43歲，入組時孕周25～32周。納入標準：(1)孕周≥25周；(2)符合臍靜脈血產(chǎn)前診斷的指征，即產(chǎn)前篩查高風險(包括臨界風險)、高齡、胎兒B超指標異常(包括水腫、單臍動脈、心室強光斑、腸管回聲增強、腎盂擴張、腦室擴張、脈絡叢囊腫、鼻骨缺如、長骨短小等)、不良生育史、輔助生殖術后等。排除標準：(1)有急性感染；(2)有先兆流產(chǎn)傾向；(3)不符合產(chǎn)前診斷指征等。

1.2 檢測方法 侵入性產(chǎn)前診斷取材、檢測方法均遵守廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院醫(yī)學倫理學委員會的要求，所有孕婦術前常規(guī)進行咨詢并簽署知情同意書，結果出具后復診及咨詢。B超引導下抽取胎兒臍靜脈血2～3 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管送實驗室行染色體核型分析及SNP-array檢測。

1.2.1 染色體核型分析：取0.5 mL臍靜脈血接種于5 mL GIBCO淋巴細胞培養(yǎng)基，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)中培養(yǎng)72 h，加入40 μg/mL秋水仙素(廣州達暉生物技術股份有限公司)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后進行收獲，滴片及G顯帶(Giemsa染色)，應用MetaSystems染色體自動掃描分析系統(tǒng)(德國ZEISS公司)進行核型分析，每例標本核型計數(shù)20個中期分裂相，分析不少于5個核型，如發(fā)現(xiàn)異常則加倍計數(shù)和分析，必要時做C、N帶分析。按照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2016)標準進行核型分析診斷。

1.2.2 SNP-array技術：經(jīng)知情同意談話告知患者該檢測的必要性，最終共2 986例患者自愿進行檢測。取2 mL臍靜脈血，提取DNA，DNA提取試劑盒(批號：5ak022)及Lab-Aid820核酸提取儀由廈門致善生物科技有限公司提供。獲得DNA后行基因芯片檢測，選用HumanCyto SNP-12 BeadChip Kits芯片及配套試劑盒(美國Illumina公司，批號：WG-320-2101)，按試劑盒操作說明進行芯片制備、掃描(美國Illumina iScan芯片掃描儀)。查閱文獻及ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)、DECIPHER(https://decipher.sanger.ac.uk/)、UCSC(http://genome.ucsc.edu/)、OMIM(http://www.omim.org/)、DGV(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)等數(shù)據(jù)庫，分析CNV的致病性。

1.2.3 聯(lián)合檢測結果的判斷：在2 986例同時接受兩種方法檢查的病例中，任意一種檢測發(fā)現(xiàn)異常，即判斷為聯(lián)合檢測異常。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 4 843例臍靜脈血標本總?cè)旧w核型分析結果 4 843例臍靜脈血標本中，共發(fā)現(xiàn)染色體核型異常288例(5.95%)，其中常染色體三體最為常見，見表1。此外，還檢出染色體多態(tài)138例(2.85%)，包括49例(1.01%)1qh+、39例(0.81%)inv(9)(p12q13)、11例(0.23%)9qh+、14例(0.29%)16qh+、7例(0.14%)inv(Y)(p11q11)、7例(0.14%)21pstk+等。

表1 4 843例胎兒臍靜血標本的染色體核型異常表現(xiàn)

2.2 同時行兩種檢查的2 986例臍靜脈血標本的檢測結果 要求同時行SNP-array檢測的2 986例標本中，染色體核型分析提示核型正常、異常、染色體多態(tài)各2 714例(90.89%)、203例(6.80%)、69例(2.31%)。

2 986例臍靜脈血標本中，SNP-array技術共檢出262例(8.77%)胎兒存在致病性CNV。在2 714例染色體核型正常的胎兒中，經(jīng)SNP-array檢測發(fā)現(xiàn)106例(3.91%)存在致病性CNV；在203例染色體核型異常的胎兒中，經(jīng)SNP-array檢測發(fā)現(xiàn)152例(74.88%)存在致病性CNV，其余51例(25.12%)為無明確CNV變化；在69例染色體多態(tài)的胎兒中，經(jīng)SNP-array檢測發(fā)現(xiàn)4例(5.80%)致病性CNV。此外，SNP-array共檢出156例(5.22%)臨床意義不明確變異。從2 568例SNP-array檢測正常及156例SNP-array檢測為臨床意義不明確變異的標本中分別檢測46例(22.66%)、5例(2.46%)染色體核型異常。見表2。

表2 2 986例胎兒臍靜脈血標本的SNP-array檢測結果[ n(%)]

2.3 染色體核型分析 染色體核型分析與SNP-array技術聯(lián)合檢測的異常檢出率為10.48%(313/2 986)。染色體核型分析、SNP-array技術及兩者聯(lián)合檢測的異常檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=25.593，P<0.001)。聯(lián)合檢測的異常檢出率與單獨染色體核型分析異常檢出率(6.80%)、單獨SNP-array技術的異常檢出率(8.77%)相比，分別提高了3.68%及1.71%(均P<0.05)。

3 討 論

孕晚期臍靜脈血取材產(chǎn)前診斷是預防出生缺陷的重要舉措。染色體核型分析及全基因組CNV檢測是產(chǎn)前診斷中染色體病與基因組病的確診方法。傳統(tǒng)的細胞遺傳學技術染色體核型分析，能夠檢測染色體易位、倒位等平衡變異。而染色體微陣列分析可以檢測染色體核型分析技術不能檢測出的微小缺失或重復等，兩者聯(lián)合檢測可提高產(chǎn)前診斷的診斷率。

本研究對存在產(chǎn)前診斷指征的4 843份臍靜脈血標本進行產(chǎn)前診斷，共檢出異常核型288例(5.95%)，高于吳漢鋒等[3]報告的結果(3.87%)，這可能與地域差異，以及部分病例為羊水檢測已為異常需進一步臍靜脈血標本復核等有關。性染色體單體/三體的發(fā)病機制通常與配子發(fā)生減數(shù)分裂時性染色體不分離或早期胚胎細胞有絲分裂中的性染色體不分離有關[4-5]。本研究結果顯示，在288例異常的核型中，共檢出29例(10.07%)性染色體單體/三體，檢出率較高，原因可能是性染色體的單體或三體為非致死性，從而使胎兒能存活至產(chǎn)前診斷或出生。21-三體、18-三體、13-三體是導致出生缺陷的常見原因。本研究中，常染色體三體是最為常見的染色體核型異常，包括104例(2.15%)21-三體、36例(0.74%)18-三體、9例(0.19%)13-三體，以21-三體最多見，與其他研究[6]結果相近。而這3種常見的三體綜合征是胎兒致愚、致殘、致死的常見原因，因此，針對常見三體綜合征的產(chǎn)前診斷工作依然是重點。目前，隨著無創(chuàng)產(chǎn)前檢測等技術的發(fā)展，在早孕期及中孕期，這三種類型的三體綜合征大多能夠被檢出，真正需要拖延到孕晚期行臍靜脈血產(chǎn)前診斷的情況逐漸減少，但對于未行篩查或絨毛、羊水產(chǎn)前診斷的孕婦，臍靜脈血診斷是對前期漏檢的一種有力補救手段。此外，在本研究中，臍靜脈血染色體核型檢測還檢出49例1qh+、39例inv(9)(p12q13)及14例16qh+等正常染色體多態(tài)性變異，其主要涉及隨體及異染色質(zhì)區(qū)，一般位于1、9、16和Y染色體異染色質(zhì)區(qū)和染色體著絲粒區(qū)。通常染色體多態(tài)性不會導致相關的病理表型或不良事件。但也有研究表明，染色體的多態(tài)性可能與不良生育有關[7]，這可能是因為單純的染色體多態(tài)未能完全排除基因組CNV。本研究中，共有69例染色體多態(tài)核型的標本進一步行SNP-array分析，最終檢出4例致病性CNV，因此，染色體核型檢測提示“染色體多態(tài)”時尚需排除致病性CNV的情況，以更全面地給予遺傳咨詢及判斷胎兒預后。

對胎兒細胞提取DNA進行CNV檢測，是近年來隨著二代測序技術發(fā)展而逐步被開發(fā)利用于產(chǎn)前診斷的遺傳學檢查方法。在超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒畸形的情況下，行CNV檢測可提高致病性CNV或臨床意義不明確變異的檢出水平[2]。染色體微陣列分析相當于檢測常見非整倍體的核型分析[8]。有學者認為，年齡小于36歲的孕婦，其胎兒發(fā)生致病性CNV的風險高于唐氏綜合癥[9]。這說明不管高齡與否，常規(guī)開展CNV檢測具有必要性。本研究結果顯示，在2 714份染色體檢測正常的臍血標本中，致病性CNV檢出率為3.91%；與單獨染色體核型分析及單獨SNP-array檢測相比，二者聯(lián)合應用的異常檢出率分別提高了3.68%及1.71%(均P<0.05)，與其他研究[10]報告的結果類似。這說明二者聯(lián)合應用在一定程度上提高了異常檢出率，可為遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷提供更多的依據(jù)。但檢測前需進行遺傳咨詢，從而使患者充分了解SNP-array檢測技術的益處及局限性，并根據(jù)他們的實際情況做出是否進行檢測的決策[11-12]。

此外，同時接受染色體核型分析及SNP-array檢測的2 986例標本中，有156例臍靜脈血標本檢測存在臨床意義不明確變異。這些臨床意義不明確變異由于變異與表型之間的相關性或證據(jù)不足，無法關聯(lián)胎兒表型[13]，這給臨床診斷及遺傳咨詢帶來了不小壓力；而僅在某些情況下，從具有已知染色體疾病表型或沒有明顯表型的親本中，鑒定出等效臨床意義的不明確變異才可輔助其診斷[14]。隨著CNV檢測技術的發(fā)展及廣泛應用，數(shù)據(jù)庫及資料逐漸完善，這種情況或許將得到改善。對于新發(fā)現(xiàn)的臨床意義不明確變異，美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會建議對患兒出生后進行隨訪[15]。

盡管相對于常規(guī)核型分析，基因芯片技術具有分辨率及靈敏度更高等特點，但無法檢出染色體核型牽涉到無遺傳物質(zhì)改變的衍生染色體、標記染色體、易位、倒位及芯片探針未覆蓋的區(qū)域等。本研究中，從2 568例SNP-array檢測正常及156例SNP-array檢測為臨床意義不明確變異的標本中，分別檢測出46例(22.66%)、5例(2.46%)異常染色體核型，這表明盡管核型分析耗時、費力且分辨率有限，但仍然在產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢中的遺傳染色體重排中發(fā)揮關鍵作用[16]。此外，聯(lián)合超聲檢查、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測等的結果，充分考慮不同檢測方法的局限性，告知各種診斷方法及策略的利弊后，做好檢測前咨詢，由孕婦及家屬知情選擇也是十分必要的[17]。

綜上所述，及時、有效地進行遺傳咨詢，并結合具體情況在孕期提供產(chǎn)前診斷：聯(lián)合B超、染色體核型分析及基因芯片檢測等多種技術能提高出生缺陷患兒的檢出率，改善產(chǎn)前診斷的診斷性，有利于優(yōu)生優(yōu)育。但隨著技術發(fā)展，關于對無遺傳物質(zhì)改變的衍生染色體、標記染色體、易位、倒位是否需進行產(chǎn)前診斷，以及是否CNV檢測技術能完全取代G顯帶核型分析，尚需進一步討論。