彭 朋，王大寧，秦永生，薄 海，孫伯貽

T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，包括輔助性T(T helper，Th)和細(xì)胞毒性T(cytotoxic T lymphocytes，Tc)兩個(gè)亞群，Th細(xì)胞可繼續(xù)分化為Th1[主要分泌干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)]、Th2[主要分泌白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)]、Th17[主要分泌IL-17A]和調(diào)節(jié)性T(regulatory T，Treg)[主要分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)]四個(gè)亞群。Th各亞群彼此間相互協(xié)調(diào)、相互制約并形成Th1/Th2和Th17/Treg平衡，在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要調(diào)控作用[1]。

當(dāng)前，部隊(duì)軍事訓(xùn)練負(fù)荷(包括負(fù)荷量和負(fù)荷強(qiáng)度)和難度不斷加大，長(zhǎng)時(shí)間大負(fù)荷訓(xùn)練后感染性疾病發(fā)生率增加，即運(yùn)動(dòng)性免疫抑制。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，武警戰(zhàn)士連續(xù)3 d大負(fù)荷訓(xùn)練后機(jī)體出現(xiàn)明顯的免疫抑制，其機(jī)制之一可能與運(yùn)動(dòng)性低血睪酮與高皮質(zhì)醇血癥有關(guān)[2]。因此，適時(shí)監(jiān)測(cè)戰(zhàn)士的免疫功能對(duì)于避免運(yùn)動(dòng)性免疫抑制、過度疲勞等相關(guān)訓(xùn)練傷病具有重要意義。近年來，競(jìng)技與軍事體育領(lǐng)域興起一種省時(shí)有效的運(yùn)動(dòng)方式——高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練(high-intensity interval training，HIIT)。本研究旨在探討急性(1次)和短期(4周)HIIT對(duì)T淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡的影響，為科學(xué)合理安排訓(xùn)練以及預(yù)防運(yùn)動(dòng)性免疫抑制提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 受試對(duì)象 選取某部隊(duì)武警男性戰(zhàn)士23名，均為第3～4年兵，年齡(23.8±2.2)歲，身高(1.73±0.06)m，體重(75.3±5.1)kg。受試者具有較高的軍事素質(zhì)(均為訓(xùn)練標(biāo)兵)，身體健康，均無心血管疾病、糖尿病、慢性感染、骨骼肌肉病史及其他嚴(yán)重疾患病史，無常規(guī)用藥史，無煙酒嗜好。

1.2 HIIT方案 參照課題組前期建立的方法[3]在400 m標(biāo)準(zhǔn)跑道進(jìn)行HIIT。利用心率貯備(heart rate reserve，HRR)百分比估算靶心率以確定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，靶心率的計(jì)算公式：[(220-年齡)-靜態(tài)心率]×(60%～80%)+靜態(tài)心率。受試者先進(jìn)行10～15 min熱身(慢跑和拉伸)，隨后開始正式訓(xùn)練，即以90%～95%HRR強(qiáng)度快跑3 min，然后以45%～50%HRR強(qiáng)度慢跑3 min，共完成6組，3次/周，共4周。訓(xùn)練過程中佩戴遙測(cè)心率表(Polar FT1，芬蘭)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)受試者心率以控制運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度在靶心率范圍內(nèi)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群分型 分別于第1次HIIT(記作HIIT1)運(yùn)動(dòng)前(pre)、運(yùn)動(dòng)后即刻(p0)、運(yùn)動(dòng)后60 min(p60)及末次HIIT后48 h安靜狀態(tài)下(post)靜脈取血10 ml，肝素抗凝。取100 μl抗凝血，加2 ml紅細(xì)胞裂解液，與CD3-PerCPeFluor710(總T細(xì)胞)、CD4-APCeFluor780(Th細(xì)胞)、CD8-V500(Tc細(xì)胞)、CD56-FITC(NK細(xì)胞)、CD19-PE(B細(xì)胞)、CD161-FITC(Th17細(xì)胞)、CD25-PerCP-Cy5.5和CD127-PE-Cy7(Treg細(xì)胞)單克隆抗體避光孵育20 min，300 g離心5 min。用2 ml PBS緩沖液洗滌后離心5 min。美國(guó)產(chǎn)FACSCantoTM II型流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群分型。

1.4 T淋巴細(xì)胞體外刺激實(shí)驗(yàn) 利用佛波醇乙酯/離子霉素激活T細(xì)胞，通過表面受體表達(dá)和細(xì)胞因子產(chǎn)生檢測(cè)免疫應(yīng)答功能和穩(wěn)態(tài)平衡。相應(yīng)的抗體包括：細(xì)胞因子IFN-γ-FITC(Th1亞群)、IL-4-PE(Th2亞群)、IL-17A-PE(Th17亞群)、TGF-β-FITC(Treg亞群)，以及Treg細(xì)胞活化標(biāo)志物CD39-APC、潛在相關(guān)多肽(latency-associated peptides，LAP-PE)和糖蛋白A重復(fù)序列(glycoprotein A repetitions predominant，GARP-APC)。取抗體與相應(yīng)細(xì)胞亞群(見1.3)避光孵育后用流式細(xì)胞儀(FACSCantoTM Ⅱ型，美國(guó))檢測(cè)陽性細(xì)胞與陰性細(xì)胞的分群情況，以陽性細(xì)胞率(即陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比)代表相對(duì)表達(dá)量。用未經(jīng)激活的全血作為平行對(duì)照。

2 結(jié) 果

未經(jīng)佛波醇乙酯/離子霉素刺激時(shí)，T淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡標(biāo)志物(表面受體和細(xì)胞因子)均無顯著性變化。刺激實(shí)驗(yàn)后，不同T淋巴細(xì)胞亞群特異標(biāo)志物的表達(dá)量存在差異。

2.1 Th1/Th2 HIIT1后即刻CD4+、CD8+、CD8high和CD8lowT細(xì)胞IFN-γ顯著上調(diào)(P<0.05)，60 min時(shí)較運(yùn)動(dòng)后即刻降低(P<0.05)。HIIT1后各T淋巴細(xì)胞亞群IL-4表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4周HIIT前后各T淋巴細(xì)胞亞群IFN-γ和IL-4表達(dá)量差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 23名武警戰(zhàn)士一次急性HIIT對(duì)Th1/Th2平衡的影響

注：pre，訓(xùn)練前；p0，一次HIIT后即刻；p60，一次HIIT后60 min；Post,4周訓(xùn)練后；與pre比較，①P<0.05，與p0比較，②P<0.05

2.2 Th17/Treg HIIT1后60 min時(shí)Treg細(xì)胞GARP、LAP和CD39表達(dá)升高(P<0.05)。4周HIIT后Treg細(xì)胞LAP表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。本研究未檢測(cè)出Th17分泌的IL-17A以及Treg分泌的TGF-β(表2)。

表2 23名武警戰(zhàn)士一次急性HIIT對(duì)Th17/Treg平衡的影響

注：pre，訓(xùn)練前；p0，一次HIIT后即刻；p60，一次HIIT后60 min；Post,4周訓(xùn)練后；與pre比較，①P<0.05，與p0比較，②P<0.05；“-”表示未檢出

3 討 論

3.1 急性HIIT對(duì)T淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡的影響 研究證實(shí)，長(zhǎng)時(shí)間(≥1 h)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)抑制Th1增殖與分化[4, 5]，但短時(shí)間(≤30 min)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)Th1/Th2穩(wěn)態(tài)平衡的影響卻結(jié)論不一。在本研究中，HIIT1后即刻IFN-γ表達(dá)上調(diào)，IL-4并無顯著性變化，提示Th1/Th2平衡向Th1漂移。HIIT1后60 min，IFN-γ和IL-4與運(yùn)動(dòng)前均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明Th1/Th2穩(wěn)態(tài)平衡在運(yùn)動(dòng)后1 h恢復(fù)正常。

1次急性運(yùn)動(dòng)能夠改變Th17/Treg穩(wěn)態(tài)平衡，影響效果依賴于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。Perry等[6]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度訓(xùn)練后Treg計(jì)數(shù)下降，T細(xì)胞趨向于分化為Th17且IL-17A分泌增多。有趣的是，馬拉松比賽后，血漿和尿中IL-17A出現(xiàn)暫時(shí)性下降[7]。令人意外的是，本研究并未檢測(cè)出IL-17A和TGF-β表達(dá)，可能是健康成年人外周血中Th17和Treg細(xì)胞含量甚微，很難檢測(cè)出相應(yīng)的細(xì)胞因子水平。由于Treg細(xì)胞具有抑制其他免疫細(xì)胞并維持免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受的作用[8]，我們進(jìn)一步測(cè)定Treg早期活化標(biāo)志物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GARP、LAP和CD39在HIIT1后即刻無顯著性變化，60 min后均表達(dá)上調(diào)，提示HIIT對(duì)Treg功能的影響具有滯后效應(yīng)。

TGF-β是Treg分泌的特異細(xì)胞因子，其作為抑制因子能夠調(diào)節(jié)免疫功能、維持免疫耐受[9]。TGF-β合成后在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)過二聚化和蛋白水解后形成無活性的潛在TGF-β(latent TGF-β)，后者由LAP與活性TGF-β以1∶1的比例以非共價(jià)鍵結(jié)合而成，該蛋白復(fù)合體不能與TGF-β受體結(jié)合，因此不能發(fā)揮生物學(xué)活性。當(dāng)復(fù)合物離開粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，LAP被錨定蛋白GARP識(shí)別并結(jié)合，隨后LAP被蛋白酶切割并分離出有活性的TGF-β[9]。GARP在Treg靜息狀態(tài)下呈低表達(dá)，激活后表達(dá)迅速上調(diào)，隨后潛在TGF-β分泌增加。由于潛在TGF-β與LAP結(jié)合形成復(fù)合體，故本研究并未檢測(cè)出有活性的TGF-β，然而LAP的表達(dá)可間接反映潛在TGF-β的變化。HIIT1后60 min時(shí)Treg細(xì)胞CD39表達(dá)上調(diào)，提示HIIT還可通過腺苷途徑介導(dǎo)免疫抑制。外源性ATP水解生成腺苷需要CD39參與[10]，腺苷則可抑制Th17分化并通過下調(diào)促炎性因子和趨化因子表達(dá)而減輕炎性反應(yīng)[10]。

本研究結(jié)果提示，1次急性HIIT引起T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)暫時(shí)性失衡(Th1/Th2平衡向Th1漂移)，運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期Treg合成潛在TGF-β并促進(jìn)ATP分解為腺苷，分別通過抑制T細(xì)胞分化和抑制炎性反應(yīng)而重建T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

3.2 短期(4周)HIIT對(duì)T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡的影響 張宏杰等[11]發(fā)現(xiàn)，大學(xué)生籃球運(yùn)動(dòng)員16周高強(qiáng)度集訓(xùn)期間，細(xì)胞免疫功能削弱，白細(xì)胞IFN-γ不變而IL-4表達(dá)上調(diào)，提示Th1/Th2平衡向Th2方向漂移。Gholamnezhad等[12]證實(shí)，Wistar大鼠11周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后IFN-γ/IL-4比值升高，而高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后則顯著性下降。陶占泉等[13]發(fā)現(xiàn)，青年男性5周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練促使Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4)細(xì)胞因子基因表達(dá)均顯著增加，但以Th1細(xì)胞因子為甚，免疫穩(wěn)態(tài)平衡趨向Th1極化；規(guī)律太極拳運(yùn)動(dòng)上調(diào)IFN-γ/IL-4比值[14]，Treg計(jì)數(shù)及其分泌的細(xì)胞因子增加[15]。上述研究提示，規(guī)律中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)能夠通過改善免疫平衡協(xié)調(diào)能力進(jìn)而提高免疫功能，而反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)則導(dǎo)致免疫穩(wěn)態(tài)失衡及免疫功能抑制。然而本研究結(jié)果顯示，IFN-γ、IL-4表達(dá)量在訓(xùn)練前后均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(IL-17A和TGF-β未檢測(cè)到)，提示4周HIIT后T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡并未發(fā)生明顯改變，可能與運(yùn)動(dòng)時(shí)間較短(4周)以及檢測(cè)方法和手段等因素與前人研究存在差異有關(guān)。

此外本研究還發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞LAP表達(dá)量在4周HIIT后降低，由于LAP與TGF-β結(jié)合形成潛在TGF-β，因此LAP下調(diào)可能伴隨潛在TGF-β分泌減少，從而導(dǎo)致Treg細(xì)胞免疫抑制功能下降。Horwitz等[16]證實(shí)，IL-2信號(hào)通路調(diào)控Treg細(xì)胞的活化與增殖進(jìn)而促進(jìn)TGF-β分泌增多；有研究發(fā)現(xiàn)，6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)下調(diào)淋巴細(xì)胞IL-2表達(dá)[17]。據(jù)此推測(cè)，短期HIIT通過降低IL-2分泌量而下調(diào)TGF-β表達(dá)，Treg細(xì)胞LAP隨之減少。上述結(jié)果提示，短期反復(fù)HIIT后Treg細(xì)胞免疫抑制能力減弱，可能是免疫系統(tǒng)對(duì)規(guī)律訓(xùn)練的適應(yīng)性反應(yīng)，同時(shí)也是免疫功能增強(qiáng)的標(biāo)志之一。然而長(zhǎng)期(>4周)HIIT對(duì)免疫穩(wěn)態(tài)的影響及機(jī)制尚不得而知，需要延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)干預(yù)周期進(jìn)一步證實(shí)。

1次急性HIIT暫時(shí)性改變Th1/Th2穩(wěn)態(tài)并使Th1/Th2平衡向Th1漂移，運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期具有免疫抑制作用的Treg細(xì)胞被動(dòng)員，其作用可能參與了T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)與重建；短期(4周)HIIT誘導(dǎo)Treg細(xì)胞免疫抑制能力減弱，但對(duì)T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡并無顯著影響。