林益平 吳美玲 魏艷麗 應(yīng)曉倩 裘穎兒 潘曉明 丁明星 唐紅娟 翁美貞

哮喘是一種常見的由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，具有可變氣道阻塞和支氣管高反應(yīng)性。臨床上，哮喘患者會(huì)反復(fù)出現(xiàn)喘息、咳嗽、胸悶和呼吸急促等癥狀[1]。慢性炎癥一直是該疾病的研究熱點(diǎn)，而近年來，有研究發(fā)現(xiàn)治療頑固性哮喘的無效性與氧化應(yīng)激有關(guān)，提示抗氧化在哮喘治療中具有重要意義[2]。核因子-E2相關(guān)因子（Nrf2）是一種氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，是氧化應(yīng)激和環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Nrf2缺陷小鼠對(duì)哮喘的易感性增加，包括氧化應(yīng)激、炎癥、黏液和氣道高反應(yīng)性（AHR），Nrf2的特異性激活可以顯著降低過敏原誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性及炎癥反應(yīng)，抑制輔助性T淋巴細(xì)胞2（Th2）類細(xì)胞因子分泌，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)和減輕氣道滲漏，增強(qiáng)上皮屏障功能[3-4]。漢防己甲素（Tet）主要從防己科千金藤屬植物粉防己塊莖中提取，是一種鈣通道阻滯劑，臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它對(duì)硅沉著病、高血壓、炎癥和肺癌有效，且毒性較小。Tet的藥理作用主要表現(xiàn)在抗氧化、增強(qiáng)細(xì)胞自噬、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥和鈣通道修飾等方面[5-6]。Tet不良反應(yīng)小，低濃度即具有較好的抗氧化作用，具有良好的應(yīng)用前景，但相關(guān)機(jī)制研究非常少。本研究擬建立卵蛋白（OVA）誘導(dǎo)大鼠哮喘模型，探討Tet對(duì)哮喘的治療效果及抗氧化機(jī)制，為Tet的臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 30只雄性SD大鼠，體重（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。Tet購(gòu)自浙江華潤(rùn)三九眾益制藥有限公司；谷胱甘肽（GSH）測(cè)定試劑盒（A061-1，48T）和 γ-谷氨酰半胱氨全成酶（γ-GCS）試劑盒（A091-1，100管/48樣）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司（4309155，1×5ml）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)MBI Fermentas公司（K1621，10次）；大鼠半胱氨酰白三烯（CysLT1）ELISA kit購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司（RDC0341，96T）；大鼠半胱氨酰白三烯受體（CysLTR1）ELISA kit購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司（CSB-EL006465RA，96T）；平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體（ab32575，40μl）、Nfr2 抗體（ab137550，50μl）與山羊抗兔單克隆抗體（ab205718，500μg）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司，D5100）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific公司，MULTISKAN MK3）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司，StepOne TM）。

1.2 模型建立及分組給藥 30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組和Tet治療組各10只。模型組和Tet治療組 1次/2d霧化吸入 1mg/ml OVA溶液30min，共8周。按照文獻(xiàn)[7]方法造模成功后，哮喘大鼠出現(xiàn)撓鼻，打噴嚏，喘息癥狀。Tet治療組用100mg/kg Tet灌胃處理，1次/d，共8周，對(duì)照組和模型組予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃處理，1次/d，共8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用1%戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠，剖開各組大鼠胸腔，取出肺臟，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液清洗。用于病理檢測(cè)的肺臟樣本在4%多聚甲醛中保存，其他實(shí)驗(yàn)所需的樣本在液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 肺組織病理切片檢查 肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，用乙醇梯度脫水、包埋、切片至4μm，采用HE染色、脫水、中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下拍照（200倍），觀察肺組織氣道壁和氣管周圍炎性細(xì)胞情況。

1.4 肺組織CysLT1和CysLTR1含量的檢測(cè) 采用ELISA法。稱取肺樣本（100mg）并在1ml含有蛋白酶抑制劑的組織蛋白提取試劑中勻漿，2 500r/min，低溫離心機(jī)（Eppendorf，5702R）離心 20min，獲得上清液。按照ELISA檢測(cè)試劑盒方法，在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl，溫育、洗滌、加酶，再次溫育和洗滌后顯色，加終止液終止反應(yīng)，空白調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值），以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品（即已知確切濃度的標(biāo)準(zhǔn)物品，作為含量測(cè)定中的標(biāo)準(zhǔn)含量）為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將樣品OD值代入，從而測(cè)定肺組織CysLT1和CysLTR1含量。

1.5 肺組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 采用分光光度法。大鼠肺組織稱重剪碎，在0.1M Tris-HCl（pH7.4）緩沖液中制備勻漿液，2 500r/min，低溫離心10min，取上清液待測(cè)。按照γ-GCS、氧化型谷胱甘肽（GSSG）及GSH等試劑盒說明書，于酶標(biāo)儀中分別測(cè)定每個(gè)指標(biāo)含量。根據(jù)GSH和GSSG檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算GSH/GSSG比值，比率下降情況反映脂質(zhì)過氧化損傷情況。

1.6 肺組織Nrf2、血紅素加氧酶-1（HO-1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）的 mRNA表達(dá)水平測(cè)定 采用qRT-PCR法。取大鼠肺組織，剪碎加入1ml TrizolTM試劑提取肺組織RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取cDNA產(chǎn)物2μl，加入SYBR Green Mix 12μl、上游引物和下游引物（見表1）各0.5μl，并加入雙蒸水（ddH2O），體系總體積為 20μl，進(jìn)行q-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：95℃ 5min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)；95℃ 15s，58℃ 15s，1 個(gè)循環(huán)。讀取各個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值，利用2-ΔΔCt法計(jì)算Nrf2、HO-1、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1 的 mRNA 表達(dá)水平。

表1 各qPCR引物序列

1.7 肺組織α-SMA和Nrf2蛋白表達(dá)情況檢測(cè) 采用免疫熒光染色法。將玻片在60°C的培養(yǎng)箱中干燥40min，二甲苯中脫蠟，乙醇梯度脫水。切片浸泡在0.3%檸檬酸鹽緩沖液中，微波爐加熱。再用3%過氧化氫去離子水處理，加 α-SMA（1∶200）和 Nrf2（1∶100）一抗，4°C過夜。加二抗37°C孵育 30min，PBS清洗 2次，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染。DAPI染色細(xì)胞核，覆蓋住樣品，室溫放置5～10min，0.9%氯化鈉溶液洗2～3次，每次3～5min，洗去DAPI。中性膠封片，用光學(xué)顯微鏡檢查。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肺組織病理檢查結(jié)果比較 對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，而模型組大鼠肺組織氣道壁增厚，并且氣管周圍可見炎細(xì)胞聚集；而Tet治療組較模型組肺組織氣道壁厚度減輕，并且炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況有所緩解，見圖 1（插頁）。

2.2 3組大鼠肺組織CysLT1和CysLTR1含量比較與對(duì)照組相比，模型組CysLT1和CysLTR1含量均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；而與模型組比較，Tet治療組肺組織CysLT1和CysLTR1含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表2。

表2 3組大鼠肺組織CysLT1與CysLTR1含量比較（mg/g）

2.3 3組大鼠肺組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較 與對(duì)照組相比，模型組肺組織γ-GCS活性明顯增加，GSH含量明顯下降，GSSG含量明顯增加，GSH/GSSG比值降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組相比，Tet治療組肺組織γ-GCS活性明顯降低，GSH含量明顯增加，GSSG含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表 3。

表3 3組大鼠肺組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較

2.4 3 組大鼠肺組織 Nrf2、HO-1、TGF-β1、MMP-9 和TIMP-1 mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，模型組肺組織 Nrf2、HO-1、TGF-β1、MMP-9 表達(dá)水平均明顯增加，TIMP-1 mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，Tet治療組肺組織Nrf2、HO-1、TIMP-1 mRNA 表達(dá)水平明顯增加，TGF-β1、MMP-9 mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.01），見表 4。

2.5 3組大鼠肺組織α-SMA和Nrf2免疫熒光染色結(jié)果比較 對(duì)照組大鼠肺組織α-SMA和Nrf2熒光呈現(xiàn)弱陽性，而模型組大鼠肺組織α-SMA和Nrf2的熒光呈強(qiáng)陽性表達(dá)；而Tet治療組較模型組肺組織α-SMA熒光強(qiáng)度有所減弱，Nrf2熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，見圖2（插頁）。

3 討論

哮喘是一種常見的呼吸道慢性炎癥性疾病，影響著全世界數(shù)百萬人。幾十年來，一直使用支氣管擴(kuò)張劑和皮質(zhì)類固醇治療哮喘，如吸入型糖皮質(zhì)激素，但對(duì)哮喘氣道重塑影響不大，且治療不良反應(yīng)較大。因此，近年來研究員致力于開發(fā)新的治療藥物。有研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素受體激動(dòng)劑對(duì)糖皮質(zhì)激素受體有選擇性作用，可顯著減少藥物不良反應(yīng)[8]。一些單克隆抗體如Dupilumab阻斷白細(xì)胞介素4（IL-4）和IL-13的信號(hào)傳導(dǎo)，可作為青少年和成人中重度哮喘的輔助治療，取得較好的效果[9]，但價(jià)格昂貴。用我國(guó)傳統(tǒng)中藥哮喘防治是一個(gè)新的思路，具有較大潛力，也愈來愈被國(guó)家和科研工作者重視。如平喘寧湯通過磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)（MTOR）信號(hào)通路抑制自噬現(xiàn)象而治療哮喘[10]，溫通湯促進(jìn)嗜酸細(xì)胞凋亡從而治療哮喘[11]。Tet在中國(guó)藥典中被廣泛引用，可用于治療高血壓、哮喘、肺結(jié)核、痢疾和癌癥等疾病，但其在哮喘治療中的作用機(jī)制依舊不明。

表4 3組大鼠肺組織Nrf2、HO-1、TGF-β1、MMP-9和TIMP-1 mRNA表達(dá)水平比較

目前抗哮喘機(jī)制的研究重點(diǎn)是阻止氣道炎癥反應(yīng)和緩解氣道重塑。本研究成功構(gòu)建了大鼠哮喘氣道重塑模型，各實(shí)驗(yàn)組肺組織病理學(xué)變化結(jié)果顯示，Tet能抑制炎細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕氣道壁厚度，說明大鼠哮喘模型構(gòu)建成功，且Tet具有較好的治療作用。CysLTs是由5-脂氧合酶途徑形成的促炎介質(zhì)，可誘發(fā)支氣管收縮、微血管滲漏、黏液分泌和氣道炎癥細(xì)胞募集增多，與多種類型的哮喘有關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組CysLT1和CysLTR1含量顯著增加，Tet治療顯著降低肺組織CysLT1和CysLTR1含量。α-SMA和TGF-β1均是氣道重塑的關(guān)鍵因子，參與血管和纖維生成，在慢性肺部疾病如哮喘中高表達(dá)[13-14]。MMPs可以分解細(xì)胞外基質(zhì)，其中MMP-9與氣道壁膠原沉積相關(guān)性最強(qiáng)，導(dǎo)致氣道重塑[15]。TIMPs是MMPs特異性抑制因子，能抑制氣道重塑。本研究顯示，模型組高表達(dá)α-SMA、TGF-β1、MMP-9，低表達(dá) TIMP-1。Tet能抑制 α-SMA、TGF-β1、MMP-9表達(dá)，增加TIMP-1表達(dá)。上述結(jié)果提示Tet通過抑制哮喘大鼠氣道重塑和炎癥，顯示出良好的抗哮喘效果。

關(guān)于導(dǎo)致氣道炎癥和氣道重塑機(jī)制，近年來人們逐漸認(rèn)識(shí)到氧化應(yīng)激可能起到重要作用。氧化與抗氧化之間的不平衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，被稱為氧化應(yīng)激。肺部持續(xù)地暴露在各種不同類型和程度的氧化劑中，導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞積累而促進(jìn)了哮喘的發(fā)生[16]。GSH是人類和其他哺乳動(dòng)物含有的一種主要非蛋白硫醇，GSH及其相關(guān)酶既能防止氧化損傷，又能解毒，是肺內(nèi)最主要的抗氧化物質(zhì)。在氧化應(yīng)激下，兩個(gè)GSH分子通過二硫化物橋連接形成GSSG[17]。因此，評(píng)估GSH/GSSG比值可以評(píng)估細(xì)胞氧化還原代謝情況。γ-GCS為合成GSH的限速酶。OVA誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)GSSG升高，GSH/GSSG比值下降，研究發(fā)現(xiàn)山茱萸能降低GSSG水平，升高GSH/GSSG比值[18]。補(bǔ)充硫化氫（H2S）或抑制一氧化氮合酶（iNOS）導(dǎo)致GSH/GSSG比值增加，保護(hù)氣道免受氧化應(yīng)激，可治療炎癥性肺病[19]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組肺組織GSH含量下降，GSSG含量增加，GSH/GSSG比值顯著降低，而γ-GCS活性增加，可能是哮喘發(fā)作過程導(dǎo)致氧化劑增加，GSH被過度消耗，反饋性使γ-GCS合成增加所致。經(jīng)過Tet治療后，肺組織GSH含量增加，GSSG含量降低，GSH/GSSG比值顯著增加，隨之γ-GCS也反饋性合成減少，提示Tet是通過抗氧化作用而發(fā)揮抗哮喘。

γ-GCS的合成是受轉(zhuǎn)錄因子Nrf2調(diào)控[20]，同時(shí)Nrf2也可以調(diào)節(jié)抗氧化因子HO-1的轉(zhuǎn)錄。研究顯示，有機(jī)粉塵會(huì)導(dǎo)致肺部炎癥、氣道高反應(yīng)性和氧化應(yīng)激。此過程N(yùn)rf2依賴基因和Nrf2核易位的mRNA表達(dá)水平增加[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組肺組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)均顯著增加，經(jīng)過Tet治療后，肺組織Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，筆者推測(cè)氧化應(yīng)激條件下，機(jī)體自身可能發(fā)生了適應(yīng)性反應(yīng)，藥物治療進(jìn)一步增強(qiáng)了機(jī)體抗氧化能力。

綜上所述，哮喘發(fā)作存在氧化應(yīng)激現(xiàn)象，Tet對(duì)哮喘大鼠肺組織具有保護(hù)作用。其治療機(jī)制可能為通過激活Nrf2/HO-1途徑下調(diào)氧化應(yīng)激水平，同時(shí)減少CysLT1和CysLTR1的含量而減輕炎癥，進(jìn)而抑制α-SMA、TGF-β1、MMP-9 的表達(dá)，增加 TIMP-1 的表達(dá)，緩解氣道重塑。

圖1 3組大鼠肺組織病理檢查所見（HE染色，×200）

圖2 3組大鼠肺組織α-SMA和Nrf2蛋白免疫熒光檢測(cè)所見