任 瑩，何 喻，叢玲華

(寧波市鄞州人民醫(yī)院 病理科，浙江 寧波 315000)

圖1 血清外泌體miR-184的相對表達(dá)量分析

圖2 血清外泌體miR-184診斷甲狀腺乳頭狀癌的ROC曲線圖

甲狀腺乳頭狀癌為甲狀腺癌常見的一種組織學(xué)分型，臨床治療以手術(shù)切除為主，患者一般預(yù)后良好，但對于出現(xiàn)被膜侵犯或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，預(yù)后較差[1]。因此，探尋甲狀腺乳頭狀癌早期診療生物學(xué)標(biāo)記物尤為重要。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼小RNA，長度約為20～23個(gè)核苷酸，其參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。miRNA通過外泌體介導(dǎo)在機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)中穩(wěn)定運(yùn)轉(zhuǎn)，由于不同腫瘤中miRNA表達(dá)不同，且具有較高的特異性，推測外泌體miRNA亦可作為腫瘤生物學(xué)標(biāo)記物[3]。因此，本研究對比分析了甲狀腺乳頭狀癌患者、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者及體檢健康者血清外泌體中miR-184的表達(dá)，探討其診斷甲狀腺乳頭狀癌的臨床價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 對象 2017年3月—2019年3月我院收治的甲狀腺乳頭狀癌患者410例，均經(jīng)手術(shù)病理確診，排除合并其他惡性腫瘤者及嚴(yán)重心肝腎功能不全者。其中男性187例，女性223例；年齡19～57歲，平均(41.93±3.07)歲。另選取同期就診的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者100例、體檢健康者100例作為對照。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組：男性44例，女性56例；年齡21～62歲，平均(42.77±2.95)歲。體檢健康組：男性39例，女性61例；年齡17～59歲，平均(40.86±2.54)歲。3組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲醫(yī)院倫理學(xué)委員會審批，入組對象均知情同意。

1.2 血清外泌體miR-184檢測

1.2.1 標(biāo)本采集 采集3組空腹靜脈血5～8 mL，甲狀腺乳頭狀癌組和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組患者于術(shù)前采集，對照組于體檢當(dāng)日采集，經(jīng)離心處理后取上清液存于-80 ℃冰箱中備檢，整個(gè)過程避免溶血。

1.2.2 檢測方法 按照ExoQuick-TM試劑盒(生產(chǎn)廠家：美國SBI公司)操作說明提取血清外泌體樣品，經(jīng)染色后置于日本電子公司生產(chǎn)的tem-100cxⅡ型透射電子顯微鏡下觀察顆粒形態(tài)，采用Western Blot檢測外泌體表面蛋白標(biāo)志物，采用Nanosight檢測外泌體顆粒濃度。應(yīng)用美國Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol試劑將外泌體樣品進(jìn)行裂解，將提取的外泌體中總RNA經(jīng)純化后行逆轉(zhuǎn)錄，采用Sybr Green法檢測外泌體中miR-184，應(yīng)用相對定量法計(jì)算外泌體中miR-184的相對表達(dá)量，根據(jù)公式2-ΔCt值= 2-ΔCt值(miR-184)- 2-ΔCt值(miR-39)，miR-39為外參基因。

2 結(jié)果

2.1 各組血清外泌體miR-184的相對表達(dá)量比較 經(jīng)電鏡觀察、Nanosight及Western Blot檢測，發(fā)現(xiàn)純化的樣品中含有大量外泌體顆粒，與已往文獻(xiàn)報(bào)道的外泌體特征相符。本研究顯示，甲狀腺乳頭狀癌組、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組及體檢健康組患者血清外泌體miR-184的相對表達(dá)量分別為(1.24±0.37)、(0.91±0.19)、(0.68±0.22)，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，甲狀腺乳頭狀癌患者血清中的外泌體miR-184表達(dá)量最高。見圖1。

2.2 ROC曲線分析 以血清外泌體miR-184的相對表達(dá)量作檢驗(yàn)變量，以是否形成甲狀腺乳頭狀癌為狀態(tài)變量作ROC曲線。結(jié)果顯示，血清外泌體miR-184診斷甲狀腺乳頭狀癌的敏感性為91.70%，特異性為82.45%，約登指數(shù)為0.748，其曲線下面積為0.829(95%CI：0.704～1.032)，見圖2。

3 討論

miRNA為近年發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性小RNA，主要以單拷貝、多拷貝或基因簇等形式存在，其在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)[4]。近年來，隨著分子生物學(xué)機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn) miRNA與多種腫瘤的發(fā)生進(jìn)展存在相關(guān)性[5]。miR-184為miRNA家族重要的成員之一，既往研究顯示，miR-184在腎癌[6]、人腦膠質(zhì)瘤[7]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。但此類研究大多基于腫瘤組織，收集miRNA檢測樣本時(shí)需行有創(chuàng)手術(shù)或活檢穿刺，不便于臨床對于甲狀腺乳頭狀癌的篩查。有資料顯示，外周血miRNA可作為腫瘤診斷標(biāo)記物，且樣本采集方式簡單無創(chuàng)。郭輝等[8]研究報(bào)道，甲狀腺乳頭狀癌患者血清中miR-214的表達(dá)高于良性甲狀腺腫瘤患者，提示血清miRNA可作為甲狀腺乳頭狀癌的診斷標(biāo)記物。

最近有學(xué)者提出，miRNA可穩(wěn)定存在于血清外泌體內(nèi)，采用血清外泌體miRNA作為腫瘤診斷標(biāo)記物更加可靠，可避免因血清成分復(fù)雜而影響miRNA檢測結(jié)果[9]。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌患者血清中外泌體miR-184的相對表達(dá)量顯著高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫者及體檢健康者。提示，高表達(dá)的miR-184可能與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生存在一定關(guān)系。進(jìn)一步采用ROC曲線分析血清外泌體miR-184診斷甲狀腺乳頭狀癌的臨床價(jià)值，發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-184診斷甲狀腺乳頭狀癌的敏感性為91.70%，特異性為82.45%，約登指數(shù)為0.748，其曲線下面積為0.829(95%CI：0.704～1.032)。提示，血清外泌體miR-184對甲狀腺乳頭狀癌診斷

效能較高。顏曉慧等[10]對94例肺癌患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-21診斷效能較高，有望成為肺癌早期診斷標(biāo)志物。張?jiān)频萚11]對82例原發(fā)性肝癌患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)血清外泌體miRNA-122可用于原發(fā)性肝癌的早期臨床診斷。以上研究表明，血清外泌體miRNA與多種惡性腫瘤存在相關(guān)性，有望成為臨床惡性腫瘤診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀癌患者血清外泌體中miR-184呈高表達(dá)，其診斷敏感性及特異性較高，或?qū)⒊蔀榧谞钕偃轭^狀癌的臨床診斷生物學(xué)標(biāo)志物。