黃華媚 白立寬 劉葉 李俊維 王猛 花爾并

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；3. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

David Liu研究團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了基于鼠源胞嘧啶脫氨酶（rat APOBEC1，rAPOBEC1）與d/nCas9蛋白融合的胞嘧啶堿基編輯器BE（Base editor），實(shí)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中胞嘧啶（Cytosine，C）到胸腺嘧啶（Thymine，T）的單堿基轉(zhuǎn)換［4］。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，融合rAPOBEC1、nCas9（D10A）以及尿嘧啶糖苷酶抑制蛋白（Uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI）的BE3型胞嘧啶堿基器（rAPOBEC1-XTEN-nCas9（D10A）-UGI）編輯效率得到較大幅度提高，并在其它動(dòng)植物和微生物中廣泛應(yīng)用。與此同時(shí)，Akihiko Kondo研究團(tuán)隊(duì)則將七鰓鰻來(lái)源的胞嘧啶脫氨酶（PmCDA1）與d/nCas9蛋白進(jìn)行結(jié)合，開(kāi)發(fā)了胞嘧啶堿基編輯器Target-AID（Activation-induced cytidine deaminase），實(shí)現(xiàn)在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用［5］。隨后，David Liu研究團(tuán)隊(duì)又突破性的開(kāi)發(fā)了基于腺苷脫氨酶與CRISPR/Cas系統(tǒng)相結(jié)合的腺嘌呤堿基編輯器，可實(shí)現(xiàn)腺嘌呤（Adenine，A）到鳥(niǎo)嘌呤（Guanine，G）的單堿基轉(zhuǎn)換，進(jìn)一步的豐富了堿基編輯系統(tǒng)的工具箱［6］。

谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）是一株生物安全且具有重要工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的底盤微生物，目前被廣泛應(yīng)用于各種大宗化學(xué)品的工業(yè)化生產(chǎn)中［7］。本研究團(tuán)隊(duì)率先在谷氨酸棒桿菌中開(kāi)發(fā)了一種多元自動(dòng)化的胞嘧啶堿基編輯方法（Multiplex automatedCorynebacterium glutamicumbase editing method，MACBETH），結(jié)合 PmCDA1與 nCas9（D10A）蛋白，實(shí)現(xiàn)C到T的編輯［8］；隨后，通過(guò)采用識(shí)別不同PAM的Cas9突變體，優(yōu)化向?qū)NA（guide RNA，gRNA）的設(shè)計(jì)，開(kāi)發(fā)腺嘌呤堿基編輯器等，進(jìn)一步豐富了堿基編輯系統(tǒng)在谷氨酸棒桿菌中的應(yīng)用［9］。而截至目前，應(yīng)用較為廣泛的、基于BE3結(jié)構(gòu)的胞嘧啶堿基編輯器尚未有在谷氨酸棒桿菌中的報(bào)道應(yīng)用。由于BE3堿基編輯器的編輯窗口（PAM序列上游-13到-17位）與現(xiàn)有MACBETH技術(shù)編輯窗口（PAM序列上游-16到-20位）存在明顯差異，BE3型胞嘧啶堿基編輯器在谷氨酸棒桿菌中的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用將進(jìn)一步豐富基因組可編輯位點(diǎn)數(shù)量，為谷氨酸棒桿菌的工業(yè)化改造提供更多的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 本研究所用菌株和質(zhì)粒均為作者所在實(shí)驗(yàn)室保存和構(gòu)建，詳見(jiàn)表1。

表1 本文所用的質(zhì)粒與菌株

表2 本文使用到的引物

1.1.2 酶、引物及相關(guān)試劑盒 Q5 High-Fidelity DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。2×Es Taq Master Mix（Dye）購(gòu)自康為世紀(jì)有限公司。質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。重組試劑盒ClonExpress?MultiS One Step Cloning Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。DNA回收試劑盒EZ geneTMGel/PCR Extraction Kit購(gòu)自Biomiga公司。PCR引物由擎科生物有限公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，酵母粉5 g；NCM培養(yǎng)基（g/L）：磷酸氫二鉀17.4 g，氯化鈉11.6 g，葡萄糖5 g，蛋白胨5 g，酵母粉1 g，檸檬酸三鈉0.3 g，硫酸鎂0.05 g，山梨醇 91 g，調(diào) pH 至 7.2；BHIS 培養(yǎng)基（g/L）：BHI 18.5 g，山梨醇91 g，調(diào)pH至7.2；LBHIS 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5 g，氯化鈉10 g，酵母粉2.5 g，BHI18.5 g，山梨醇91 g。制備固體培養(yǎng)基時(shí)添加2%的瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 gRNA的設(shè)計(jì) 本研究所選用的gRNA序列均由sgRNAcas9軟件設(shè)計(jì)得出［10］，設(shè)計(jì)參數(shù)為：gRNA長(zhǎng)度20 nt，GC含量30%-70%，采用DNA雙鏈計(jì)算，其他參數(shù)為軟件默認(rèn)參數(shù)。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 質(zhì)粒pXMJ19-rACTS的構(gòu)建：首先將鼠源胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1的序列按照谷氨酸棒桿菌密碼子的偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，由金斯瑞公司合成；以合成質(zhì)粒為模板，用引物對(duì)rAPF/lk-R擴(kuò)增獲得rAPOBEC1序列片段；以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有質(zhì)粒pTadA-TadA7.10-nCas9（D10A）TS為模板，用引物對(duì)nC9-F/CAG-R2、CAG-F3/9sgcx-R和9sgcx-F/SD-R分別擴(kuò)增得到另外3個(gè)載體框架片段；將上述獲得的四片段同源重組連接，具體操作參見(jiàn)ClonExpress? MultiS One Step Cloning Kit說(shuō)明書(shū)，然后轉(zhuǎn)化E. coliDH5α感受態(tài)；最后，經(jīng)PstI和NdeI雙酶切驗(yàn)證，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，獲得正確質(zhì)粒。

質(zhì)粒pXMJ19-rACUTS的構(gòu)建：將枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）噬菌體PBS1來(lái)源的UGI蛋白的編碼基因進(jìn)行谷氨酸棒桿菌密碼子優(yōu)化，并由金斯瑞公司合成；以合成質(zhì)粒為模板，用引物對(duì)UGI-F/R擴(kuò)增得到UGI片段；以質(zhì)粒pXMJ19-rACTS為模板，擴(kuò)增獲得其他載體片段；通過(guò)多片段同源重組、轉(zhuǎn)化E. coliDH5α感受態(tài)、酶切驗(yàn)證以及測(cè)序，最終獲得正確質(zhì)粒。

定理1 (Rolle中值定理)若f滿足：(i)f在閉區(qū)間[a,b]上連續(xù)；(ii)f在開(kāi)區(qū)間(a,b)內(nèi)可導(dǎo)；(iii)f(a)=f(b)，則在(a,b)內(nèi)至少存在一點(diǎn)ξ，使得f′(ξ)=0.

質(zhì)粒pXMJ19-rACU-gRNA：：ccdBTS的構(gòu)建：以實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒pnCas9（D10A）-AID-gRNA-ccdBTS為模板，用引物CAG-gRNA-F/SD-R、CAGF3/180824-R分別擴(kuò)增得到兩個(gè)含ccdB基因的骨架片段；以pXMJ19-rACUTS為模板，用引物rAPF/cx180322-2R、cx180322-2/UGI（-BsaI）-R、UGI（-BsaI）-F/CAG-R2分別擴(kuò)增得到含rAPOBEC1-nCas9和UGI編碼基因的片段；多片段同源重組后，轉(zhuǎn)化到E. coliDB3.1感受態(tài)；經(jīng)酶切驗(yàn)證及測(cè)序，最終獲得正確質(zhì)粒。

含不同靶標(biāo)位點(diǎn)gRNA序列的質(zhì)粒pXMJ19-rACU-gRNATS，均由質(zhì)粒pXMJ19-rACU -gRNA：：ccdBTS通過(guò)Golden Gate方法構(gòu)建，具體方法可參見(jiàn)文獻(xiàn)［8］。

1.2.3 谷氨酸棒桿菌的轉(zhuǎn)化 將在BHI培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)的C. glutamicumATCC 13032菌液以初始OD6000.3轉(zhuǎn)接到含INH、Tween80、DL-蘇氨酸和葡萄糖的NCM培養(yǎng)基中。當(dāng)OD600=1時(shí)，制備C.glutamicumATCC 13032感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)，具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道［11］。

雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取 2 μg pXMJ19-rACTS質(zhì)?；騪XMJ19-rACUTS質(zhì)粒和 1 μg pTrcmob-gRNA 加入到80 μLC. glutamicumATCC 13032感受態(tài)細(xì)胞中，1.8kV電轉(zhuǎn)后立即加入1 mL 提前預(yù)熱的BHIS培養(yǎng)基，放至金屬浴鍋46℃溫浴6 min。搖床30℃培養(yǎng)2 h后，涂布于含15 μg/mL Kan和5 μg/mL Cm抗性的LBHIS固體培養(yǎng)基平板上，30℃靜置培養(yǎng)2-3 d，直至長(zhǎng)出單菌落。

單質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取1 μg pXMJ19-rACU-gRNATS質(zhì)粒到80 μLC. glutamicumATCC 13032感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化方法同雙質(zhì)粒，30℃后培養(yǎng)1 h后，涂布于含5 μg/mL Cm抗性的LBHIS固體培養(yǎng)基平板上。

1.2.4 谷氨酸棒桿菌的培養(yǎng)及堿基編輯 種子培養(yǎng)：挑取生長(zhǎng)良好的單菌落接種于裝有3 mL LBHIS液體培養(yǎng)基（含15 μg/mL Kan和5 μg/mL Cm）的15 mL試管中，30℃，220 r/min培養(yǎng)24 h。誘導(dǎo)培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)液按初始OD6000.2的接種量轉(zhuǎn)接于裝有3 mL的LBHIS液體培養(yǎng)基（含1 mmol/L IPTG，15μg/mL Kan和5 μg/mL Cm）的15 mL試管中，30℃，220 r/min培養(yǎng)20 h。1.2.5 質(zhì)粒去除及堿基編輯比例分析 將誘導(dǎo)編輯后的菌液，4 500 r/min、4℃條件下離心5 min，收集菌體，將上清去除后，用生理鹽水（0.9% NaCl）將菌體洗兩次，去除殘留的IPTG，然后用等體積的生理鹽水重懸菌體；按初始OD6000.01的接種量轉(zhuǎn)接至不含抗性的LBHIS液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)24 h；將菌液劃線到無(wú)抗的LBHIS固體平板上，37℃靜置培養(yǎng)2-3 d，直至長(zhǎng)出單菌落；針對(duì)不同的靶標(biāo)位點(diǎn)，隨機(jī)各自挑取10個(gè)單菌落，用各自引物（距離靶標(biāo)位點(diǎn)上下游200 bp處設(shè)計(jì)引物）和2×Es Taq Master Mix（Dye）進(jìn)行菌落PCR，將PCR產(chǎn)物送Sanger測(cè)序。借助SnapGene軟件分析Sanger測(cè)序峰圖結(jié)果，并通過(guò)DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析，將編輯后單菌落測(cè)序結(jié)果與原始序列比對(duì)，匯總整理編輯效率、編輯位點(diǎn)及比例。

2 結(jié)果

2.1 基于rAPOBEC1-nCas9（D10A）融合蛋白的堿基編輯器的構(gòu)建與測(cè)試

為了測(cè)試rAPOBEC1-nCas9（D10A）融合蛋白是否可以實(shí)現(xiàn)在谷氨酸棒桿菌中的高效編輯，我們以改造過(guò)的溫敏型質(zhì)粒pXMJ19TS作為框架，選用IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子tac，將經(jīng)過(guò)谷氨酸棒桿菌密碼子優(yōu)化后的rAPOBEC1融合在nCas9（D10A）蛋白的N端，并在中間添加X(jué)TEN連接肽，獲得重組質(zhì)粒pXMJ19-rACTS（圖1-A）。選取調(diào)控因子Cgl0016及Cgl0170作為兩個(gè)靶標(biāo)基因，將實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建且含該兩個(gè)靶標(biāo)基因gRNA序列的質(zhì)粒pTrcmob-gRNANoPer，分別與pXMJ19-rACTS共轉(zhuǎn)化至C. glutamicumATCC 13032中。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)編輯以及Sanger測(cè)序分析，如圖1-B所示，兩個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生了編輯，但只有Cgl0170出現(xiàn)C到T的編輯，編輯比例僅為20%，而且兩個(gè)位點(diǎn)均出現(xiàn)C到A或C到G的編輯，編輯產(chǎn)物純度不高，推測(cè)原因可能為胞內(nèi)的尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil DNA glycosylase，UDG）能夠?qū)⒅虚g產(chǎn)物U切除，形成無(wú)嘧啶位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)跨損傷合成聚合酶作用及DNA復(fù)制等，以一定幾率將C堿基轉(zhuǎn)換為其他堿基［12］。

2.2 融合UGI蛋白，構(gòu)建并測(cè)試BE3堿基編輯器

在之前的研究報(bào)道中，尿嘧啶糖苷酶抑制蛋白UGI的添加能夠有效抑制體內(nèi)的DNA堿基切除修復(fù)機(jī)制，防止胞嘧啶核苷脫氨轉(zhuǎn)化生成的尿嘧啶核苷被切除，從而提高C到T的轉(zhuǎn)化效率，并且對(duì)提高編輯產(chǎn)物純度也有重要作用［12］。為提高堿基編輯器的編輯效率，我們?cè)谏鲜鰎APOBEC1-nCas9（D10A）融合蛋白基礎(chǔ)上，在其C端進(jìn)一步融合谷氨酸棒桿菌密碼子優(yōu)化后的UGI蛋白，獲得BE3型胞嘧啶堿基編輯器（rAPOBEC1-XTEN-nCas9（D10A）-UGI），并將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pXMJ19-rACUTS（圖2-A）。經(jīng)過(guò)對(duì)靶標(biāo)基因Cgl0016及Cgl0170的誘導(dǎo)編輯以及Sanger測(cè)序分析，相比較于rAPOBEC1-nCas9（D10A）融合蛋白，添加UGI后，兩個(gè)位點(diǎn)的編輯效率均得到明顯提高（圖2-B）。其中，Cgl0016中C到T的編輯比例由原來(lái)的未編輯提高到高達(dá)90%，Cgl0170中C到T的編輯比例也由20%提高到70%，并且兩個(gè)位點(diǎn)的編輯中均未再出現(xiàn)C到A，C到G的編輯，編輯產(chǎn)物純度提高。

圖1 質(zhì)粒pXMJ19-rACTS的構(gòu)建及堿基編輯結(jié)果

圖2 質(zhì)粒pXMJ19-rACUTS的構(gòu)建及堿基編輯結(jié)果

2.3 優(yōu)化雙質(zhì)粒編輯系統(tǒng)為單質(zhì)粒編輯系統(tǒng)

依賴雙質(zhì)粒的堿基編輯系統(tǒng)，在谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)以及丟失質(zhì)粒環(huán)節(jié)，效率較低、操作繁瑣，不利于以后高通量自動(dòng)化的改造菌株。因此，為了簡(jiǎn)化操作，本研究在pXMJ19-rACUTS質(zhì)粒基礎(chǔ)上，加入gRNA轉(zhuǎn)錄模塊，獲得重組質(zhì)粒pXMJ19-rACU-gRNATS（圖3-A）。在gRNA模塊中插入ccdB反選標(biāo)簽，通過(guò)Golden Gate的連接方法即可快速實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)gRNA序列的替換。相比較于雙質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，單質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率得到明顯提高（圖4）。為了研究調(diào)整為單質(zhì)粒結(jié)構(gòu)后，編輯效率以及編輯窗口是否會(huì)受到影響，分別構(gòu)建了含Cgl0016及Cgl0170的靶標(biāo)gRNA序列的單質(zhì)粒編輯系統(tǒng)。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)編輯及Sanger測(cè)序，兩個(gè)位點(diǎn)均得到編輯，且編輯窗口未發(fā)生改變（圖3-B），雖然從測(cè)序峰圖及編輯比例來(lái)比較，單質(zhì)粒的編輯效率出現(xiàn)略微的下降，但編輯效率仍然較高，其中，Cgl0016中C到T的編輯比例為80%，Cgl0170中C到T的編輯比例為60%，并且均未有C到A，C到G的編輯。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，單質(zhì)粒編輯系統(tǒng)可以取代雙質(zhì)粒編輯系統(tǒng)，應(yīng)用于后期的研究中。

2.4 基因組中其他位點(diǎn)的堿基編輯測(cè)試

為了進(jìn)一步驗(yàn)證BE3型胞嘧啶堿基編輯器在谷氨酸棒桿菌的編輯效率，并測(cè)試該堿基編輯器編輯框的范圍，我們另選取了基因組中其他4個(gè)位點(diǎn)（Cgl0106，Cgl1492，Cgl0221，Cgl2111）進(jìn)行測(cè)試。通過(guò)分別構(gòu)建含靶標(biāo)gRNA序列的單質(zhì)粒編輯系統(tǒng)、誘導(dǎo)編輯以及Sanger測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)位點(diǎn)同樣可以實(shí)現(xiàn)C到T的編輯（圖5），除Cgl0106位點(diǎn)編輯效率為40%外，其他3個(gè)位點(diǎn)的編輯效率均高達(dá)90%-100%，充分證明了該堿基編輯器的高效性。另外還發(fā)現(xiàn)，該堿基編輯器的編輯框可以覆蓋PAM上游-11至-19位，相比較于哺乳動(dòng)物中的編輯框（PAM上游-13到-17位），范圍更大，該特性推測(cè)可能是由于物種差異所造成。編輯框的擴(kuò)展，將覆蓋更多的基因組靶標(biāo)位點(diǎn)，在全基因組失活基因應(yīng)用中，具有較明顯的優(yōu)勢(shì)。

圖3 質(zhì)粒pXMJ19-rACU-gRNATS的構(gòu)建及堿基編輯結(jié)果

圖5 谷氨酸棒桿菌基因組位點(diǎn)堿基編輯結(jié)果

3 討論

谷氨酸棒桿菌是從土壤中分離出來(lái)的革蘭氏陽(yáng)性菌，為食品安全性菌株，在工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域廣泛的應(yīng)用于生產(chǎn)各類氨基酸、有機(jī)酸等大宗化學(xué)品。近年來(lái)，隨著CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)展與壯大，科研人員已成功在谷氨酸棒桿菌中建立了基于DSB的CRISPR/Cas9或Cpf1基因組編輯工具，為谷氨酸棒桿菌的基因組改造提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持［13-14］。但是由于DSB帶來(lái)的毒性、對(duì)外源模板DNA的需求，以及谷氨酸棒桿菌自身基因組的穩(wěn)定導(dǎo)致的同源重組效率低，這些因素限制了CRISPR/Cas系統(tǒng)在谷氨酸棒桿菌中的應(yīng)用，對(duì)于自動(dòng)化高通量的基因組改造、多位點(diǎn)編輯等仍然存在較大難度。堿基編輯技術(shù)的興起，為解決上述問(wèn)題提供了新的研究思路。該技術(shù)結(jié)合了CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶向特異性與堿基脫氨酶的催化活性，可在不產(chǎn)生DSB、不依賴宿主的同源重組修復(fù)且不需要外源DNA模板的情況下對(duì)基因組上位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)高效精準(zhǔn)的編輯，并且避免了DSB造成的靶標(biāo)或非靶標(biāo)序列的缺失、插入等突變。

BE3型堿基編輯器與前期已開(kāi)發(fā)的堿基編輯技術(shù)MACBETH相比，主要存在以下幾點(diǎn)不同：（1）編輯窗口不同，MACBETH編輯窗口為PAM上游-16到-20位，而B(niǎo)E3的編輯窗口覆蓋范圍較寬，為PAM上游-11到-19位；（2）編輯效率存在差異，MACBETH技術(shù)在不添加UGI蛋白的情況下，編輯效率即可達(dá)到較高，C到T的堿基編輯效率高達(dá)90%-100%，而B(niǎo)E3型堿基編輯器在不添加UGI蛋白時(shí)，編輯效率較低，UGI蛋白的添加能顯著提高堿基編輯效率，使得C到T的堿基編輯效率同樣高達(dá)90%-100%。BE3型堿基編輯器的開(kāi)發(fā)能夠很好的與MACBETH互補(bǔ)，有助于覆蓋更多的基因組靶標(biāo)位點(diǎn)，為自動(dòng)化高通量的基因組改造提供更多的選擇，從而加速谷氨酸棒桿菌的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。

4 結(jié)論

本研究首先融合表達(dá)rAPOBEC1-nCas9（D10A）蛋白，實(shí)現(xiàn)在谷氨酸棒桿菌中C到T的編輯，編輯比例較低（0-20%）。添加UGI蛋白后，顯著提高了堿基編輯效率，使得C到T的堿基編輯效率高達(dá)90%。為了簡(jiǎn)化操作，將雙質(zhì)粒堿基編輯系統(tǒng)優(yōu)化為單質(zhì)粒堿基編輯系統(tǒng)，并且未明顯影響堿基編輯效率及編輯窗口。最后對(duì)基因組中其他位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試，證明編輯框?yàn)镻AM上游-11到-19位，編輯效率為40%-100%。