陳妙妙，沈 碩，李偉佳

（青海大學(xué)，青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省馬鈴薯育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青藏高原生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810016）

馬鈴薯干腐病是由茄病鐮孢侵染塊莖造成的病害，其病原種類有9個(gè)種和變種［1］。受侵害的塊莖在溫度較低、濕度較高的環(huán)境下痊愈的速度很慢并且病害部位會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大［2］。馬鈴薯在收獲期間抗病性雖大，但傷口易受病害的侵染［3］。通常情況下，馬鈴薯窖藏期間由干腐病造成的馬鈴薯產(chǎn)量損失為6% ～25%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)60%［4-5］。由此可見(jiàn)，馬鈴薯干腐病的防治，尤其是對(duì)生物防治的研究具有重要的意義。

近年來(lái)，從青稞白酒糟醅中分離到的多株活性菌為芽孢桿菌屬，并具有較高的抑草、抑菌及抗病毒活性，具有作為生物防治菌劑及微生物源生物防治制劑開(kāi)發(fā)的潛力［6-7］。目前有關(guān)生物防治細(xì)菌抑制植物病原菌的報(bào)道越來(lái)越多，但生防細(xì)菌抑制馬鈴薯干腐病病原菌活性方面的報(bào)道很少。本研究選取實(shí)驗(yàn)室前期分離自青稞白酒糟醅對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌具有較高抑制活性的菌株JZ2-1-12，根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特征及分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，再對(duì)其發(fā)酵液乙酸乙酯及正丁醇提取物的抑菌活性進(jìn)行研究，擬為菌株JZ2-1-12抑制馬鈴薯干腐病病原菌活性物質(zhì)的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定奠定基礎(chǔ)，從而為微生物來(lái)源的馬鈴薯干腐病生物防治制劑的開(kāi)發(fā)提供新的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株JZ2-1-12分離自青稞白酒糟醅，由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室分離純化并保存；馬鈴薯干腐病病原菌青9A-5-2（Fusarium solani）分離自青薯9號(hào)病薯塊莖，由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室分離純化并保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

病原菌的活化及抑菌試驗(yàn)培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1 000 mL）。菌株JZ2-1-12發(fā)酵培養(yǎng)基（牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.0～7.2）。

1.3 菌株活化

從4℃冰箱中取出保存的菌株JZ2-1-12，劃線接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，置于培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)2 d。挑取單菌落，劃線接種于新的培養(yǎng)基平板上，放置于培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)3 d后備用［8］。

1.4 菌株JZ2-1-12的鑒定

1.4.1 菌株JZ2-1-12的形態(tài)學(xué)鑒定

取經(jīng)活化的菌株JZ2-1-12，觀察菌株生長(zhǎng)的菌落形態(tài)特征（包括形狀、大小、光澤、隆起形狀、透明度、邊緣等）及菌體形態(tài)特征（包括革蘭氏染色、芽孢形態(tài)及運(yùn)動(dòng)性）。

1.4.2 菌株JZ2-1-12的生理生化特征鑒定

科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展使移動(dòng)短視頻平臺(tái)更加方便地融入到了大眾的生活之中，降低了內(nèi)容生產(chǎn)的門(mén)檻，增加了用戶對(duì)短視頻平臺(tái)的使用率，使用戶可以隨時(shí)隨地分享生活，讓更多的消費(fèi)者有選擇的空間。

根據(jù)文獻(xiàn)［9］對(duì)菌株JZ2-1-12進(jìn)行檸檬酸鹽試驗(yàn)、接觸酶、葡萄糖氧化發(fā)酵、糖、醇類發(fā)酵、甲基紅 （M.R）、V-P測(cè)定、O-硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷酶 （ONPG）測(cè)定、硝酸鹽還原、明膠液化以及石蕊牛奶試驗(yàn)。

1.4.3 菌株JZ2-1-12的分子生物學(xué)鑒定

采用上海生物工程股份有限公司的柱式細(xì)菌DNA提取試劑盒的程序提取菌株DNA。PCR擴(kuò)增體系:10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTP （10 mmol/L）2 μL，引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3′）各 1 μL，模板 DNA 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min；94℃ 10 s、54℃ 30 s、72℃ 80 s、35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。待反應(yīng)結(jié)束，取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交至網(wǎng)站http:∥www.ezbio cloud.net進(jìn)行16S rDNA序列比對(duì)，確定菌株的分類地位。通過(guò)MEGA 7.0軟件進(jìn)行菌株序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建［10］。

1.5 菌株發(fā)酵液的制備

將培養(yǎng)好的菌株JZ2-1-12接種于裝瓶量為400 mL的液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u瓶柜中33℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，收獲發(fā)酵液。發(fā)酵液經(jīng)布氏漏斗減壓過(guò)濾去除菌體，即獲得去菌體發(fā)酵液。

1.6 菌株發(fā)酵液提取物的制備及抑菌活性測(cè)定

取500 mL去菌體發(fā)酵液置于3 000 mL的分液漏斗中，依次用等體積乙酸乙酯和正丁醇與其充分接觸混勻，分別萃取3次，靜置待發(fā)酵物和有機(jī)相分層，收集并合并有機(jī)相。萃取獲得的有機(jī)相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮分別得到乙酸乙酯和正丁醇提取物浸膏。將其用無(wú)菌水分別配制成濃度為6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜抽濾3次，以無(wú)菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。采用牛津杯法［11］測(cè)定發(fā)酵液提取液的抑菌活性。計(jì)算公式如下:

參考張志祥等［12］的方法，采用濃度對(duì)數(shù)-抑菌率概率值法求得毒力回歸方程及抑制中濃度（EC50）。

1.6.1 菌株發(fā)酵液提取物對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌菌絲形態(tài)的影響

1.6.2 菌株發(fā)酵液提取物對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌孢子萌發(fā)的影響

采用凹玻片培養(yǎng)法［14］，將菌株JZ2-1-12發(fā)酵液乙酸乙酯及正丁醇提取物分別配制成濃度為6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 mg/mL的溶液，吸取30 μL馬鈴薯干腐病病原菌孢子懸浮液（1×106CFU/mL）于凹玻片的凹槽中，再分別吸取30μL不同濃度的提取物溶液于凹槽中并混勻，以無(wú)菌水作為對(duì)照。蓋上蓋玻片將其置于培養(yǎng)皿中，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)對(duì)照的孢子萌發(fā)數(shù)（芽管的長(zhǎng)度超過(guò)孢子直徑的一半）達(dá)到70% ～80%時(shí)，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)［15］。每個(gè)處理重復(fù)3次，取其平均值。孢子萌發(fā)抑制率按照以下公式計(jì)算:

1.7 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Microsoft Excel 2010及SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性（P ＜0.05）檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株JZ2-1-12的鑒定

2.1.1 菌株JZ2-1-12的形態(tài)學(xué)鑒定

如圖1所示，菌株JZ2-1-12經(jīng)革蘭氏染色呈紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞呈直桿狀，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。菌落邊緣整齊，呈乳白色，不透明，扁平，表面褶皺。

2.1.2 菌株JZ2-1-12的生理生化鑒定

由表1可知，菌株JZ2-1-12可使明膠液化，可利用檸檬酸鹽，使蔗糖及甘露醇發(fā)酵。石蕊牛奶試驗(yàn)呈凝固狀態(tài)。有或無(wú)氧分子參與均能分解葡萄糖。其中接觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原、V-P試驗(yàn)均呈陽(yáng)性。甲基紅和ONPG試驗(yàn)均呈陰性。

表1 菌株JZ2-1-12生理生化鑒定結(jié)果Tab.1 Physiological and biochemical identification results of strain JZ2-1-12

2.1.3 菌株JZ2-1-12的分子生物學(xué)鑒定

將菌株 JZ2-1-12（MN083310）測(cè)序得到的 16S rDNA序列（1 379 bp）提交至 https:∥www.ezbiocloud.net網(wǎng)站，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，下載與菌株JZ2-1-12的16SrDNA序列同源性大于95%的菌株序列，通過(guò)MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。菌株保藏號(hào)為GDMCC No:60696，于2019年6月17日保藏至廣東省微生物菌種保藏中心。由圖2可知，菌株JZ2-1-12與已知菌株Bacillus subtilis subsp.subtilis（ABQL01000001）聚類于同一分支，親緣關(guān)系最近，相似度高達(dá)99.93%。結(jié)合菌株JZ2-1-12的形態(tài)學(xué)、生理生化特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，最終確定菌株JZ2-1-12為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis subsp.subtilis）。

2.2 菌株JZ2-1-12發(fā)酵液提取物的抑菌活性

2.2.1 發(fā)酵液提取物對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌的抑制活性

由表2可知，當(dāng)乙酸乙酯提取物溶液的濃度為12.50 mg/mL時(shí)對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌的抑制活性最高，抑制率達(dá)到75.00%；當(dāng)正丁醇提取物溶液的濃度為50.00 mg/mL時(shí)對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌的抑制活性最高，抑菌率為66.13%。采用SPSS 25.0軟件對(duì)抑菌活性結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，當(dāng)乙酸乙酯提取物溶液的濃度為12.50 mg/mL時(shí)，其與25.00，50.00、100.00 mg/mL的抑制效果差異不顯著（P＞0.05）。正丁醇提取物溶液的濃度為50.00 mg/mL時(shí)，與100 mg/mL的抑制效果差異不顯著（P＞0.05）。經(jīng)毒力回歸方程可得:乙酸乙酯及正丁醇提取物溶液對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌的抑制活性的EC50分別為0.19、12.96 mg/mL，表明菌株發(fā)酵液乙酸乙酯提取物溶液對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌的抑制效果更強(qiáng)。

2.2.2 發(fā)酵液提取物對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌菌絲的致畸作用

挑取鄰近抑菌帶邊緣的菌絲（圖3b、圖3c），以遠(yuǎn)離抑菌帶邊緣的菌絲（圖3a）作為對(duì)照，觀察發(fā)酵液提取物對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌菌絲的致畸作用。正常狀態(tài)的馬鈴薯干腐病病原菌菌絲粗細(xì)均一、表面光滑、飽滿。鄰近正丁醇提取物處理的抑菌帶邊緣的菌絲出現(xiàn)盤(pán)曲折疊的情況，同時(shí)出現(xiàn)菌絲分叉、斷裂及粗細(xì)不均的現(xiàn)象。鄰近乙酸乙酯提取物處理的抑菌帶邊緣的菌絲末端膨大，同時(shí)也出現(xiàn)了不同程度的纏繞、扭曲、畸形和斷裂的現(xiàn)象。

表2 菌株發(fā)酵液提取物對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌的抑制活性Tab.2 The inhibitory activity of extracts from fermentation broth on potato dry rot

2.2.3 發(fā)酵液提取物對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌孢子萌發(fā)的影響

如表3所示，當(dāng)乙酸乙酯提取物溶液濃度為12.50 mg/mL時(shí)，孢子數(shù)最少（僅有7 950個(gè)左右），對(duì)病原菌孢子的萌發(fā)抑制率達(dá)到69.64%；當(dāng)正丁醇提取物溶液濃度為50.00 mg/mL時(shí)，對(duì)病原菌孢子的萌發(fā)抑制率為68.99%；采用SPSS25.0軟件對(duì)抑菌活性結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，當(dāng)乙酸乙酯提取物溶液的濃度為12.50 mg/mL時(shí)，其與25.00、50.00、100.00 mg/mL的抑制效果差異不顯著（P＞0.05）。正丁醇提取物溶液的濃度為50.00 mg/mL時(shí)，其與100 mg/mL的抑制效果差異不顯著（P＞0.05）。經(jīng)毒力回歸方程可得:乙酸乙酯及正丁醇提取物溶液對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌孢子萌發(fā)的EC50分別為0.93和9.36 mg/mL，試驗(yàn)表明發(fā)酵液提取物能有效地抑制馬鈴薯干腐病病原菌孢子的萌發(fā)。

表3 菌株發(fā)酵液提取物溶液對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌孢子萌發(fā)的影響Tab.3 Effect of extract solution of fermentation broth on spore germination of potato dry rot pathogen

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)分離自青稞白酒糟醅的菌株JZ2-1-12進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定，確定菌株JZ2-1-12為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis subsp.subtilis）。抑菌活性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):乙酸乙酯及正丁醇提取物溶液對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌的EC50分別為0.19、12.96 mg/mL，菌株JZ2-1-12發(fā)酵液乙酸乙酯提取物溶液對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌的抑制效果更強(qiáng)。經(jīng)提取物處理的抑菌帶邊緣的菌絲出現(xiàn)盤(pán)曲折疊的情況，同時(shí)菌絲出現(xiàn)畸形、分叉、斷裂及粗細(xì)不均的現(xiàn)象。將未經(jīng)發(fā)酵液提取物處理的馬鈴薯干腐病病原菌孢子培養(yǎng)至20 h時(shí)，對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌孢子萌發(fā)的EC50分別為0.93、9.36 mg/mL，這說(shuō)明菌株JZ2-1-12發(fā)酵液乙酸乙酯提取物溶液對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌孢子萌發(fā)具有較高的抑制作用。

本次研究表明:枯草芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有較好的抑菌活性及較廣的抑菌譜［16-17］。在非核糖體途徑中合成的脂肽類物質(zhì)（如伊枯草素、表面活性素和豐原素）可抑制植物病原菌正常生長(zhǎng)且導(dǎo)致病原菌菌絲體畸形［18-19］。另外，枯草芽孢桿菌S3對(duì)刺盤(pán)孢屬、鏈格孢屬、鐮孢屬病菌都有明顯的抑菌效果，尤其對(duì)鐮孢屬病菌的抑菌效果最好，平均抑菌率達(dá)50%以上［20］。已有研究人員對(duì)枯草芽孢桿菌在抑制植物病原菌活性方面開(kāi)展了廣泛的研究［18-20］，但對(duì)枯草芽孢桿菌抑制植物病原菌的靶標(biāo)位點(diǎn)及活性化合物的結(jié)構(gòu)尚不明確。因此，后續(xù)研究的關(guān)鍵在于對(duì)菌株發(fā)酵液提取物中的活性物質(zhì)進(jìn)行分離，純化及結(jié)構(gòu)鑒定，并使其產(chǎn)品化以實(shí)現(xiàn)對(duì)馬鈴薯干腐病的生物防治。同時(shí)，將廢棄的青稞白酒糟醅開(kāi)發(fā)成一種新型微生物能源，并從中分離到有效抑制馬鈴薯干腐病的活性菌株，并將其開(kāi)發(fā)成生物制劑，將對(duì)馬鈴薯干腐病病害的防治以及生態(tài)環(huán)境的保護(hù)具有重要的意義。