田國(guó)燕 顧磊 楊勁

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fattty liver disease,NAFLD）疾病譜包括單純性脂肪肝（nonalcoholic simple fatty liver,NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,NASH）以及相關(guān)的肝纖維化/肝硬化和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）等[1]。近年來(lái)，NAFLD已成為歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家HCC的主要病因，高達(dá)58.5%[2]。在我國(guó)平均隨訪6、7年的NAFLD臨床研究中發(fā)現(xiàn) 7.8‰（3/383）患者進(jìn)展為 HCC[3]。在NAFLD整個(gè)疾病自然進(jìn)程中，NASH是NAFL發(fā)展為HCC的限速步驟，有更高的肝癌罹患率，因此加強(qiáng)對(duì)NASH相關(guān)HCC（NASH-HCC）發(fā)病機(jī)制及干預(yù)措施研究具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。白藜蘆醇（resveratrol,RSV）作為一種中藥虎杖提取物，具有抗脂肪變、抗炎、抗纖維化、保護(hù)心血管和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，能改善高脂飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟脂肪變[4]，降低老年NASH小鼠肝臟炎癥因子的表達(dá)，減輕肝纖維化[5]，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[6]等。但具體機(jī)制尚不完全清楚。膽汁酸作為信號(hào)分子在調(diào)控能量平衡、炎癥及腫瘤中起重要作用[7]。研究表明RES能夠減少肝內(nèi)膽固醇的淤積和增加膽汁酸池的大小，通過(guò)增加膽固醇7-羥化酶（CYP7A1）的表達(dá)促進(jìn)肝臟膽汁酸合成，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成，但具體作用機(jī)制還不十分清楚[8]。本研究旨在探究白藜蘆醇對(duì)NASH-HCC模型小鼠的治療作用及分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料 8周齡SPF級(jí)C57BL/6J雌雄小鼠共24只，體重（20±2）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2016-0011。白藜蘆醇（北京欣熙源生物科技有限公司，貨號(hào)R21350），溶媒：0.9%氯化鈉溶液，鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：S0130，規(guī)格 100mg）；油紅 O 染色液（珠海Baso 公司，貨號(hào)：BA4081，規(guī)格：100mg）；TRIZOL 試劑（美國(guó)Ambion公司，貨號(hào)：15596-026）；膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Steraloids公司和加拿大TRC Chemicals公司）。日立7180全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司），7900HT型熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystem公司），超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 1雄2雌配籠生育小鼠，出生后第4天的小鼠每只背部皮下注射STZ 200μg，4周齡時(shí)選取雄性小鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為STZ+普通飼料組、STZ+高脂高膽固醇飼料（high fat and high cholesterol,HFHC）組和STZ+HFHC+RSV組3組，每組10只。STZ+HFHC+RSV組按400mg/kg灌胃，1次/d，STZ+普通飼料組和STZ+HFHC組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，自由飲用高壓滅菌水。飼料：（1）普通飼料；（2）高脂高膽固醇（high fat and high cholesterol,HFHC）飼料（貨號(hào)：D12079B，美國(guó) Research Diet公司），具體配方為：20%蛋白質(zhì)、50%碳水化合物、21%脂肪和0.21%膽固醇。

1.2.2 小鼠處死及標(biāo)本采集 于16周齡時(shí)稱體重（BW），取血以備血清生化指標(biāo)和膽汁酸檢測(cè)，脫臼處死取肝組織，稱肝臟濕重，并計(jì)算肝指數(shù)（Liver Index），肝指數(shù)=肝重/體重×100%。

1.2.3 血清生化指標(biāo)測(cè)定 摘取小鼠眼球取血，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中空腹血糖（FPG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）等生化指標(biāo)。

1.2.4 肝組織腫瘤壞死因子（TNF）-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、I型膠原蛋白（Collagen Type I）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3（GPC3）及膽汁酸受體法尼醇X受體（FXR）、小異二聚體伴侶（SHP）和膽汁酸鹽輸出泵（BSEP）mRNA表達(dá)水平測(cè)定 采用RT-PCR法。取大約100mg肝組織，加入1ml TRIZOL，研磨，12 000r/min、4℃離心 5min，提取總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，ABI prism 7900 HT熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以2-ΔΔCt表示mRNA的相對(duì)水平，引物序列為：TNF-α 上游引物 3′-AAGGGAGAGTGGTCAGG-5′，下游引物 3′-TCTGTGAGGAAGGCT-5′；MCP-1 上游引物 3′-TCCCAATGAGTAGGCTG-5′， 下 游 引 物 3′-TCTGGACCCATTC-5′；Collagen Type I 上游引物 3′-ACCTGTGTGTTCCCTAC-5′， 下 游 引 物 3′-GACTGTTGCCTTCGCCT-5′；GPC3 上游引物 3′-CCAGATCATTGACAA-5′，下游引物 3′-CGCAGTCTCCACTT-5′；FXR 上游引物 3′-CAAAATGACTCAGGAG-5′，下游引物 3′-GCCTCTCTGTCCTTGATGT-5′；SHP 上游引物 3′-TCTCTTCTTCCGCCCT-5′，下游引物 3′-AAGGGCTTGCTGGAC-5′；BSEP 上游引物 3′-AAGCTACATCTGCCTTAG-5′，下游引物 3′-CAATACAGGTCCGACCCTCTCT-5′。

1.2.5 血清膽汁酸含量測(cè)定 移取20μl小鼠外周血清樣本，加入180μl膽汁酸氘代內(nèi)標(biāo)的預(yù)冷乙腈甲醇的混合溶液進(jìn)行膽汁酸的提取，采用Waters超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)鵝去氧膽酸（CDCA）、去氧膽酸（DCA）、?；?β 鼠膽酸（TβMCA）、甘氨膽酸（GCA）、膽酸（CA）、?；悄懰幔═CA）、?；蛆Z去氧膽酸（TCDCA）、牛磺石膽酸（TLCA）、石膽酸（LCA）等膽汁酸及總膽汁酸（Totol BA）定量的絕對(duì)濃度。

1.2.6 肝組織病理學(xué)觀察 分離肝臟，觀察肝臟大體，固定、脫水、石蠟包埋，HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肝臟病理改變，參照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院NAFLD臨床研究網(wǎng)病理工作組指南，進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度積分（NAS）評(píng)分[9]，見(jiàn)表1；制作冰凍切片，油紅O染色后觀察肝臟脂滴含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠體重、肝指數(shù)及生化指標(biāo)的比較 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，STZ+HFHC+RSV組死亡2只，STZ+HFHC組死亡1只，STZ+普通飼料組無(wú)死亡，故每組各選取8只小鼠進(jìn)行檢測(cè)比較。STZ+HFHC組肝指數(shù)、AST、HDL、LDL和TC較STZ+普通飼料組均明顯升高（均P＜0.05）；STZ+HFHC+RSV 組肝指數(shù)、FPG、ALT、AST、HDL、LDL、TC 和TG較STZ+HFHC組均明顯下降（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 NAS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.2 3 組小鼠肝組織 TNF-α、MCP-1、Collagen Type I、TGF-β和GPC3 mRNA表達(dá)水平的比較 STZ+HFHC組 TNF-α、MCP-1、Collagen Type I、TGF-β 和 GPC3 mRNA表達(dá)較STZ+普通飼料組均明顯增加（均P＜0.05）；STZ+HFHC+RSV 組 MCP-1、Collagen Type I、TGF-β和GPC3 mRNA表達(dá)水平較STZ+HFHC組均明顯下降（均 P＜0.05），見(jiàn)表 3。

2.3 3組小鼠血清膽汁酸含量的比較 選取STZ+HFHC+RSV組5只，STZ+HFHC組6只，STZ+普通飼料組5只小鼠進(jìn)行血清膽汁酸含量的檢測(cè)。與STZ+普通飼料組比較，STZ+HFHC 組 Totol BA 、CDCA、DCA、TβMCA 均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與STZ+HFHC 組比較，STZ+HFHC+RSV 組 Totol BA、CDCA、DCA、TβMCA、GCA、CA、TCA、TCDCA、TLCA 均明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表4。

表2 3組小鼠體重、肝指數(shù)及生化指標(biāo)的比較

表3 3組小鼠肝組織TNF-α、MCP-1、Collagen Type I、TGF-β和GPC3 mRNA表達(dá)水平的比較

表4 3組小鼠血清膽汁酸含量的比較（ng/L）

2.4 3組小鼠肝組織膽汁酸受體及下游靶基因FXR、SHP和BSEP mRNA表達(dá)水平的比較 STZ+HFHC組FXR mRNA表達(dá)水平較STZ+普通飼料組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；STZ+HFHC+RSV組FXR、SHP和BSEP mRNA表達(dá)水平較STZ+HFHC組均明顯上升（均 P＜0.01）；并且 STZ+HFHC+RSV組 FXR較STZ+普通飼料組有顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)表5。

表5 3組肝組織FXR、SHP和BSEP mRNA表達(dá)水平的比較

2.5 3組小鼠肝組織病理變化 肝臟外觀：STZ+普通飼料組小鼠肝臟顏色暗紅，質(zhì)地柔軟，表面光滑無(wú)贅生物；STZ+HFHC組出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)的肝臟顏色暗紅，體積較STZ+普通飼料組稍微偏大，部分呈黃色，質(zhì)韌，表面出現(xiàn)白色顆粒狀物；STZ+HFHC+RSV組較STZ+普通飼料組肝臟顏色略黃、體積較大，質(zhì)地介于STZ+普通飼料組和STZ+HFHC組之間，肝臟表面有少量白色顆粒狀物，均未出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)。HE染色：STZ+普通飼料組肝細(xì)胞形態(tài)正常；STZ+HFHC組細(xì)胞體積增大，出現(xiàn)了竇周纖維化、核異常、異型增生結(jié)節(jié)及早期肝癌，脂肪變、小葉內(nèi)炎癥及NAS評(píng)分較STZ+普通飼料組明顯升高（P＜0.05）；STZ+HFHC+RSV組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)核異常、異型增生結(jié)節(jié)和肝癌，脂肪變、NAS評(píng)分較STZ+HFHC組明顯下降（P＜0.05）。油紅O染色：油紅O染色顯示STZ+普通飼料組小鼠肝臟無(wú)染色，STZ+HFHC組染色陽(yáng)性，STZ+HFHC+RSV組染色面積、強(qiáng)度較STZ+HFHC組減輕，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）及表6。

表6 3組肝組織脂肪變、小葉炎癥、氣球樣變及NAS評(píng)分的比較

3 討論

筆者采用HFHC聯(lián)合STZ誘導(dǎo)C57BL/6J雄性小鼠，肝臟病理形態(tài)出現(xiàn)了脂肪變（NAFL）、炎癥（NASH）、纖維化（fibrosis）及腫瘤（HCC），提示 NASH-HCC 造模成功。與有關(guān)報(bào)道中的NASH-HCC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[10]比較成功率更高，造模時(shí)間更短，并且進(jìn)一步證實(shí)了NASH-HCC是遺傳與環(huán)境共同作用的結(jié)果。RSV廣泛存在于中草藥（如虎杖等）及食用植物（花生、葡萄等）中，具有多種藥理活性，在改善糖尿病、脂肪肝等代謝綜合征領(lǐng)域以及肝纖維化、肝癌等方面發(fā)揮重要作用。第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品安全研究中心人員研究發(fā)現(xiàn)RSV可通過(guò)上調(diào)高脂喂養(yǎng)大鼠肝內(nèi)pAMPK與SIRT1和下調(diào)SREBP-1c表達(dá)與轉(zhuǎn)錄活性，從而預(yù)防NASH的發(fā)生[11]。Nishikawa等[4]報(bào)道RSV能改善高脂飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟脂肪變，降低老年小鼠肝臟中前炎癥因子IL-1β、IL-6及 TNF-α水平。Kessoku等[12]研究發(fā)現(xiàn)RSV能減輕NASH小鼠炎癥和纖維化。RSV還具有抗腫瘤作用，能通過(guò)阻滯多種前炎癥反應(yīng)信號(hào)通路的分子表達(dá)，降低細(xì)胞COX-2活性和前列腺素R產(chǎn)生，抑制iNOS表達(dá)和活性，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[13]。由此可以看出RSV對(duì)NASH-HCC進(jìn)程中的起始、促進(jìn)及發(fā)展階段都有明顯抑制作用。本研究結(jié)果顯示，RSV能夠顯著改善模型小鼠肝癌早期脂肪變、炎癥及纖維化，降低血糖、TG、肝指數(shù)，改善肝功能，減少HCC發(fā)病率。

目前，越來(lái)越多的研究證實(shí)膽汁酸在調(diào)控脂肪、糖、能量等代謝性疾病及腫瘤中扮演著重要的角色。研究發(fā)現(xiàn) GCA、TCA、GCDCA、TCDCA、GDCA、DCA 和 TDCA均與胃腸道腫瘤密切相關(guān)[14]。Ferslew等[15]發(fā)現(xiàn)NASH患者血清總膽汁酸/結(jié)合膽汁酸比值呈顯著上升趨勢(shì)。肥胖和糖尿病人中多數(shù)可以檢測(cè)到異常升高的膽汁酸，尤其是疏水性次級(jí)膽汁酸如DCA和LCA。TβMCA在一定程度上可以誘導(dǎo)肥胖和肝脂肪變性，并且影響葡萄糖和胰島素耐受性，以及與之有關(guān)的肝腫瘤[16]。疏水性次級(jí)膽汁酸可以引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致DNA損傷，線粒體功能紊亂、細(xì)胞膜完整性破壞，最終致肝細(xì)胞癌變[17]。TLCA可損害膽汁酸流出通道導(dǎo)致膽汁淤積癥[18]。TCA下調(diào)葡萄糖異生基因的表達(dá)，誘導(dǎo)肝細(xì)胞炎性因子的產(chǎn)生[19]。CDCA可以誘導(dǎo)Snail基因的表達(dá)，抑制E-鈣粘蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)肝腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。用DCA處理DEN的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)DCA具有強(qiáng)烈的促進(jìn)肝腫瘤形成的作用。TCDCA、GCDCA、GCA和DCA具有明顯細(xì)胞毒作用，可以引起正常肝細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞死亡[20]。DCA和CDCA可通過(guò)溶解細(xì)胞膜造成肝組織損傷，從而誘導(dǎo)肝癌發(fā)生[21]。有文獻(xiàn)報(bào)道DCA、TDCA、GCA、TCDCA、TCA、TLCA 及總膽汁酸在肝內(nèi)積累增加肝臟毒性，導(dǎo)致NASH-HCC的發(fā)生發(fā)展，并在體外采用人肝癌細(xì)胞HepG2經(jīng)過(guò)油酸和高糖處理細(xì)胞模擬高脂高糖環(huán)境，予以DCA、CA、TCDCA等進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn) HepG2腫瘤細(xì)胞大量增殖，DCA、LCA、CA和TCDCA增加了癌基因c-myc蛋白表達(dá)，TCDCA則明顯抑制了抑癌基因CEBPα的表達(dá)，這一結(jié)果充分證實(shí)高脂可以誘導(dǎo)多種肝細(xì)胞毒性膽汁酸成分在肝內(nèi)淤積導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，從而促進(jìn)肝癌的形成[22]。本研究結(jié)果顯示RSV干預(yù)NASH-HCC小鼠后多種致癌膽汁酸DCA、GCA、TCA、TβMCA、TCDCA、CDCA、CA、TLCA 及總膽汁酸水平顯著下降，肝損傷明顯減少，肝臟炎性因子和腫瘤因子水平也得到明顯改善，HCC發(fā)病率降低。

內(nèi)源性膽汁酸的代謝自穩(wěn)依賴于其作用的受體，其中FXR在膽汁酸的合成、分泌和重吸收方面具有極為關(guān)鍵的作用[23]。Guo等[24]發(fā)現(xiàn)FXR在預(yù)防HCC中具有重要作用。敲除FXR15個(gè)月的C57小鼠會(huì)自發(fā)形成肝癌，而且并發(fā)嚴(yán)重的膽汁淤積現(xiàn)象，說(shuō)明FXR缺失可能是誘導(dǎo)肝臟慢性疾病以及肝癌發(fā)生的重要原因之一。SHP是FXR最主要的下游基因。膽汁酸合成的負(fù)反饋調(diào)節(jié)是通過(guò)膽汁酸受體FXR和SHP的級(jí)聯(lián)行動(dòng)調(diào)控完成的[25]。肝細(xì)胞膜上BSEP是肝臟中主要承擔(dān)膽汁酸分泌和排泄的轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，是FXR主要的靶基因。BSEP正常表達(dá)和功能發(fā)揮對(duì)于膽汁酸的肝臟排泄至關(guān)重要。SHP也參與BSEP調(diào)節(jié)。當(dāng)肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸過(guò)高，激活FXR，F(xiàn)XR通過(guò)誘導(dǎo)SHP表達(dá)的增加，與BSEP啟動(dòng)子近端的IR-1（反向重復(fù)的AGGTTCA六聚體）元件結(jié)合，誘導(dǎo)BSEP表達(dá)，促進(jìn)膽汁酸流出肝臟，使肝細(xì)胞避免膽汁酸超負(fù)荷所引發(fā)的組織損傷[26]，如果FXR/SHP受到抑制，不能誘導(dǎo)BSEP正常表達(dá)，則導(dǎo)致膽汁酸在肝內(nèi)的累積增加肝細(xì)胞毒性。

膽汁酸能夠直接結(jié)合在FXR上抑制或促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促進(jìn)或抑制炎癥及腫瘤的進(jìn)展[27]。Jiang等[28]研究發(fā)現(xiàn)增加TCA水平能顯著抑制FXR受體。另有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)游離膽汁酸CDCA、DCA及CA可以增加FXR表達(dá)，結(jié)合膽汁酸GCA和TCA則可以下調(diào)FXR的表達(dá)。TβMCA是一種內(nèi)源性的FXR受體強(qiáng)力拮抗劑，能夠顯著抑制FXR表達(dá)。另一方面，升高的膽汁酸刺激Kupffer細(xì)胞引起促炎細(xì)胞因子水平升高，激活的NF-κB抑制了肝內(nèi)FXR受體[29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示STZ+HFHC組FXR、SHP和BSEP mRNA表達(dá)下降，可能是結(jié)合膽汁酸與游離膽汁酸的效應(yīng)平衡被打破，結(jié)合膽汁酸對(duì)FXR表達(dá)抑制效應(yīng)顯著，游離膽汁酸對(duì)促進(jìn)FXR表達(dá)效應(yīng)較弱，使FXR受體抑制，從而不能維持肝內(nèi)膽汁酸穩(wěn)態(tài)平衡，F(xiàn)XR下調(diào)使得靶基因SHP和BSEP表達(dá)下降，導(dǎo)致具有細(xì)胞毒性的膽汁酸不能有效排泄，引起膽汁酸的肝內(nèi)堆積，從而導(dǎo)致正常肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)腫瘤形成。通過(guò)RSV干預(yù)降低了膽汁酸組分，使得膽汁酸受體FXR及下游靶基因SHP和BSEP水平升高，促進(jìn)肝內(nèi)膽汁酸正常排泄，減少膽汁酸淤積對(duì)肝細(xì)胞的損傷從而降低腫瘤發(fā)生率。

綜上，筆者通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)RSV可通過(guò)調(diào)控膽汁酸代謝譜，激活膽汁酸受體，促進(jìn)膽汁酸在肝內(nèi)的排泄，進(jìn)而減少NASH-HCC發(fā)生，RSV有望成為治療NASH相關(guān)HCC的有效手段。

圖1 3組小鼠肝組織外觀及病理學(xué)檢查所見(jiàn)（×100）