蔣臨正,徐 悅,林志平,馬 芳,邢光東,周明旭,5**,盧 宇,6**

(1.江蘇優(yōu)源奶業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院有限公司,江蘇 南京 211100;2.南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司,江蘇 南京 211100;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫工程研究所/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210014;4.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所,江蘇 南京 210014;5.江蘇大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013;6.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009)

0 前言

奶牛乳房炎是奶牛飼養(yǎng)過程中最重要的疾病之一,其發(fā)病率高、致病原因復(fù)雜[1,2],不僅導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)上的直接損失,如產(chǎn)奶量暫時(shí)或永久性減少、牛奶品質(zhì)降低[3],還會(huì)帶來多種間接損失,如過早淘汰產(chǎn)奶牛[4]、增加額外的治療成本[5.6]等?？梢鹉膛Ｈ榉垦椎闹虏【N類繁多,包括球菌、桿菌、支原體、真菌、酵母[7]和病毒等多達(dá)150多種[8]。目前我國尚無有效的奶牛乳房炎商品疫苗,業(yè)內(nèi)普遍采用抗生素進(jìn)行防治[9]。但是,引起奶牛乳房炎的病原菌種類和分布情況往往與地區(qū)環(huán)境有關(guān)[10],因此不同地區(qū)甚至不同牛場(chǎng)中的病原菌組成及耐藥性會(huì)有所差異,難以統(tǒng)一用藥[11];此外,抗生素的不規(guī)范使用甚至濫用,往往導(dǎo)致乳品中藥物殘留及耐藥性菌株的出現(xiàn),嚴(yán)重威脅食品和公共衛(wèi)生安全[12]。

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2019年7月發(fā)布了第194號(hào)公告[13]，以推進(jìn)飼料“禁抗”和養(yǎng)殖“減抗”。在此新形勢(shì)下,對(duì)包括奶牛乳房炎在內(nèi)的各類細(xì)菌疾病的預(yù)防和治療工作勢(shì)必成為奶牛場(chǎng)防疫工作的重點(diǎn)。在新型、有效的乳房炎細(xì)菌疫苗面市之前,加強(qiáng)牛場(chǎng)的飼養(yǎng)管理,并對(duì)牛場(chǎng)病原菌的流行病學(xué)和耐藥性進(jìn)行調(diào)查和分析,能夠有效預(yù)防奶牛乳房炎的發(fā)生[14],且在發(fā)病后開展精準(zhǔn)的治療,可以減少抗生素的濫用。

2019年上半年,江蘇蘇北某奶牛場(chǎng)在對(duì)患乳房炎奶牛使用四環(huán)素進(jìn)行治療后,發(fā)現(xiàn)仍有部分病牛未能痊愈;牛場(chǎng)獸醫(yī)推測(cè)其致病菌具有耐藥性并且很有可能是金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌,因此更換林可霉素進(jìn)行繼續(xù)治療,但并無顯著效果。本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)該牛場(chǎng)2019年6～10月期間已接受過抗生素(四環(huán)素)治療的共26頭奶牛進(jìn)行了奶樣的采集和病原菌分離鑒定和藥敏性分析,及時(shí)探清了該牛場(chǎng)可能存在的耐藥菌株以及耐藥類型,可為該牛場(chǎng)后續(xù)臨床用藥提供理論依據(jù),同時(shí)分離出的菌株也可為相關(guān)疫苗研發(fā)提供寶貴的生物材料。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基和主要試劑

胰蛋白酶(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extract)購自O(shè)xoid公司;瓊脂(Agar)MH培養(yǎng)基購自南京翼飛雪生物科技有限公司; ExTaq (10 U/L)、dNTP均購自TaKaRa公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;藥敏試紙購自杭州天和生化試劑有限公司。

1.2 奶樣采集

對(duì)已接受抗生素治療1周的26頭患乳房炎奶牛進(jìn)行奶樣的采集。在采樣前24 h停藥,共采集生牛奶樣品31份。使用溫水清潔乳房和乳頭,再用碘液對(duì)乳頭進(jìn)行消毒。在進(jìn)行無菌取奶時(shí),棄去前三把奶,收集奶樣至15 mL無菌離心管中,每管取乳5 mL待檢。

1.3 菌株的分離和純化

將奶樣置于37 ℃搖床培養(yǎng)6 h,轉(zhuǎn)速設(shè)置為180 r/min。吸取10L樣品分別在TSA和血平板上劃線分離培養(yǎng)。將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱過夜,觀察細(xì)菌菌落的生長情況,并挑取不同形態(tài)的菌落再次劃線純化培養(yǎng)。將純化后的菌落接種于TSB或者THB培養(yǎng)液中進(jìn)行純培養(yǎng)8 h,取菌液備用或凍存于-80 ℃冰箱。

1.4 細(xì)菌基因組DNA的提取

使用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取上述備用菌液的基因組DNA。按照說明書的步驟提取細(xì)菌基因組DNA,最后使用50L超純水沖洗柱體,溶解備用。

1.5 分離菌的測(cè)序鑒定

本次鑒定均使用16S rDNA引物進(jìn)行擴(kuò)增,其中16SDNA-F的序列為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，16SDNA-R的序列為GGCTACCTTGTTACGACT。以按上述步驟提取的不同的細(xì)菌基因組作為模板,對(duì)細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增[9],引物均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.6 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)的方法[15]如下:將待檢細(xì)菌的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)；以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心LB液體培養(yǎng)基10 min，然后棄取上清,用PBS重懸并調(diào)整菌液濃度(OD600≈0.1或0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?。使用無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于MH平板上,并在室溫下干燥5 min。將9種藥敏紙片分別輕貼在MH瓊脂平板上,不同紙片相距15～20 mm,于37 ℃恒溫下培養(yǎng),在培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌環(huán)直徑。藥敏結(jié)果的判定參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)所制定的標(biāo)準(zhǔn)CLSI M100 2018[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

在6～10月期間,從該牛場(chǎng)共采集已發(fā)病并經(jīng)四環(huán)素治療的奶牛奶樣31份,共分離細(xì)菌12株,以W1～W12表示:其中有10份奶樣分離出細(xì)菌1株,1份奶樣中分離出細(xì)菌2株,檢出率35.4%。純化的細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色并鏡檢,發(fā)現(xiàn)共有7株革蘭氏陰性菌(占比7/12,58.33%),5株革蘭氏陽性菌(占比5/12,41.67%)。

2.2 細(xì)菌種、屬的鑒定

通過提取細(xì)菌基因組,對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后得到16S rDNA序列,將序列導(dǎo)入BLAST進(jìn)行比對(duì),以確定菌株的種、屬,鑒定結(jié)果見表1。在本次檢測(cè)中,共檢出大腸桿菌屬細(xì)菌3株、肺炎克雷伯菌屬細(xì)菌2株、停乳鏈球菌屬細(xì)菌1株,分別占分離菌株數(shù)的25.00%、16.67%、8.33%。

表1 分離菌株的種、屬分布

2.3 分離菌株的耐藥性

藥敏試驗(yàn)選取9種牛場(chǎng)臨床上常用的抗生素,檢測(cè)分離菌株的耐藥性,結(jié)果如表2所示。其中,分離出的3株大腸桿菌對(duì)青霉素、氨芐西林、林可霉素以及頭孢喹肟均顯示出多重耐藥性;W1和W2株對(duì)鏈霉素耐藥,而W2和W3株還對(duì)四環(huán)素和土霉素耐藥。2株肺炎克雷伯菌對(duì)青霉素、氨芐西林和林可霉素呈多重耐藥,而對(duì)四環(huán)素中度敏感。銅綠假單胞菌W9的耐藥性較強(qiáng),對(duì)青霉素、氨芐西林、林可霉素、四環(huán)素、土霉素和頭孢喹肟均表現(xiàn)出多重耐藥,對(duì)鏈霉素和卡那霉素也僅是中度敏感,只有對(duì)慶大霉素表現(xiàn)敏感。產(chǎn)色葡萄球菌W12對(duì)林可霉素、四環(huán)素和土霉素多重耐藥。松鼠葡萄球菌W11對(duì)林可霉素、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素、土霉素、慶大霉素和頭孢喹肟均耐藥,僅對(duì)青霉素類藥物敏感。

12株分離菌對(duì)9種常用獸用抗生素的耐藥性中,對(duì)林可霉素的耐藥率最高,達(dá)到83.3%(10/12);而對(duì)卡那霉素和慶大霉素的耐藥率均最低,僅8.3%(1/12)。

表2 細(xì)菌分離株對(duì)9種常用獸用抗生素的耐藥性

注:“S”代表高度敏感；“M”表示中度敏感;“R”表示耐藥。耐藥性判定標(biāo)準(zhǔn)為CLSI M100 2018。

3 討論

奶牛乳房炎一直是困擾國內(nèi)外奶業(yè)生產(chǎn)的重要疾病,由于國內(nèi)目前暫無有效的商業(yè)疫苗使用,大部分牛場(chǎng)主要使用抗生素藥物防治乳房炎。但是,引起奶牛乳房炎的致病菌繁多,不同種屬、不同菌株的耐藥性各有異同,增加了臨床用藥的困難。而盲目使用各類抗生素,不僅治療效果有限,而且容易造成細(xì)菌耐藥性的進(jìn)一步增強(qiáng),從而孵育牛場(chǎng)的“超級(jí)細(xì)菌”。

本研究中的奶牛場(chǎng)長期使用四環(huán)素治療奶牛乳房炎;在2019年上半年逐漸出現(xiàn)病牛經(jīng)四環(huán)素或林可霉素治療后療效均不佳的情況。本研究團(tuán)隊(duì)連續(xù)4個(gè)月在該場(chǎng)采集到26頭經(jīng)四環(huán)素治療1周的患病奶牛的奶樣31份,對(duì)其中可能存在的耐藥菌株進(jìn)行了分離和鑒定，結(jié)果從35.4%(11/31)的奶樣中分離到細(xì)菌,比例較高,說明四環(huán)素的治療對(duì)分離菌株的效果不好。通過對(duì)分離純化的細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)菌株包括大腸桿菌3株,肺炎克雷伯菌2株,葡萄球菌2株(松鼠葡萄球菌1株,產(chǎn)色葡萄球菌1株),其他分別為鮑曼不動(dòng)桿菌1株,停乳鏈球菌1株,銅綠假單胞菌1株,短小芽孢桿菌1株以及腸球菌1株；其中有1份奶樣同時(shí)分離出肺炎克雷伯菌和大腸桿菌,存在混合感染的情況。

大腸桿菌是奶牛乳房炎的主要致病菌[17]。Zhang D X等[18]從遼寧7個(gè)牛場(chǎng)分離出393株菌,大腸桿菌占20.01%;王丹等[19]從臨床型和隱性乳腺炎奶樣中分離病原菌,大腸桿菌檢出率達(dá)24.25%,且其主要對(duì)青霉素、克林霉素、萬古霉素和利福平耐藥,耐藥率達(dá)81.25%～100.00%。近年來的流調(diào)數(shù)據(jù)顯示,肺炎克雷伯菌也成為江蘇地區(qū)奶牛乳房炎的主要致病菌之一[20];該細(xì)菌侵入乳腺后,可黏附和侵襲乳腺上皮細(xì)胞,可在細(xì)胞內(nèi)存活,難以通過抗生素治療。但本研究并未分離到金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌、無乳鏈球菌等主要隱性乳房炎的病原菌。另外值得關(guān)注的是,鮑曼不動(dòng)桿菌在臨床上的分離率和耐藥率非常高,更被冠名“革蘭氏陰性桿菌的MRSA”[21]。葛東紅等[22]從生牛乳中分離到鮑曼不動(dòng)桿菌,對(duì)頭孢唑啉、呋喃妥因、萬古霉素和克林霉素表現(xiàn)出多重耐藥,在攻毒小鼠后可造成60%的死亡率。

本研究分離出大腸桿菌W1和W3的奶樣有明顯的血乳情況。經(jīng)藥敏試驗(yàn)鑒定,12個(gè)菌株對(duì)四環(huán)素類藥物(包括四環(huán)素和土霉素)的耐藥率達(dá)到41.6%(5/12),剩余7株細(xì)菌也對(duì)該類藥物呈現(xiàn)中度敏感,可能是因?yàn)殚L期使用該類藥物導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng),從而造成該牛場(chǎng)此前使用四環(huán)素治療時(shí)效果不佳。當(dāng)牛場(chǎng)獸醫(yī)在發(fā)現(xiàn)四環(huán)素效果有限時(shí),首先應(yīng)考慮更換其他抗生素,尤其是針對(duì)較難清除的革蘭氏陽性菌的抗生素。但本次12株細(xì)菌對(duì)林可霉素的耐藥率達(dá)到83.3%,對(duì)3代頭孢類藥物頭孢喹肟的耐藥率達(dá)58.3%,對(duì)更常用的青霉素類藥物的耐藥率也有50.00%(6/12),這一方面說明了牛場(chǎng)細(xì)菌種屬和耐藥性能的復(fù)雜性,另一方面也說明了牛場(chǎng)定期針對(duì)本場(chǎng)流行病原菌藥敏鑒定工作的必要性。對(duì)于牛場(chǎng)存在的一些頑固病原菌,盲目用新藥、廣譜藥有時(shí)并不能達(dá)到快速治療的效果,反而會(huì)延長整體治療周期,耽誤治療的最佳時(shí)機(jī),使奶牛乳房炎的發(fā)病情況愈發(fā)嚴(yán)重。通過本研究的耐藥性分析,本奶牛場(chǎng)病原菌對(duì)卡那霉素和慶大霉素的耐藥率最低,均僅8.3%?？紤]仍有部分菌株對(duì)卡那霉素和慶大霉素呈現(xiàn)中度敏感,建議牛場(chǎng)在今后治療乳房炎病牛中將兩種抗生素交叉使用,防止細(xì)菌耐藥性的生成。