韓梅 袁超 郭婷婷 吳怡 岳耀敬 楊博輝

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院羊育種工程技術(shù)研究中心，蘭州 730050）

自從美國(guó)科學(xué)家 Briggs和 King［1］于 1952 年第一次通過(guò)囊胚細(xì)胞核移植成功獲得了克隆蝌蚪以來(lái)，科研人員開(kāi)始了核移植的不斷探索。英國(guó)科學(xué)家Wilmut等［2］在1997年使用綿羊乳腺上皮細(xì)胞作為核供體細(xì)胞將細(xì)胞核移入卵母細(xì)胞中，成功獲得世界上第一只克隆綿羊“Dolly”。Dolly的出生證明了高度分化的成年哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核在去核卵母細(xì)胞胞質(zhì)中可以發(fā)生重新編程恢復(fù)其全能性，并且重組細(xì)胞能夠發(fā)育成與供體細(xì)胞遺傳物質(zhì)相同的新個(gè)體，為體細(xì)胞核移植的研究奠定了的夯實(shí)的理論基礎(chǔ)。在此之后科學(xué)家利用傳統(tǒng)克隆技術(shù)先后成功克隆出牛［3］、山羊［4］、豬［5］等多種哺乳動(dòng)物。然而克隆效率卻一直較低，并且該過(guò)程需要使用顯微操作儀去除卵母細(xì)胞核，然后通過(guò)融合法［6］或注射法［7］使供體細(xì)胞或供體細(xì)胞核進(jìn)入去核卵母細(xì)胞，成本較高，操作復(fù)雜，且囊胚率較低。為此，科研人員不斷對(duì)TC進(jìn)行改進(jìn)。Vajta等［8］于2001年對(duì)Peura的方法進(jìn)行改進(jìn)，首次以體細(xì)胞為核供體細(xì)胞，通過(guò)手工操作將去透明帶核移植技術(shù)成功應(yīng)用于克隆牛。這一改進(jìn)的核移植技術(shù)便是手工克隆（Handmade cloning，HMC）技術(shù)。該技術(shù)不需要顯微操作儀、操作較簡(jiǎn)單、成本較低，且克隆囊胚率高于基于顯微操作的TC［9-10］。表1總結(jié)了HMC和TC之間的異同。從HMC技術(shù)的出現(xiàn)直到現(xiàn)在，HMC技術(shù)已經(jīng)用于多種動(dòng)物的克隆，但是克隆效率仍較低。許多科研人員不斷對(duì)體細(xì)胞或重構(gòu)胚進(jìn)行不同試劑的處理，嘗試通過(guò)多種優(yōu)化方法提高手工克隆效率。本綜述介紹了手工克隆技術(shù)的發(fā)展、操作研究以及影響手工克隆效率的因素。此外，除了HMC的優(yōu)勢(shì)和局限性之外，本文還討論了該技術(shù)的未來(lái)前景，以期能夠提高牛、羊和豬等多種哺乳動(dòng)物手工克隆的效率。PVA）、聚乙烯吡咯烷（Polyvinylpyrrolidone，PVP）和胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS），并對(duì)綿羊卵母細(xì)胞的數(shù)量及重構(gòu)胚的卵裂率進(jìn)行了比較，實(shí)驗(yàn)表明PVA和PVP可以作為血清替代品用于卵母細(xì)胞的體外成熟。Zhang等［20］使用HMC生產(chǎn)了肌醇六磷酸酶轉(zhuǎn)基因豬胚泡，為進(jìn)一步生產(chǎn)植酸酶轉(zhuǎn)基因豬提供了基礎(chǔ)。也有研究表明，用HMC生產(chǎn)的成纖維細(xì)胞在歐洲可以有效地降低脫發(fā)性的能力［21］。Moulavi等［22］于2019年將最初用于綿羊的改良的手工克隆（Modified method of handmade cloning，m-HMC）技術(shù)應(yīng)用于單峰駱駝的克隆，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明m-HMC技術(shù)可能是一種有效生產(chǎn)克隆駱駝和使其商業(yè)化的可行的方法。Khan等［10］將通過(guò)TC和HMC兩種方法獲得克隆綿羊囊胚進(jìn)行比較，結(jié)果HMC相比TC獲得的胚泡百分率更高。

1 動(dòng)物手工克隆技術(shù)發(fā)展

1995年，Tatham等［11］通過(guò)用蛋白酶去除透明帶改進(jìn)核移植程序，但未能成功產(chǎn)下小牛。隨后，Peura等［12］于1998年首次通過(guò)無(wú)透明帶的去核方法成功克隆了牛。Vajta等［13］于2004年在沒(méi)有顯微操作儀和CO2培養(yǎng)箱的野外進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用HMC技術(shù)完成核移植，成功獲得非洲第一頭手工克隆牛。Lagutina等［14］于2005年用去透明帶法使馬卵母細(xì)胞獲得較高的融合率，并成功產(chǎn)下一只健康的活馬駒。隨后克隆出小鼠［15］、豬［16］、綿羊［17］等多種哺乳動(dòng)物。此后，科研人員對(duì)HMC進(jìn)行不斷研究，以期進(jìn)一步優(yōu)化手工克隆技術(shù)。尤其近幾年研究較多（表2），呂玲燕等［18］于2016年通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明丙戊酸（Valproic acid，VPA）處理可提高豬HMC重構(gòu)胚胎的囊胚率。Quan等［19］于2017年在綿羊卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，

表1 HMC和TC之間的異同

2 手工克隆技術(shù)操作研究

2.1 核供體細(xì)胞的準(zhǔn)備

核供體細(xì)胞的來(lái)源和細(xì)胞周期的同步化是影響核供體細(xì)胞的重要因素。HMC最初利用牛胚胎細(xì)胞作為供體核的來(lái)源［36］。隨后科研人員又研究了許多其他來(lái)源，如囊胚細(xì)胞［37］、顆粒細(xì)胞［8］、胚胎干細(xì)胞［38］、牛［39］、山羊［36］、綿羊［40］成年成纖維細(xì)胞、豬［41］、山羊［42］胎兒成纖維細(xì)胞。供體細(xì)胞的選擇對(duì)于克服與核重新編程相關(guān)的問(wèn)題非常重要。Saini等［36］研究表明成纖維細(xì)胞來(lái)源的供體細(xì)胞比上皮來(lái)源的供體細(xì)胞更容易發(fā)生重編程。近幾年通過(guò)對(duì)成纖維細(xì)胞的研究，Jena等［43］發(fā)現(xiàn)胎兒成纖維細(xì)胞和成年成纖維細(xì)胞對(duì)山羊HMC胚胎產(chǎn)生效率無(wú)顯著差異。Liu等［44］表明成年供體成纖維細(xì)胞的HMC胚泡形成率較高，而胎兒供體成纖維細(xì)胞的HMC發(fā)育異常率較低，且仔豬出生效率較高。并且Liu［45］等于2018年通過(guò)使用胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植成功克隆了獼猴。另外，受體與供體核細(xì)胞周期之間的同步被認(rèn)為是增加核重編程能力并提高克隆效率所需的關(guān)鍵因素［46］。經(jīng)處理后處于G0/G1階段的供體細(xì)胞核移植胚胎胚泡發(fā)生率更高［47］。

2.2 受體卵母細(xì)胞的選擇，體外成熟和去核

卵母細(xì)胞的質(zhì)量是在體外條件下胚胎成功發(fā)育的主要因素。形態(tài)學(xué)觀察是卵母細(xì)胞選擇的一種常見(jiàn)的做法，通過(guò)觀察卵母細(xì)胞周?chē)亚鸺?xì)胞層的數(shù)目，緊密度和卵質(zhì)均一性進(jìn)行選擇［48］。收集的卵母細(xì)胞基于觀察法可被分為3類(lèi)：A、B和C級(jí)，研究表明A級(jí)卵母細(xì)胞成熟率更高并應(yīng)用于體外胚胎生產(chǎn)［49］。也可以通過(guò)亮甲酚藍(lán)染色劑（Brilliant cresyl blue，BCB）染色進(jìn)行選擇。Mohapatra等［50］使用BCB染色卵母細(xì)胞用于水牛HMC胚胎生產(chǎn)。根據(jù)MII中期階段是哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆產(chǎn)生胚胎的最佳時(shí)期這一特性［51］，卵母細(xì)胞在含有FSH、LH和雌二醇等激素的成熟培養(yǎng)基中體外成熟22 h-24 h［43］。成熟的卵母細(xì)胞可以通過(guò)鏈霉蛋白酶處理［13］或透明質(zhì)酸酶處理［52］來(lái)去除透明帶。HMC中的去核方法主要包括化學(xué)輔助手工去核（Chemically assisted handmade enucleation，CAHE）和極體定向手工去核（Oriented handmade enucleation，OHE）。Li等［53］表明與OHE方法相比，CAHE后的體外發(fā)育能力較低。然而，Akshey等［54］研究表明CAHE獲得的胞質(zhì)數(shù)明顯高于OHE，CAHE是一種用于山羊HMC的高效、可靠的去核方法。

表2 哺乳動(dòng)物手工克隆技術(shù)發(fā)展事件

2.3 融合和胚胎培養(yǎng)

去核的卵母細(xì)胞與供體細(xì)胞的融合激活主要通過(guò)電激活和化學(xué)激活。Vajta等［8］通過(guò)電脈沖進(jìn)行HMC胚胎的激活，Borah等［49］用鈣離子載體和6-（二氨基）嘌呤（6-dimethylamino purine，6-DMAP）處理進(jìn)行化學(xué)激活。Akshey等［55］研究表明，電脈沖激活對(duì)山羊HMC胚胎卵裂率和囊胚率優(yōu)于鈣離子載體激活。科研人員對(duì)融合參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，如對(duì)于水牛HMC，Selokra等［56］已經(jīng)優(yōu)化了電融合條件，使融合率超過(guò)95%，胚泡率達(dá)到52.0%。融合后，胚胎培養(yǎng)體系和培養(yǎng)基的選擇對(duì)胚胎發(fā)育至關(guān)重要。融合后的胚胎培養(yǎng)體系包括微穴法（Well of the well，WOW）［57］，微滴法（Microdrop，MD）［58］和平面培養(yǎng)法（the flat surface culture system，F(xiàn)S）［59］，目前WOW和FS使用較多。培養(yǎng)基不僅為胚胎的體外發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)，而且還會(huì)影響胚胎體內(nèi)的發(fā)育。培養(yǎng)基主要包括（Modified charles rosenkrans 2，mCR2），改良的合成輸卵管液（Modified synthetic oviductal fluid，mSOF） 和（Research vitro cleave，RVCL）。Shah［59］等比較了 mCR2，mSOF 和 RVCL 三種培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)在RVCL培養(yǎng)基中觀察到的水牛HMC卵裂率和囊胚率高于其他兩種培養(yǎng)基。另外培養(yǎng)基的選擇也取決于胚胎的發(fā)育階段，培養(yǎng)體系，胚胎類(lèi)型和物種。mSOF培養(yǎng)基已經(jīng)被廣泛用于MD的水牛HMC中［60-61］，而RVCL培養(yǎng)基最適合用于使用FS的手工克隆中［62-63］。

3 限制手工克隆效率的主要因素

影響HMC效率的因素眾多，包括體細(xì)胞的選擇，卵母細(xì)胞的選擇，卵母細(xì)胞的去核程序，重構(gòu)胚的培養(yǎng)條件，重構(gòu)胚的融合-激活方案和表觀遺傳重編程等。影響HMC效率的主要因素為異常的表觀遺傳重編程。Kang等［64］表明造成體細(xì)胞克隆效率低以及克隆動(dòng)物各類(lèi)異常表型的主要原因之一是表觀遺傳修飾在克隆胚胎早期發(fā)育階段的異常重編程?；蚪M的重新編程是高度復(fù)雜的過(guò)程，需要及時(shí)激活和關(guān)閉決定蛋白質(zhì)正確表達(dá)的基因。異常的表觀遺傳重編程包括DNA甲基化、組蛋白修飾、X染色體失活、基因組印記［65］等。Jyotsana等［32］表明水?？寺∨咛ブ写嬖诟叨鹊腄NA甲基化和組蛋白乙酰化，其基因表達(dá)模式與體外受精胚胎中的表達(dá)模式不同。Suteevun等［66］表明DNA的甲基化水平在2細(xì)胞期到8細(xì)胞期不斷降低，到桑椹胚開(kāi)始不斷增加，在囊胚期達(dá)到最高。同時(shí)，桑椹胚期組蛋白乙?；阶畹?。另外，近期研究表明手工克隆囊胚與體外受精相比，表觀遺傳修飾不同［32，63］。此外經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾中組蛋白3賴(lài)氨酸9（Histone 3 Lysine 9，H3K9）甲基化是細(xì)胞重編程的主要障礙之一［67］。同樣，組蛋白3賴(lài)氨酸27（Histone 3 Lysine 27，H3K27）的甲基化水平高被認(rèn)為是細(xì)胞重編程的重要障礙［68］。同時(shí)，克隆胚胎也會(huì)發(fā)生異常的組蛋白乙?；揎?。也有科研人員確定組蛋白3賴(lài)氨酸4（Histone 3 Lysine 4，H3K4）甲基化為主要的表觀遺傳學(xué)障礙［69］。眾多科研人員的研究結(jié)果為提高HMC克隆效率奠定了理論基礎(chǔ)。

圖1 手工克隆技術(shù)程序（改自Verma［23］等）

4 手工克隆效率的提高

對(duì)于體細(xì)胞的選擇，卵母細(xì)胞的選擇，卵母細(xì)胞的去核程序，重構(gòu)胚的培養(yǎng)條件，重構(gòu)胚的融合-激活，科研人員已經(jīng)將其優(yōu)化，文中已詳細(xì)闡述。對(duì)于異常的表觀遺傳修飾，科研人員已通過(guò)不同方法來(lái)修復(fù)異常重編程。這些方法主要通過(guò)表觀遺傳修飾劑或者表觀遺傳抑制調(diào)控因子來(lái)修復(fù)供體細(xì)胞或胚胎的表觀遺傳編程狀態(tài)，對(duì)囊胚率和胚胎質(zhì)量有明顯改善［70］。研究證明，S-腺苷高半胱氨酸［71］、5-氮雜 -2'-脫氧胞苷［72］和 RG108［73］能夠降低DNA甲基化水平，并且提高囊胚率。對(duì)于提高組蛋白乙?；椒矫妫蒲腥藛T直到目前已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，如通過(guò)提高組蛋白賴(lài)氨酸各位點(diǎn)乙酰化水平來(lái)提高HMC囊胚率。吳霄等［74］通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得賴(lài)氨酸特異性脫甲基酶4B（Lysine-specific demethylase 4B，KDM4B）和賴(lài)氨酸特異性脫甲基酶 4D（Lysine-specific demethylase 4D，KDM4D）mRNA并將其分別顯微注射至豬克隆胚胎，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)KDM4B可以顯著提高豬克隆胚胎的囊胚率。Zhang等［75］于2018年用重組人KDM4D蛋白對(duì)供體綿羊胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果顯示H3K9三甲基化和H3K9二甲基化水平均降低。Liu等［45］于2018年用TC在猴供體細(xì)胞中注射KDM4D mRNA并用組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹（Trichostatin A，TSA）處理，大大提高了代孕猴的胚泡發(fā)育和核移植胚胎的妊娠率。目前用HMC技術(shù)對(duì)供體細(xì)胞或胚胎進(jìn)行特異性去甲基化酶處理的研究甚少。眾多科研人員的研究為HMC克隆效率的提高提供了新思路。但目前沒(méi)有確切的數(shù)據(jù)能夠表明特異性去甲基化酶可以提高HMC胎兒出生率。表觀遺傳因子對(duì)HMC胚胎中的重編程的作用仍需研究。酶和H3K27去甲基化酶降低甲基化水平從而提高克隆效率。但是異常的表觀遺傳機(jī)制仍不明確，是目前研究HMC的存在問(wèn)題，今后需要科研人員對(duì)表觀遺傳的機(jī)制進(jìn)行不斷研究。另外，對(duì)于去甲基化酶的研究仍不夠深入，特異性去甲基化酶對(duì)供體細(xì)胞或胚胎的不同處理方式對(duì)HMC克隆效率的影響仍需今后對(duì)其進(jìn)行研究。通過(guò)克服HMC中存在的問(wèn)題和難題來(lái)更好地優(yōu)化HMC體系，提高HMC的克隆效率，更加廣泛地應(yīng)用到畜牧生產(chǎn)實(shí)踐中去，為家畜的品種改良及優(yōu)良品種的擴(kuò)繁提供技術(shù)支撐，為拯救瀕危物種鋪平了道路，還可以利用HMC結(jié)合基因編輯技術(shù)為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用于疾病模型和生物制藥、用于生產(chǎn)所需患者特異性干細(xì)胞再生療法中。

5 HMC的展望

相比TC，HMC在克隆過(guò)程中所需設(shè)備成本較低，操作較簡(jiǎn)單，需要掌握的專(zhuān)業(yè)知識(shí)較少，并且囊胚率和活產(chǎn)率較高。因此HMC得到不斷發(fā)展并克隆出多種動(dòng)物。目前HMC的操作技術(shù)方法已經(jīng)得到完善，但是克隆效率仍較低，另外使用異質(zhì)性細(xì)胞質(zhì)及透明帶的缺失可能會(huì)影響HMC胚胎生產(chǎn)效率，同時(shí)由于異常表觀遺傳重編程的存在，HMC的克隆效率相比體內(nèi)受精和體外受精較低。研究已發(fā)現(xiàn)H3K9甲基化和H3K27甲基化水平高是細(xì)胞重編程的主要障礙，并且可以通過(guò)添加H3K9去甲基化