魏紅權(quán) 賴麗琴 劉珺 韓小于 王園園 潘慶

GOLPH3基因位于人染色體5P13上，是一個(gè)高度保守的33KDa蛋白，定位于高爾基體反面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1-2]，不僅能維持高爾基體扁平結(jié)構(gòu)，還參與將細(xì)胞表面受體和蛋白從內(nèi)體逆轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體反面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的過程，起到運(yùn)輸?shù)淖饔肹2-3]，Scott等[4]研究報(bào)道高爾基磷酸化蛋白 3（golgi phosphoprotein 3，GOLPH3）在癌中可以調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)途徑及增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)雷帕霉素的敏感性，首次提出GOLPH3是一個(gè)全新的致癌基因，并能通過mTOR信號(hào)系統(tǒng)促進(jìn)人類癌細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步探討GOLPH3基因?qū)ξ赴┘?xì)胞遷移與侵襲能力的影響及其機(jī)制，本研究運(yùn)用基因沉默的方法將GOLPH3-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胃癌BGC-823細(xì)胞，觀察GOLH3對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力及侵襲相關(guān)分子基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2和MMP-9分泌的影響，為胃癌的基因靶向治療提供新的策略和途徑。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，TotalRNA提取試劑盒購自日本Takara公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物，小鼠抗人GOLPH3抗體購自美國Proteinte公司，小鼠抗人MMP-2、MMP-9抗體購自美國SantaCruz公司，ECL發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司。GOLPH3-shRNA質(zhì)粒及陰性對(duì)照由上海吉瑪公司合成，見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組 人胃癌細(xì)胞BGC-823購自上海通派公司，飽和濕度，置于含有100U/ml青霉素、100g/ml鏈霉素、含20%小牛血清（FBS）的1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，接種到6孔板中（5×105/孔），待細(xì)胞貼壁后，按照Lipofectamine 2000試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4～6h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾載體的細(xì)胞，分為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染無關(guān)序列質(zhì)粒的NC-shRNA組）和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染3個(gè)目的基因質(zhì)粒，分別為GOLPH3-shRNA1組、GOLPH3-shRNA2組、GOLPH3-shRNA3組）。

1.2.2 轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞BGC-823中GOLPH3的mRNA和蛋白的檢測 （1）qRT-PCR法檢測GOLPH3的mRNA水平：采用MiniBEST通用RNA提取試劑盒提取總RNA，-80℃保存。使用帶有g(shù)DNA擦除器的Prime-ScriptRRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。用 SYBR Premix Ex Taq和Bio Rad CFX-96 PCR system進(jìn)行qRT-PCR分析。GOLPH3基因的引物序列上游：5′-CTCCAGAAACGGTCCAGAAC-3′，下游 5′-CCACCAGGTTTTTAGCTAATCG-3′，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 10min；94℃30s，56℃退火 30s，68℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)；以 2-ΔΔCt值表達(dá)目的基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本重復(fù)3次。（2）Western blot法檢測GOLPH3的蛋白水平：用預(yù)冷的PBS洗滌BGC-823細(xì)胞2次以上，加入100μl的RIPA細(xì)胞裂解液，4℃、12 000r/min離心15min，取上清液，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后，常規(guī)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量為50μg，轉(zhuǎn)膜、封閉后轉(zhuǎn)印至膜，加入小鼠抗人GOLPH3（工作濃度 1∶1 000）和 β-actin（工作濃度1∶2 000）作為一抗，4°C 孵育過夜后,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG（工作濃度1∶2 000）作為二抗，ECL化學(xué)發(fā)光，分析條帶的灰度值并與各自的內(nèi)參β-actin的比值來判斷目的蛋白的表達(dá)水平。并據(jù)此從GOLPH3-shRNA1組、GOLPH3-shRNA2組、GOLPH3-shRNA3組中選取對(duì)GOLPH3基因干擾效果最好一組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 轉(zhuǎn)染后BGC-823細(xì)胞遷移能力檢測 采用劃痕實(shí)驗(yàn)法。在6孔板上用DMEM（含10%FBS）培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞融合后，用移液器槍頭用力劃直線，PBS沖洗3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。0、24h分別采用Olympus IX50顯微鏡和Image-Pro Plus軟件捕獲和記錄細(xì)胞遷移的圖像，以遷移率表示細(xì)胞的遷移能力。遷移率=（劃痕后即刻劃痕面積—?jiǎng)澓酆?4h劃痕面積）/劃痕后即刻劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 轉(zhuǎn)染后BGC-823細(xì)胞的侵襲能力檢測 采用侵襲實(shí)驗(yàn)法。接種細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml，取細(xì)胞懸液200μl加入Transwell小室的上室內(nèi)，下室加入600μl FBS，在37℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。取出Transwell小室，棄去6孔板孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30min，膜下面用0.1%結(jié)晶紫染色20min。400倍顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，取平均數(shù)。每組重復(fù)3次，取平均值。

表1 GOLPH3-shRNA干擾序列

1.2.5 轉(zhuǎn)染后 BGC-823細(xì)胞 MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)水平檢測 采用qRT-PCR法。MMP-2基因的引物序列上游：5′-ATTCCGCTTCCAGGGCACAT-3′，下游5′-CACCTTCTGAGTTCCCACCAA-3′，MMP-9 基因的引物序列上游：5′-GTCCACCCTTGTGCTCTT-3′，下游5′-TGCCACCCGAGTGTAACCAT-3′。方法同 1.2.2。

1.2.6 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2和MMP-9活性檢測 采用明膠酶譜法。取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在無血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。次日收集上清液，將上清液移入離心管中2 000r/min離心10min，-80℃保存。樣品與上樣緩沖液按照3∶1混合后，在含有0.1%明膠的10%SDS-PAGE凝膠中行電泳分離，電泳結(jié)束后，將凝膠置于洗脫液中振蕩洗脫4次，每次15min，然后置于孵育液中37℃孵育24h，孵育結(jié)束后經(jīng)染色液染色及脫色液脫色后，顯示出MMP-2（Active-MMP-2或pro-MMP-2），MMP-9（Active-MMP-9 或 pro-MMP-9）為位于藍(lán)色背景上的透亮帶，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析讀取條帶面積，寬度和灰度值，做統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞GOLPH3 mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較與 NC-shRNA 組比較，GOLPH3-shRNA1、GOLPH3-shRNA2、GOLPH3-shRNA3組 GOLPH3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與 GOLPH3-shRNA1 組比較，GOLPH3-shRNA2、GOLPH3-shRNA3組GOLPH3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），因此選用GOLPH3-shRNA1組細(xì)胞株做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1、圖1。

2.2 兩組BGC-823細(xì)胞遷移能力的比較 劃痕后24h，GOLPH3-shRNA1組中細(xì)胞遷移率（13.20±2.00）%，明顯低于對(duì)NC-shRNA組（40.37±5.37）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 2（插頁）。

2.3 兩組BGC-823細(xì)胞侵襲能力的比較 GOLPH3-shRNA1組中細(xì)胞穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)（67.00±7.20）個(gè)，明顯比 NC-shRNA 組（110.00±9.50）個(gè)少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3（插頁）。

表1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中GOLPH3的mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較

圖1 4組細(xì)胞GOLPH3蛋白表達(dá)水平的電泳圖

2.4 各組細(xì)胞MMP2、MMP9 mRNA表達(dá)水平的比較GOLPH3-shRNA1組細(xì)胞中，MMP2、MMP9 mRNA表達(dá)水平分別為0.49±0.04和0.69±0.04，均低于NC-shRNA組1.00±0.08和1.00±0.04，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.5 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液 MMP-2和MMP-9活性的比較 與 NC-shRNA組相比，GOLPH3-shRNA1組Active-MMP-2、pro-MMP-9活性分別下降 44.2%和29.9%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-2和MMP-9活性的比較

3 討論

胃癌是全球第2大癌癥導(dǎo)致死亡的病因[5]，盡管胃癌治療包括手術(shù)和化療均取得了一些進(jìn)展，但胃癌患者的預(yù)后仍然較差，尤其是晚期患者，美國和歐洲的相對(duì)5年存活率是20%左右[6]。因此，尋找胃癌的新治療靶點(diǎn)和腫瘤發(fā)生機(jī)制具有重要的臨床意義。囊泡運(yùn)輸，特別是內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)，在癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[7]，內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)整的信號(hào)級(jí)聯(lián)和表面生長因子受體可能存在新的靶點(diǎn)。最近的研究表明，GOLPH3作為一種與高爾基體相關(guān)的內(nèi)吞蛋白，與囊泡形成、轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，在口腔、非小細(xì)胞肺癌，食道等多種癌癥中呈現(xiàn)高表達(dá)，具有致癌基因的作用[8-10]，以往的研究表明，胃癌患者血清中GOLPH3濃度顯著高于健康人，胃癌組織中GOLPH3的高表達(dá)與腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11-12]。因此本研究旨在進(jìn)一步研究GOLPH3基因?qū)ξ赴┘?xì)胞的侵襲、遷移的影響，GOLPH3-shRNA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC-823后，qRT-PCR和Western blot法檢測結(jié)果顯示GOLPH3 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于NC-shRNA組細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。劃痕實(shí)驗(yàn)表明，GOLPH3-shRNA1組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)愈合劃痕的比例，明顯低于NC-shRNA組，侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GOLPH3-shRNA1組細(xì)胞穿過膜的細(xì)胞數(shù)量，明顯少于NC-shRNA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明沉默GOLPH3基因，能使胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低。

GOLPH3能通過mTOR信號(hào)系統(tǒng)促進(jìn)人類癌細(xì)胞增殖[4]，而已有研究表明，在多種腫瘤中通過增加PI3K/Akt/mTOR活性可上調(diào)幾種MMPs的表達(dá)[13-14]，MMPs是一種螯合了鋅離子的蛋白酶類，主要功能是降解各種類型的膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)成分，因此MMPs在腫瘤新生血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色[15-16]，其中，MMP-2和MMP-9在癌癥轉(zhuǎn)移起著至關(guān)重要的作用[16]，因此筆者假設(shè)，GOLPH3能夠通過調(diào)節(jié)MMP-2或MMP-9，來影響腫瘤細(xì)胞的浸潤與轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GOLPH3-shRNA1組中，MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)水平，均低于NC-shRNA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，明膠酶譜實(shí)驗(yàn)表明GOLPH3-shRNA1組中Active-MMP-2、pro-MMP-9的活性也明顯低于對(duì)照組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果證實(shí)了筆者的假設(shè)，GOLPH3很可能通過增加MMP-2和MMP-9的表達(dá)與活性，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移與侵襲，具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

本研究結(jié)果表明，GOLPH3-shRNA1可以特異性沉默BGC-823細(xì)胞中GOLPH3的表達(dá)，并降低MMP-2與MMP-9的表達(dá)及活性，有效地抑制該細(xì)胞的遷移和侵襲，今后筆者將進(jìn)一步研究他的調(diào)控機(jī)制，為胃癌發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的線索。

圖2 轉(zhuǎn)染GOLPH3-shRNA1后BGC-823細(xì)胞遷移能力的比較

圖3 兩組BGC-823細(xì)胞侵襲能力顯微鏡下所見（×400）