何士俊 萬(wàn)毅虹 章嘉雯 蔡秀潮 劉靜文 劉叔文 姚新剛

（廣東省新藥篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510515）

蛋白激酶 A［1］（Protein Kinase A，PKA）又稱依賴于cAMP的蛋白激酶A，是一種結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單、生化特性清楚的蛋白激酶［2］。在大多數(shù)哺乳類細(xì)胞中，一類蛋白激酶A存在于胞質(zhì)溶膠，另一類結(jié)合在質(zhì)膜、核膜和微管上［3-4］。在胰島β細(xì)胞中，PKA具有促進(jìn)胰島素分泌的作用［5-7］。研究表明，GLP-1與其受體結(jié)合［8］，激活胰升糖素樣肽-1受體-環(huán)腺苷二磷酸-蛋白激酶A（GLP-1R-cAMP-PKA）通路［9］，促使腺苷酸環(huán)化酶活化，升高胰腺β細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，激活PKA使葡萄糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一些起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)磷酸化而促使胰島素分泌［10］，包括對(duì)ATP敏感的鉀離子通道Sur1［11］，電壓依賴性的鈣離子通道VDCC［12］，以及與胰島素釋放機(jī)制相關(guān)的分子，增加抗凋亡蛋白水平［13］；同時(shí)PKA還可激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）［14］和胰十二指腸同源盒基因（PDX-1），繼而與CREB基因啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)關(guān)鍵性的DNA序列結(jié)合［15］，從而加強(qiáng)胰島素原基因轉(zhuǎn)錄的效率，增加胰島素的轉(zhuǎn)錄及合成［16］。但是PKA在促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素中究竟發(fā)揮著多大的作用以及是否還有除PKA以外的作用途徑仍不清楚；前期研究主要通過(guò)siRNA干擾［17］和采用抑制劑［18］等手段研究PKA在胰島β細(xì)胞中的作用，這些手段并沒(méi)有完全敲除胰島β細(xì)胞中的PKA，其瞬時(shí)性和不徹底性的弊端會(huì)影響對(duì)基因功能的正確判斷。因此，本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)敲除INS-1細(xì)胞中PKA C-α基因，得到穩(wěn)定敲除PKA C-α基因的細(xì)胞株，以期對(duì)PKA在胰島β細(xì)胞的作用進(jìn)行更深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠胰島瘤INS-1細(xì)胞、293T細(xì)胞、Stbl3感受態(tài)細(xì)胞，蛋白上樣緩沖液（實(shí)驗(yàn)室保存）；lentiCRISPRv2（98290）、pCMV-VSV-G（8454）、psPAX2（12260）質(zhì)粒購(gòu)自 Addgene公司；polyjet轉(zhuǎn)染試劑（SL100688）購(gòu)自SignaGen生物技術(shù)公司；polybrene（TR-1003-G） 購(gòu) 自 EMD Millipore公司；RPMI1640培養(yǎng)基（11875093）、DMEM培養(yǎng)基（10566016）、澳洲胎牛血清（10099141）、限制性內(nèi)切酶BsmB I（FD0454）、FastAP去磷酸化酶（EF0654）、DTT（707265ML）、ECL化學(xué)發(fā)光液（RJ236892）、青霉素和鏈霉素（15140122）購(gòu)自Thermoscientific公司；T4 PNK激酶（M0201S）、快速連接酶（M2200S）購(gòu)自NEB公司；RIPA裂解液（P0013B）購(gòu)自碧云天公司；質(zhì)粒小提試劑盒（AP-MN-P-50）購(gòu)自Axygen公司；膠回收試劑盒（28704）購(gòu)自Aiagen公司；細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒（D3396）購(gòu)自O(shè)mega公司；嘌呤霉素（AAJ67236-8EQ）購(gòu)自VWR 公司；PKA C-α抗體（D38C6）、β-actin抗體（D6A8）、辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔IgG（7074s）購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；2×HieffTMPCR Master Mix（10102ES03）購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；Insulin High Range Kit 500 tests（62IN1PEG）購(gòu)自Cisbio公司；小向?qū)NA（sgRNA）序列合成及質(zhì)粒測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基；INS-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素、5.6mmol/L葡萄糖、10 mmol/L HEPES、2 mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸鈉、0.5 mmol/L b-巰基乙醇的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染前24 h，293T細(xì)胞鋪6孔板，細(xì)胞密度為1×105cell/mL，轉(zhuǎn)染前0.5 h用新鮮培養(yǎng)基換液。1 μg DNA（500 ng sgRNAlentiCRISPR質(zhì) 粒、250 ng psPAX2質(zhì)粒、250 ng pCMV-VSV-G質(zhì)粒）混于50 μL無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基，3 μL PolyJet轉(zhuǎn)染試劑也溶于無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基，孵育10 min，將PolyJet混合物加入DNA混合物，室溫孵育10 min后加入6孔板中，24 h后更換培養(yǎng)基。

1.2.2 sgRNA靶點(diǎn)選擇及其寡核苷酸鏈合成 應(yīng)用http：//crispr-mit.edu/網(wǎng)站設(shè)計(jì)所需的目的基因sgRNA片段，設(shè)計(jì)時(shí)正義鏈模板的5'添加CACC，與BsmB I酶切后形成的黏性末端互補(bǔ)；反義鏈模板的5'端添加AAAC，與BsmB I酶切后形成的黏性末端互補(bǔ)，參考大鼠的基因組，對(duì)PKA C-α（Gene ID ：25636https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_005118.4?report=genbank&from=25095089&to=25118869）的10個(gè)外顯子序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)打分（https：//zlab.bio/guide-design-resources），選出2條分?jǐn)?shù)最高的sgRNA序列分別如下：

所有寡核苷酸鏈和引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成

1.2.3 lentiCRISPRv2-sgRNA質(zhì)粒的重組構(gòu)建 用BsmB I限制性內(nèi)切酶線性化lentiCRISPRv2質(zhì)粒，酶切體系如下：lentiCRISPRv2，5 mg；FastDigestBsmB I，3 μL ；FastAP，3 μL ；10× FastDigest Buffer，6 μL；100 mmol/L DTT（ 新 鮮 配 制 ），0.6μL；加水至60 μL；37℃中反應(yīng)30 min完成后進(jìn)行切膠回收。將sgRNA寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈，體系如下：Primer 1（100 μmol/L），1 μL；Primer 2（100 μmol/L），1 μL ；10× T4 Ligation Buffer，1 μL ；T4 PNK 激酶，0.5 μL；加水至 10 μL，37℃，30 min；95℃，5 min；95℃以5℃/min降至25℃；4℃保存，將退火引物用滅菌水按1∶200稀釋。連接體系：線性化質(zhì)粒lentiCRISPRv2，50 ng；稀釋的退火引物，1 μL ；2×Quick Ligase Buffer，5 μL ；快速連接酶，1 μL；加水至11 μL，25℃鏈接 10 min。將連接得到的11 μL體系全部轉(zhuǎn)化到Stbl3感受態(tài)中，挑取單克隆進(jìn)行小搖，再進(jìn)行小提質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 慢病毒制備與感染 將293T細(xì)胞鋪6孔板，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至60%-80%。將構(gòu)建好的sgRNA-lentiCRISPRv2質(zhì)粒和慢病毒包裝輔助載體psPAX2、pCMV-VSV-G質(zhì)粒按照sgRNAlentiCRISPR∶psPAX-2∶pCMV-VSV-G為2∶1∶1的比例混合，將混合好的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞內(nèi)，24 h后更換培養(yǎng)基，換成DMEM∶RPMI 1640為1∶1的培養(yǎng)基，換液24 h后收集細(xì)胞上清液即為慢病毒原液。感染前將INS-1細(xì)胞按2×105cell/well鋪于12孔板中，24 h后細(xì)胞將近有80%密度，將病毒上清液按100mL/well加入INS-1細(xì)胞中，促感染劑polybrene以1∶1 000的比例加入，充分混勻。6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5 敲除PKA C-α基因的INS-1細(xì)胞株的初篩選與驗(yàn)證 sgRNAlentiCRISPR-Cas9慢病毒侵染INS-1細(xì)胞48 h后，更換為含1 μg/mL嘌呤霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，待12孔板中對(duì)照孔的INS-1細(xì)胞全部死亡后，將其他孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板，待6孔板長(zhǎng)滿時(shí)一部分轉(zhuǎn)移至25 cm3細(xì)胞皿中接著培養(yǎng)，另一部分則加入RIPA裂解液提取蛋白，加入蛋白上樣緩沖液并于沸水浴中反應(yīng)10 min，將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳（80 V，20 min跑濃縮膠；120 V，1.5 h跑分離膠）；再采用濕轉(zhuǎn)法以100 V，1 h的條件轉(zhuǎn)移至PVDF膜；以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；內(nèi)源性PKA C-α抗體4℃ 過(guò)夜孵育，TBST洗膜3次，每次10 min；HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG室溫孵育1 h，TBST洗膜6次，每次5 min；ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影、曝光。

1.2.6 敲除PKA C-α基因的INS-1單克隆細(xì)胞的挑選與測(cè)序鑒定 由Western blotting印記驗(yàn)證有敲低效果的INS-1細(xì)胞按5 cell/mL的密度鋪到96孔板中，待24 h細(xì)胞貼壁后在顯微鏡下找出只有單個(gè)INS-1細(xì)胞的孔，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，在96孔板長(zhǎng)滿時(shí)（一般5-6周左右），轉(zhuǎn)移至12孔板繼續(xù)培養(yǎng)，待12孔板長(zhǎng)滿后，一部分轉(zhuǎn)移至25 cm3細(xì)胞皿中接著培養(yǎng)，另一部分提蛋白驗(yàn)證是否有敲除效果。將有敲除效果的INS-1細(xì)胞用Tissue DNA Kit D3396試劑盒提取細(xì)胞DNA，再經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增（PKA C-α基因PCR擴(kuò)增引物為：Forward primer：CTCTCCCTGCTCCCAGAGAA，Reverse primer：ATGAGTCCAAGGCCAGCTTC）， 擴(kuò)增體系為：模板DNA，適量；Forward primer（10 μmol/L），2 μL ；Reverse primer（10 μmol/L），2 μL ；2×HieffTM PCR Master Mix，25 μL ；加水至 50 μL，94℃，5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃，30 sec，35個(gè)循環(huán)；60℃，30 sec，35個(gè)循環(huán)；72℃，30 sec/kb，35個(gè)循環(huán)；72℃，10 min，1個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增完成后的產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行T載體克隆，測(cè)序結(jié)果與PKA C-α基因進(jìn)行比對(duì)。

1.2.7 葡萄糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn) （GSIS）將INS-1細(xì)胞接種在24孔板中并在5% CO2、37℃中孵育48 h，待INS-1細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，將細(xì)胞與含有0.2% BSA的Krebs-Ringer Bicarbonate HEPES buffer（KRB 緩 沖 液：115 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，24 mmol/L NaHCO3，2.5 mmol/L CaCl2和10 mmol/L HEPES）預(yù)孵育2h，然后以低糖（2.8 mmol/L葡萄糖）或高糖（16.8 mmol/L葡萄糖）刺激INS-1細(xì)胞2 h（葡萄糖配在含有0.2% BSA的KRB緩沖液中），最后收集細(xì)胞上清液以測(cè)定胰島素分泌。使用胰島素試劑盒Insulin High Range Kit 500 tests測(cè)量胰島素濃度。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 使用Graph Pad Prims5軟件的One-Way Anova分析統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。數(shù)值表示為*P＜0.05，**P＜0.01，和 ***P＜0.001。如果沒(méi)有另外說(shuō)明，誤差條代表平均值的SD。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA靶點(diǎn)以及寡核苷酸序列設(shè)計(jì)

lentiCRISPRv2質(zhì)粒信息見(jiàn)圖1-A；本研究針對(duì)PKA C-α基因的兩個(gè)外顯子Exon 5和Exon 7設(shè)計(jì)sgRNA序列，分別為sgRNA2和sgRNA1，其插入位置和序列信息見(jiàn)圖1-B。sgRNA靶點(diǎn)以及寡核苷酸序列見(jiàn)表1。

圖1 靶向PKA C-α基因的sgRNA的設(shè)計(jì)

表1 PKA C-α-sgRNA寡核苷酸序列

2.2 LentiCRISPRv2-sgRNA構(gòu)建質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果

針對(duì)PKA C-α基因構(gòu)建重組LentiCRISPRv2-sgRNA質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果（圖2）顯示，兩條sgRNA序列均正確插入lentiCRISPRv2，插入序列的位置、方向及序列與預(yù)期相符，證明載體構(gòu)建完全正確。

2.3 敲除PKA C-α基因的INS-1細(xì)胞株的初篩選與驗(yàn)證

用1 μg/mL嘌呤霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)INS-1細(xì)胞至對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后（24 h），抽提細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blotting印記驗(yàn)證，結(jié)果（圖3）顯示，PKA C-αsgRNA1基本沒(méi)有敲低效果；PKA C-αsgRNA2敲低效果很明顯。對(duì)PKA C-αsgRNA2細(xì)胞組進(jìn)行有限稀釋進(jìn)而篩選出單克隆細(xì)胞。

2.4 建立穩(wěn)定敲除PKA C-α基因的INS-1細(xì)胞株

將PKA C-αsgRNA2細(xì)胞組按5 cell/mL的密度鋪到96孔板中，挑選出單克隆細(xì)胞即為PKA C-α基因敲除的細(xì)胞（KO細(xì)胞）（大約5-6周），抽提細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blotting印記驗(yàn)證（圖4-A）；同時(shí)提取PKA C-α基因敲除細(xì)胞（KO）和野生型細(xì)胞（WT）的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并采取T克隆測(cè)序，測(cè)序后與原基因組DNA進(jìn)行對(duì)比（圖4-B），結(jié)果（圖4-C）顯示KO細(xì)胞發(fā)生1bp堿基的插入突變。Western blotting印記驗(yàn)證結(jié)果和T克隆測(cè)序結(jié)果證實(shí)PKA C-α基因敲除成功，穩(wěn)定敲除PKA C-α基因的INS-1細(xì)胞株建立成功。

圖2 LentiCRISPRv2-sgRNA測(cè)序圖

圖3 Western blotting印跡初步鑒定

2.5 敲除PKA C-α基因的INS-1細(xì)胞胰島素分泌能力檢測(cè)

葡萄糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，敲除PKA C-α基因的INS-1細(xì)胞低糖刺激下，其胰島素的分泌較正常的INS-1細(xì)胞少，結(jié)果無(wú)顯著性差異；但在高糖刺激，其胰島素的分泌較正常的INS-1細(xì)胞更少，結(jié)果有顯著性差異，說(shuō)明敲除PKA C-α基因的INS-1細(xì)胞胰島素的分泌能力降低。

3 討論

基因編輯技術(shù)［19］的飛速發(fā)展為基因功能研究工作提供了更多有力的工具，特別是鋅指核酸酶（FZN）［20］、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）［21］和最近發(fā)展起來(lái)的CRISPR技術(shù)［22-24］以及基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)改進(jìn)的單堿基編輯技術(shù)，為基因編輯提供了前所未有的方便和快捷。單堿基編輯技術(shù)（Base editor，BE）通過(guò)將Cas9切口酶（Cas9 nikase，Cas9n）或無(wú)核酸酶活性的Cas9（nuclease dead Cas9，dCas9）與胞嘧啶脫氨酶形成融合蛋白，并通過(guò)sgRNA（單鏈向?qū)NA）將融合蛋白靶向靶位點(diǎn)，在不切割雙鏈DNA的情況下對(duì)靶基因位點(diǎn)的單個(gè)堿基進(jìn)行胞嘧啶C→胸腺嘧啶T或鳥嘌呤G→腺嘌呤A的精準(zhǔn)編輯，在人細(xì)胞系和小鼠細(xì)胞系中，這種剪輯編輯器永久性地和高效地將堿基胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為堿基尿嘧啶（U），同時(shí)具有較低的編輯錯(cuò)誤發(fā)生率［25］。相對(duì)于其他基因編輯技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)選擇CRISPR/Cas9技術(shù)，一方面是由于用于基因敲除的CRISPR 載體構(gòu)建極其簡(jiǎn)單，只需要根據(jù)推薦的序列合成spacer并將其整合進(jìn)載體，就完成了基因編輯載體體外的操作過(guò)程且其特異性好，可以實(shí)現(xiàn)多基因編輯［26］；另一方面，本實(shí)驗(yàn)采用的慢病毒［27］侵染效率極高，幾乎能感染所有組織來(lái)源的細(xì)胞［28］；其次，慢病毒載體顆粒在細(xì)胞內(nèi)保持高度的穩(wěn)定性，維持細(xì)胞內(nèi)病毒量，增加感染率。憑借著成本低廉，操作方便，效率高等優(yōu)點(diǎn)，CRISPR/Cas9應(yīng)用廣泛［29-30］，迅速風(fēng)靡全球的實(shí)驗(yàn)室，成為了生物科研的有力幫手。

圖4 Western blotting印跡鑒定及DNA測(cè)序結(jié)果

圖5 PKA C-α基因敲除對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響

糖尿病是我國(guó)高發(fā)病率的疾病，由于糖尿病產(chǎn)生多種并發(fā)癥，目前尚無(wú)特效治療藥。其中2型糖尿病發(fā)病的主要機(jī)制是胰島β細(xì)胞分泌功能的異常［31］，胰島素分泌對(duì)維持血糖穩(wěn)態(tài)起著重要的作用，是表征胰腺β細(xì)胞功能正常的重要指標(biāo)。因此促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素對(duì)2型糖尿病者控制血糖是有效的，甚至對(duì)預(yù)防糖尿病的發(fā)生也有一定的作用。目前也有許多藥物可以促進(jìn)INS-1細(xì)胞胰島素的分泌［32-34］。前期研究表明PKA具有促進(jìn)胰島素分泌的作用，但是PKA在促進(jìn)胰島素分泌的過(guò)程中究竟發(fā)揮多大的作用仍未清楚。本實(shí)驗(yàn)利用敲除PKA C-α基因來(lái)檢測(cè)PKA C-α對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響。參考大鼠的基因組，對(duì)PKA C-α的10個(gè)外顯子序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)打分，選擇兩個(gè)打分最高的外顯子序列設(shè)計(jì)引物并構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒，即 lentiCRISPRv2-PKA C-α-Exon 5-sgRNA、lentiCRISPRv2-PKA C-α-Exon 7-sgRNA質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菢?gòu)建敲除PKA C-α基因的INS-1細(xì)胞株并且研究PKA C-α蛋白對(duì)胰島素分泌的影響，故直接采用Western blotting印記法驗(yàn)證敲除結(jié)果，不僅可以縮短實(shí)驗(yàn)周期和節(jié)省試劑耗材，而且蛋白水平上的變化更能反應(yīng)PKA C-α基因的敲除效果，結(jié)果具有說(shuō)服力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明lentiCRISPRv2-PKA C-α-Exon 7-sgRNA質(zhì)粒無(wú)敲低效果，可能是由于該sgRNA設(shè)計(jì)不合理或者脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生等；lentiCRISPRv2-PKA C-α-Exon 5-sgRNA質(zhì)粒敲低效果很明顯，故將該組細(xì)胞進(jìn)行T克隆測(cè)序，結(jié)果顯示，該組細(xì)胞的DNA與野生型INS-1細(xì)胞DNA的對(duì)比，插入了1bp堿基，這說(shuō)明sgRNA-Cas9慢病毒入侵INS-1細(xì)胞后，sgRNA準(zhǔn)確地靶向了PKA C-α基因的5號(hào)外顯子，隨后Cas9核酸酶在靶位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，INS-1細(xì)胞DNA在修復(fù)過(guò)程中，產(chǎn)生了插入突變，導(dǎo)致PKA C-α基因無(wú)法轉(zhuǎn)錄與翻譯；其次，PKA C-α基因敲除后，INS-1細(xì)胞胰島素分泌能力大大下降，提示PKA C-α對(duì)于INS-1細(xì)胞胰島素分泌發(fā)揮著重要的作用；此外，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的穩(wěn)定敲除PKA C-α基因的細(xì)胞株，與敲除PKA C-α基因動(dòng)物模型相比，構(gòu)建時(shí)操作較為簡(jiǎn)單，成功率高，成本低，可以很快實(shí)現(xiàn)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功的敲除了INS-1細(xì)胞中的PKA C-α基因，構(gòu)建了穩(wěn)定敲除PKA C-α基因的細(xì)胞株，為更深入研究PKA在胰島b細(xì)胞的功能提供了依據(jù)。