周巖 郭嘉 胡玉鋒，4 魏健 李毅丹

（1. 長春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130032；2. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，長春130033；3. 吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長春 130033；4. 吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四平136000）

香味品質(zhì)已經(jīng)成為消費(fèi)者選擇稻米的重要指標(biāo)。然而，市售優(yōu)質(zhì)香稻品種較少，特別是在口感良好的粳稻品種中，香味品質(zhì)突出的則更為稀缺。因此，對優(yōu)質(zhì)粳稻材料進(jìn)行改良，提升其香味品質(zhì)，將具有廣闊的市場前景。1979年Yajima等［1］在米飯中檢測到114種具有香味的揮發(fā)性化合物。其中，2-乙?；?1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2-AP）是影響稻米香味的主要化合物［2］。2-AP前體物質(zhì)Δ-1-吡咯啉（1-pyrroline）的代謝是由甜菜醛脫氫酶Ⅱ（Betaine aldehyde dehydrogenase 2，BADH2）催化的，水稻內(nèi)源BADH2活性降低會導(dǎo)致2-AP含量增加，進(jìn)而會提升水稻的香味［3］。水稻OsBADH2基因現(xiàn)已成為改良水稻香味品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵目標(biāo)基因。

CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9，Cas9）技術(shù)是目前應(yīng)用最為廣泛的基因組編輯技術(shù)［4］。因其具有準(zhǔn)確性高、細(xì)胞毒性小、可同時(shí)對多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行編輯等優(yōu)勢，已被應(yīng)用在水稻等主要作物的遺傳改良中［5］。目前已有報(bào)道使用CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻中編輯OsBADH2基因，并獲得了badh2突變體材料［6-9］。這些研究均采用了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化方法，這種方法需要進(jìn)行4-5周的抗性篩選，而利用這一方法獲得T0材料后，至少需經(jīng)過一次自交才能在后代中獲得無轉(zhuǎn)基因成分的基因編輯后代材料，并且仍需要進(jìn)行一代甚至多代的回交，才能最終獲得編輯靶點(diǎn)純合的突變材料，突變材料創(chuàng)制和篩選耗時(shí)較長。2016年，高彩霞課題組利用基因槍介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法，在小麥中建立了高效的CRISPR/Cas9基因編輯體系［10］。該體系為快速獲得基因組編輯粳稻材料提供了新思路。另外，基因編輯后代材料的分子檢測也是基因組編輯體系中的重要環(huán)節(jié)。目前，利用PCR擴(kuò)增、限制酶酶切和測序相結(jié)合的檢測方法應(yīng)用較多，但仍存在著耗時(shí)長、成本高等不足。而隨著高分辨率溶解曲線（High resolution melting，HRM）技術(shù)被引入到在基因編輯后代材料的分子檢測［11-12］，有效的降低了成本，提高了檢測效率。因此，本研究通過基因槍介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系對“吉粳88”進(jìn)行基因編輯，敲除調(diào)控水稻香味的OsBADH2基因，并利用HRM技術(shù)對基因編輯后代材料進(jìn)行分子檢測，預(yù)期在T1代獲得無轉(zhuǎn)基因成分且編輯位點(diǎn)純合的“吉粳88”badh2突變體，為香味粳稻育種提供新的種質(zhì)資源。同時(shí)，也對基于瞬時(shí)表達(dá)的粳稻基因組編輯技術(shù)體系進(jìn)行探索和完善。

1 材料與方法

1.1 材料

以粳稻“吉粳88”為轉(zhuǎn)化材料，轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)于2017-2018年在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院完成?；蚓庉嫼蟠牧显诩质∞r(nóng)業(yè)科學(xué)院公主嶺院區(qū)溫室中盆栽種植。大腸桿菌（DH5α）感受態(tài)細(xì)胞，基因編輯載體均來源于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。實(shí)驗(yàn)所用引物的合成以及PCR產(chǎn)物測序工作由吉林省庫美生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 OsBADH2靶點(diǎn)的選擇 首先，對“吉粳88”的OsBADH2基因進(jìn)行全長擴(kuò)增（引物見表1）并測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的OsBADH2基因參考序列（Gene ID：105128600）比對，確定保守區(qū)域；進(jìn)而使用在線工具CRISPR-GE（http：//skl.scau.edu.cn/）在基因保守區(qū)域中選擇候選靶點(diǎn)；最后，為避免出現(xiàn)脫靶，在水稻全基因組數(shù)據(jù)庫RADB（https：//rapdb.dna.affrc.go.jp）以及NCBI數(shù)據(jù)庫中對候選靶點(diǎn)進(jìn)行特異性檢驗(yàn)，最終確定靶點(diǎn)。

1.2.2 CRISPR/Cas9 表達(dá)載體構(gòu)建 分別構(gòu)建含有不同靶點(diǎn)序列的gRNA表達(dá)盒，表達(dá)盒中的靶點(diǎn)序列由U6啟動子驅(qū)動，并在sgRNA scaffold后添加NOS終止密碼。XbaⅠ和PstⅠ雙酶切后，將gRNA表達(dá)盒連入pJSCRISPR/Cas9載體（圖2）。

1.2.3OsBADH2基因編輯材料的創(chuàng)制 去穎殼的“吉粳88”籽粒經(jīng)1 ‰的升汞溶液浸泡處理8 min后，無菌水清洗5次。消毒后的種子在NS和NS1培養(yǎng)基（表2）中分別進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和繼代。使用基因槍法對所獲愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的愈傷組織在NS1培養(yǎng)基（表2）上恢復(fù)培養(yǎng)48 h?；謴?fù)處理后的愈傷組織于MD培養(yǎng)基（表2）上誘導(dǎo)成苗。將株高約1.5-2 cm的T0代再生苗轉(zhuǎn)至MR培養(yǎng)基（表2）誘導(dǎo)生根。參照李楠等［13］的粳稻愈傷組織的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)條件為全程光照，光照強(qiáng)度1 600 lux，室溫29℃。挑選根系茁壯的T0植株在溫室中煉苗2-3 d后移栽。

1.2.4 基因編輯材料的分子檢測 為檢測靶點(diǎn)的編輯情況，針對不同靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異的HRM檢測引物（表1），并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：2× Phanta Max Master mix 10 μL；上下游引物各0.5μL ；EvaGreen 0.5 μL ；DNA 模 板 1 μL ；水 7.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3 min；95℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 10 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min；95℃ 30 s后，以每秒0.1℃降溫至40℃；4℃保存。使用LightScanner（Idaho Technology，美國）進(jìn)行HRM分析，根據(jù)溶解曲線差異，將鑒定為序列發(fā)生變化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行測序驗(yàn)證，確定靶點(diǎn)編輯類型。

表1 引物信息

2 結(jié)果

2.1 基因編輯靶點(diǎn)的選擇

使用CRISPR-GE最終在OsBADH2基因的第2、第3和第4外顯子區(qū)選擇了3個(gè)編輯靶點(diǎn)（圖1-A），并分別合成了gRNA表達(dá)盒連接入pJSCRISPR/Cas9載體中（圖1-B）。

2.2 基因編輯材料的創(chuàng)制

通過對李楠等［13］的粳稻組培再生體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了一套僅需約70 d，即可完成從成熟胚誘導(dǎo)愈傷到最終獲得T0代陽性植株的組培再生體系。該體系僅使用了NS、NS1、MD、MR四種培養(yǎng)基（表2）。首先，成熟胚在NS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)7-10 d即可獲得淡黃色且蓬松的愈傷組織；再經(jīng)過7-10 d的繼代培養(yǎng)，愈傷組織可增殖一倍以上。在MD培養(yǎng)基上僅需14 d的分化培養(yǎng)即可獲得分化苗，每皿12塊初始愈傷經(jīng)分化培養(yǎng)后，可獲得8-20株分化苗；在MR培養(yǎng)基上，分化苗的生根率為100%，且易于移栽，移栽成活率也可達(dá)到100%。利用基因槍法介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，組培過程中省略了抗生素的篩選，因此獲得分化苗的周期并未增長。最終，獲得靶點(diǎn)1的T0代基因編輯再生苗270株，靶點(diǎn)2的基因編輯T0代再生苗296株，靶點(diǎn)3的基因編輯T0代再生苗281株。

2.3 基因編輯材料的分子檢測

為快速檢測所獲得的后代材料是否在設(shè)計(jì)靶點(diǎn)位置發(fā)生了編輯，本研究利用HRM檢測技術(shù)對T0和T1代材料進(jìn)行了分子鑒定。HRM檢測結(jié)果（圖2）顯示，后代材料的目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線可清晰的區(qū)分突變體與野生型。經(jīng)測序驗(yàn)證，HRM檢測鑒定出的突變體，其靶點(diǎn)序列均發(fā)生了編輯。編輯類型主要為單堿基或多堿基缺失，以及部分堿基的替換。

表2 培養(yǎng)基組分

為獲得編輯位點(diǎn)純合突變且無轉(zhuǎn)基因成分的基因編輯后代材料，我們對T1代材料進(jìn)行了潮霉素抗性基因的PCR檢測。潮霉素檢測為陰性的樣品，進(jìn)一步利用HRM分析結(jié)合測序驗(yàn)證，檢測編輯靶點(diǎn)的純合性。結(jié)果顯示3個(gè)編輯靶點(diǎn)的T1代材料中，均獲得了純合靶點(diǎn)編輯且無轉(zhuǎn)基因成分的基因編輯材料，其中靶點(diǎn)1 編輯有3類，靶點(diǎn)2編輯有2類，靶點(diǎn)3編輯有2類（圖3）。HRM檢測不但能將編輯靶點(diǎn)上發(fā)生多堿基缺失的材料（如：T1-C-2-16）與野生型材料清晰的區(qū)分，而且對編輯靶點(diǎn)只發(fā)生單堿基缺失的材料（如T1-C-2-22），也能明確的檢出（圖4）。說明HRM檢測非常適用于基因編輯后代材料的檢測。

圖1 pJSCRISPR/Cas9表達(dá)載體與基因編輯靶位點(diǎn)

圖2 突變材料的HRM分析與測序驗(yàn)證

圖3 T1純合等位基因突變體比對分析

3 討論

“吉粳88”是稻米品質(zhì)達(dá)到國家一級標(biāo)準(zhǔn)的粳稻品種。2005年至今，由其作為育種親本而獲得認(rèn)定的粳稻優(yōu)質(zhì)品種共有72個(gè)。進(jìn)一步改良吉粳88的香味品質(zhì)，迎合市場對稻香米的需求，具有重要的育種價(jià)值。CRISPR/Cas9技術(shù)相對于鋅指蛋白（Zinc-finger nucleases，ZFNs）技術(shù)和TALEN 核酸 酶（Transcription activator like effector nucleases，TALENs）技術(shù)，更為簡單、高效，在植物基因組編輯的研究領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用［15］。目前，對水稻OsBADH2基因進(jìn)行CRISPR/Cas9基因編輯的研究已有報(bào)道［6-9］，而這些研究均選擇了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化方案。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，必須要經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的抑菌以及對愈傷組織的抗性篩選等過程，最終獲得基因編輯突變體通常需要2-3年的時(shí)間。相對于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化而言基因槍轉(zhuǎn)化容易導(dǎo)入多個(gè)拷貝，因此在轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化中不被廣泛使用。鑒于CRISPR/Cas9技術(shù)不需要載體整合到基因組持續(xù)發(fā)揮功能這一特點(diǎn)，在轉(zhuǎn)化階段多拷貝的導(dǎo)入反而增大導(dǎo)入片段發(fā)揮功能的概率，因此我們認(rèn)為基因槍轉(zhuǎn)化與植物基因組編輯具有更高的契合度。2016年，高彩霞課題組在小麥中建立了高效的CRISPR/Cas9基因編輯體系，該體系采用了基于基因槍轉(zhuǎn)化的瞬時(shí)表達(dá)體系，且減少了抗性篩選過程，大大縮短了成苗時(shí)間［10］。本研究借鑒了該研究成果的成功經(jīng)驗(yàn)，采用基因槍介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，針對3個(gè)OsBADH2基因編輯靶點(diǎn)分別進(jìn)行了編輯，在50-60 d即可獲得T0代材料。分子檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsBADH2基因3處靶點(diǎn)均獲得了發(fā)生序列變異的后代材料。OsBADH2基因靶點(diǎn)的編輯類型主要以小片段的堿基缺失為主。在T1代材料中，成功的篩選出了badh2突變體。

圖4 純合無轉(zhuǎn)基因成分編輯材料的分子驗(yàn)證

在規(guī)?；幕蚓庉嬘N工作中，后代材料的分子檢測是重要的一環(huán)。盡管RFLP分析（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）［15-16］、dCAPS衍生分析（derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPS）［17-18］、限制性酶切PCR法（Restriction enzyme-PCR，RE-PCR）［19-20］以及測序分析能夠滿足編輯后代材料的鑒定需求［21］。然而，這些方法耗時(shí)長、成本高，不適合規(guī)?；蚓庉嬘N工作。因此如何提高基因編輯后代材料的檢測效率、降低檢測成本，成為了優(yōu)化基因編輯育種體系的重要方面。

HRM是一種針對小片段核酸多態(tài)性進(jìn)行精準(zhǔn)分型的檢測技術(shù)。Andrew等［22］在2014年就應(yīng)用HRM檢測成功鑒別出基因編輯果蠅的突變體；隨后Thomas等［23］將該技術(shù)系統(tǒng)的應(yīng)用在基因組編輯的斑馬魚突變體的檢測中；Chen等［11］使用HRM技術(shù)鑒別番茄的不同基因編輯突變體。上述研究表明HRM技術(shù)可應(yīng)用于動植物基因編輯后代材料的分子檢測。2010年，Li等［24］建立的基于EvaGreen的HRM體系，將HRM檢測成本降低至96個(gè)反應(yīng)2美金，推動了HRM的廣泛應(yīng)用。為了進(jìn)一步的加快粳稻基因編輯效率，降低編輯材料鑒定成本，本研究引入了HRM技術(shù)對基因編輯后代材料進(jìn)行鑒別。結(jié)果表明HRM技術(shù)可以在1.5 h內(nèi)完成檢測，大大縮短了檢測時(shí)間。

評價(jià)稻米香味品質(zhì)是培育香稻的重要環(huán)節(jié)，但目前尚未有評價(jià)稻米香味的通用標(biāo)準(zhǔn)。以往的研究中對香米的評價(jià)方式主要為KOH法檢測水稻分蘗期葉片的氣味，口嚼法檢測水稻種子的味道，以及GC-MS聯(lián)用檢測主要香味成分2-AP的含量等［25］。由于本研究的所獲得突變體材料有限，尚無法對突變體中2-AP進(jìn)行檢測，本研究僅對葉片的香味表型做了感官性評價(jià)。通過采用KOH法對T1代基因編輯材料的葉片進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)OsBADH2基因編輯材料與野生型對照相比，大部分badh2突變體的葉片香味增加。我們也發(fā)現(xiàn)了5株badh2不具有明顯的香味變化。Jang等［26］在OsIAA23中的研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR基因編輯可誘發(fā)后代材料中的可變剪切，進(jìn)而補(bǔ)償性的修復(fù)編輯位點(diǎn)的功能突變。因此，后續(xù)研究中我們將通過2-AP的含量的測定更準(zhǔn)確的分析badh2突變體預(yù)期表型與基因型的對應(yīng)關(guān)系，并解析部分badh2突變體不具備香味表型的機(jī)理。

4 結(jié)論

利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制了一批OsBADH2基因編輯的“吉粳88”后代材料，并篩選獲得了香味性狀改良的后代編輯材料。建立了一套基于基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的粳稻CRISPR/Cas9編輯體系和后代材料HRM檢測技術(shù)體系。