余 明 陳 濤 張 歡 徐 林 夏 豪

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢市 430060，電子郵箱：691027408qq@qq.com)

急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)最常見的類型包括ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angian，UA)[1]。世界衛(wèi)生組織推薦門-球時間不應(yīng)大于90min[2]，因此及時的診治對于ACS患者至關(guān)重要。近年來心肌梗死患者的危險分層一直是研究的熱點(diǎn)，盡管目前臨床上普遍把肌鈣蛋白作為診斷心肌梗死的一項(xiàng)高特異性和高敏感性的標(biāo)志物，但越來越多的危險分層因子被證明可在ACS患者的臨床診斷、治療及預(yù)后中提供重要依據(jù)。微小RNA (microRNA，miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸的內(nèi)源性保守型小非編碼核糖體RNA，在血漿、血清和尿液中都能檢測到，并在人體內(nèi)環(huán)境中保持非常穩(wěn)定的狀態(tài)，其通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄在大多數(shù)真核細(xì)胞的增殖、分化、生長和凋亡過程中，都發(fā)揮著基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑的作用[3]。研究顯示，在急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)動物模型和ST段抬高型心肌梗死患者血漿中，一些心臟相關(guān)miRNA如miRNA-1、miRNA-133a和miRNA-499，其血漿水平顯著升高[4]，部分與ACS相關(guān)的miRNA也被證實(shí)與目前臨床上公認(rèn)的特異性心肌梗死壞死標(biāo)志物心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)密切相關(guān)[5]。隨著心血管病機(jī)制研究的不斷更新以及基因技術(shù)日趨成熟，miRNA作為心血管疾病診治的新型生物標(biāo)志物也逐漸被學(xué)者們關(guān)注。近年來，在ACS動物模型實(shí)驗(yàn)中miRNA-130a被證實(shí)參與心肌梗死的發(fā)生發(fā)展[6-7]。故本研究探討miRNA-130a在ACS患者血漿中的表達(dá)情況及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2017年9月至2018年6月武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科收治的101例ACS患者，包含AMI患者54例(AMI組)及UA患者47例(UA組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>18歲；(2)臨床癥狀符合ACS，如典型胸痛或突然發(fā)作的呼吸困難；(3)入院心電圖提示至少2條相鄰的前區(qū)導(dǎo)聯(lián)ST段抬高0.2 mV，或至少2條相鄰的肢體導(dǎo)聯(lián)ST段抬高0.1 mV，或出現(xiàn)新的左束支傳導(dǎo)阻滯；(4)入院1 h內(nèi)未經(jīng)治療，心肌酶學(xué)提示ACS。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝腎等器官功能障礙、慢性疾病、神經(jīng)運(yùn)動系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重心律失常、心源性休克的患者；(2)未經(jīng)治療死亡以及發(fā)病時間不詳?shù)幕颊?，或發(fā)病12 h內(nèi)未采集血樣的患者。同時選取于該院健康體檢的20例健康者作為對照組，心肌酶學(xué)、心臟彩超、冠脈造影均正常，且排除其他臟器嚴(yán)重疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有研究對象或其家屬均對本研究內(nèi)容知情同意。

1.2 樣本的收集 ACS患者和對照組分別在入院24 h內(nèi)、體檢當(dāng)日使用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管采集靜脈血5 mL，置于4℃低溫冰箱靜置30 min后以3 000 r/min離心10 min，收集上層血清于無菌無RNA酶EP管中，存儲于-80℃冰箱中備用檢測。

1.3 miRNA-130a的檢測方法 取200 μL上述血漿樣本于1 000 μL無菌無RNA酶EP管中，加裂解液充分混勻裂解，應(yīng)用 Tripure Total RNA Extraction Reagent試劑盒(ELK Biotechnology公司，批號：EP013)提取血清總RNA，提取的RNA用分光光度計(jì)測濃度及純度，保證RNA溶液的A260/A280比值在1.8～2.1之間，RNA純度高、無降解、無DNA 污染即可用于cDNA合成。第一鏈cDNA的合成采用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒(ELK Biotechnology公司，批號：EQ002)，選用U6作為內(nèi)參基因。U6正向引物 5′-3′CTCGCTTCGGCAGCACA，反向引物5′-3′AACGCTTCACGAATTTGCGT；miRNA-130a引物序列正向引物 5′-3′CTCGCTTCGGCAGCACAT，反向引物5′-3′AACGCTTCACGAATTTGCGT。引物均由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。按試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積為15 μL，包括7 μL預(yù)混液，3 μL引物和5 μL樣本RNA；反應(yīng)條件為16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃15 min。在Life Technologies公司的StepOnePlusTMReal-Time PCR儀上完成實(shí)時熒光定量PCR，每個樣品均設(shè)3個復(fù)孔，使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix試劑盒(ELK Biotechnology公司，批號：EQ001)，按照說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)體系包括2×Master Mix 5.0 μL，2.5 μM引物工作液1.0 μL，CDNA模板 1.0 μL，ddH2O 2.0 μL，Rox 1.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)镻CR儀上預(yù)變95℃，30 s，循環(huán)40次(95℃，5s→58℃，30s→72℃)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，獲得產(chǎn)物擴(kuò)增曲線、融解曲線及CT 值，通過z-△△CT法計(jì)算miRNA-130a的相對表達(dá)量。

1.4 收集臨床資料 收集入院24 h內(nèi)ACS患者的心臟彩超指標(biāo)、冠狀動脈造影指標(biāo)及生化指標(biāo)，包括超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)、肌酸激酶同工酶(creatinine kinase MB isoenzyme，CK-MB)、肌紅蛋白、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、N-末端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)、Gensini評分、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、總膽固醇、三酰甘油、尿酸、纖維蛋白原、HDL等。并收集對照組心肌酶指標(biāo)。

1.5 冠狀動脈Gensini評分 所有ACS患者于住院期間行冠狀動脈造影檢查，結(jié)果由2～3名心內(nèi)科專業(yè)副高級及以上醫(yī)生確定及審核。常規(guī)左側(cè)冠狀動脈投射6個體位，右側(cè)冠狀動脈投射2個體位，并根據(jù)個體病情適當(dāng)增加投射體位。以各個投射體位中狹窄最嚴(yán)重程度作為病變狹窄程度。依據(jù)冠狀動脈直徑狹窄≥50%累及左主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動脈的支數(shù)分為單支病變、雙支病變(累及左主干為雙支病變)及三支病變。采用Gensini積分系統(tǒng)對每支冠狀動脈病變狹窄程度進(jìn)行定量評分，每處病變的積分為狹窄程度的評分乘以相應(yīng)病變部位的系數(shù)。狹窄程度評分：直徑狹窄<25%計(jì)1分，25%≤直徑狹窄<50%計(jì)2分，50%≤直徑狹窄<75%計(jì)4分，75%≤直徑狹窄<90%計(jì)8分，90 %≤直徑狹窄<99%計(jì)16分，直徑狹窄≥99%計(jì)32分。不同冠狀動脈分支相應(yīng)系數(shù)：左主干病變×5；左前降支病變近端×2.5，中段×1.5；對角支病變第一對角支×1，第二對角支×0.5；左回旋支病變近端×2.5，遠(yuǎn)端×1；后降支×1；后側(cè)支×0.5；右冠狀動脈病變近、中、遠(yuǎn)和后降支均×1。各病變支得分總和即為患者的冠狀動脈病變狹窄程度總積分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t法；非正態(tài)分布計(jì)量資料以[M(QR)]表示，比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評估m(xù)iRNA-130a對AMI及UA的診斷價值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組研究對象的一般資料及檢測指標(biāo)比較 3組的性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。對照組、UA組、AMI組miRNA-130a相對表達(dá)量、CK-MB、肌紅蛋白、cTnI均依次升高(P<0.05)，見表1。

表1 3組研究對象臨床資料的比較

注：與AMI組比較，#P<0.05；與UA組比較，*P<0.05。

2.2 ACS患者臨床指標(biāo)與miRNA-130a表達(dá)量的相關(guān)性 ACS患者的miRNA-130a相對表達(dá)量與HDL、LVEF均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.325、-0.437，均P<0.001)，與CK-MB、肌紅蛋白、cTnI、 NT-proBNT、Gensini評分、總膽固醇、三酰甘油、hs-CRP、尿酸、纖維蛋白原均呈正相關(guān)(r=0.486、0.445、0.566、0.399、0.535、0.485、0.326、0.285、0.436、0.215，均P<0.001)。

2.3 miRNA-130a、cTnI、CK-MB、Gensini評分對UA及AMI的診斷價值 RCO曲線分析結(jié)果顯示，血漿miRNA-130a、cTnI、CK-MB水平及Gensini評分在診斷UA的曲線下面積分別為0.982、0.352、0.650、0.955。血漿miRNA-130a、cTnI、CK-MB、Gensini評分診斷AMI的曲線下面積分別為1.000、0.948、0.859、0.991。見表2～3，圖1～2。

表2 miRNA-130a、cTnI、CK-MB及Gensini評分對UA的診斷價值

表3 miRNA-130a、cTnI、CK-MB及Gensini評分對AMI的診斷價值

圖1 miRNA-130a、cTnI、CK-MB及Gensini評分診斷UA的ROC曲線 圖2 miRNA-130a、cTnI、CK-MB及Gensini評分診斷AMI的ROC曲線

3 討 論

ACS是以冠狀動脈內(nèi)斑塊不穩(wěn)定為主要病理特征，臨床表現(xiàn)為心肌缺血的一類綜合征，包括UA、非ST段抬高心肌梗死和ST段抬高心肌梗死，在臨床工作中不易鑒別[8-9]。如果有一種更靈敏、更具特異性的生物標(biāo)志物能夠用于區(qū)分ACS類型，同時能夠鑒別心源性疾病以外的疾病(如縱隔疾病、反流性食管炎)，將大大提高ACS的診斷正確率。miRNA在心臟發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生中起到重要的調(diào)控作用[10]。目前，在用于ACS診斷和評估預(yù)后的各種循環(huán)miRNA中，最具研究價值的是miRNA-1-3p[11]、miRNA-133a-3p和miRNA-133b[12]，以及對心臟具有特異性的miRNA-499a-5p[13]。研究顯示，血漿中miRNA表達(dá)水平與目前國際公認(rèn)的心肌壞死特異性標(biāo)志物cTnI有相同的時間演變進(jìn)程[14]。

Chen等[15]建立缺血缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷動物模型，發(fā)現(xiàn)缺氧心肌細(xì)胞中miRNA-130a的表達(dá)顯著增加，且其表達(dá)量與心肌細(xì)胞損傷程度呈正比，反之抑制miRNA-130a的表達(dá)則可以顯著減輕心肌細(xì)胞損傷；其并采用人長鏈非編碼RNA芯片V3.0進(jìn)行基因差異分析，也發(fā)現(xiàn)miRNA-130a在心肌梗死后心肌細(xì)胞中過表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，對照組、UA組、AMI組的血漿 miRNA-130a相對表達(dá)量依次升高(P<0.05)，提示在ACS患者中miRNA-130a表達(dá)上調(diào)，同時其或可用于鑒別AMI及UA。 cTnI、CK-MB、肌紅蛋白是目前全世界公認(rèn)的診斷急性心肌梗死的特異性心肌標(biāo)志物[16]。本研究中，UA組、AMI組cTnI、CK-MB、肌紅蛋白水平均高于對照組(均P<0.05)，提示ACS患者血漿中miRNA-130a表達(dá)量與以上心肌壞死標(biāo)志物水平變化趨勢有良好的一致性。Pearson相關(guān)分析顯示，ACS患者的miRNA-130a相對表達(dá)量與CK-MB和cTnI水平、Gensini評分均呈正相關(guān)(均P<0.05)，提示將血漿miRNA-130a相對表達(dá)量與CK-MB、cTnI、冠脈Gensini評分相結(jié)合，或可在診斷ACS、判斷冠脈狹窄程度方面為臨床醫(yī)生提供重要參考依據(jù)。此外，本研究中miRNA-130a也與ACS發(fā)病危險因素如NT-proBNP、總膽固醇、尿酸、HDL等[17]具有相關(guān)性(P<0.05)。其中NT-proBNP由心室心肌合成和分泌，其在ACS患者中的表達(dá)明顯升高[18]，是ACS的重要診斷標(biāo)記物和短期死亡率的重要獨(dú)立預(yù)測因子。

ROC曲線結(jié)果顯示，miRNA-130a表達(dá)量診斷AMI的曲線下面積達(dá)1.000，診斷靈敏度與Gensini評分相近，提示其對AMI具有非常高的診斷效能；其診斷AMI的靈敏度優(yōu)于心肌梗死特異性指標(biāo)cTnI，但特異度較cTnI差，這提示在臨床工作中如綜合評估二者的檢測結(jié)果，能提高對AMI診斷的準(zhǔn)確性和及時性。此外，miRNA-130a表達(dá)量診斷AMI的曲線下面積達(dá)0.982，具有較高的診斷效能；其曲線下面積、敏感性和特異性均與Gensini評分相似，且均優(yōu)于 cTnI、CK-MB。在臨床工作中，有部分高齡UA患者癥狀比較隱匿，且對冠脈造影檢查手術(shù)耐受能力較差，因此如果能結(jié)合血漿 miRNA-130a表達(dá)量，或可提高這部分患者的診斷陽性率，從而使臨床醫(yī)生采取更積極有效的治療方案。

綜上所述，UA和AMI患者血漿miRNA-130a表達(dá)水平上調(diào)，并有可能為臨床工作中鑒別ACS分型提供重要依據(jù)。血漿miRNA-130a水平對AMI及UA均有較高的診斷效能，其與目前公認(rèn)的心肌梗死特異性標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用，有望提高ACS的診斷特異性、敏感性及時效性。